Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Levedygtighed Analyser for celler i kultur

Published: January 20, 2014 doi: 10.3791/50645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Pharmaceutical Sciences, Mylan School of Pharmacy, Duquesne University

Summary

Terapeutiske forbindelser ofte først undersøgt in vitro med rentabilitet analyser. Blind celletal ved en menneskelig observatør kan være meget følsomme over for små ændringer i celle nummer, men ikke vurdere funktion. Edb levedygtighed assays, som beskrevet her, kan vurdere både struktur og funktion på en objektiv måde.

Abstract

Manuelle celletal på et mikroskop er en følsom middel til at vurdere cellulær levedygtighed, men er tidskrævende og derfor dyrt. Edb levedygtighed assays er dyre i form af udstyr, men kan være hurtigere og mere objektiv end manuelle celletallet. Nærværende rapport beskriver brugen af ​​tre sådanne levedygtighed assays. To af disse assays er infrarød og en er selvlysende. Begge infrarøde analyser stole på en 16 bit Odyssey Imager. En infrarød analyse bruger DRAQ5 pletten for kerner kombineret med Sapphire pletten for cytosol og visualiseres i 700 nm-kanal. Den anden infrarød analyse, en In-Cell Western anvender antistoffer mod cytoskeletale proteiner (α-tubulin eller mikrotubulus-associeret protein 2) og etiketter dem i 800 nm kanal. Den tredje levedygtighedsassay er et almindeligt anvendt selvlysende assay for ATP, men vi bruger en fjerdedel af den anbefalede mængde for at spare på omkostningerne. Disse målinger er alle lineære og korrelerer med antallet af ceLLS forgyldt, men varierer i følsomhed. Alle tre analyser omgå tidskrævende mikroskopi og prøve hele godt, og derved reducere fejlprocenten. Endelig alle analyserne kan nemt være afsluttet inden for en dag i slutningen af ​​forsøget, så et større antal forsøg, der skal udføres inden for korte tidsrammer. Men de alle afhængige af den antagelse, at celleantal forbliver i forhold til signalstyrken efter behandlinger, en antagelse, der undertiden ikke er opfyldt, især for cellulær ATP. Desuden, hvis celler forøge eller formindske i størrelse efter behandling, dette kan påvirke signalstyrken uden at påvirke celle nummer. Vi konkluderer, at alle levedygtighed assays, herunder manuelle optællinger, lider af en række forbehold, men at edb levedygtighed assays er værd den oprindelige investering. Med alle tre analyser sammen giver et samlet overblik over cellulær struktur og funktion.

Introduction

Den mest almindelige levedygtighedsassay i de biologiske videnskaber indebærer celletallet. Dette fremgår af en analyse af de øverste (nyeste) 200 publikationer, der dukkede op i PubMed med enten af nøgleordene "in vitro" eller "kultur" på 2013/04/29 og 2013/04/30. Af disse publikationer, 23,5% anvendes celletalsdata assays, herunder manuelle celle nummer tæller, automatiseret celle nummer tæller med imaging software, og trypanblåteksklusion. Live / Dead assay blev brugt i 1% af disse publikationer. Antallet af publikationer ved hjælp af MTT (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-assay for metabolisk levedygtighed var 11%. Denne undersøgelse af litteraturen viser også, at antallet af publikationer ved hjælp af assays, såsom MTT, sammenholdt med celletal assays var kun 3,5%. På trods af tendensen til at bruge en levedygtighedsassay af sig selv, vurdere cellulære funktion i kombination med celletal synes det bedste valg til at vurdere cellulær jegntegrity. Celletællinger i sig selv ikke er tilstrækkelig, da de resterende celler ikke kan være funktionel eller raske, selvom de er til stede i brønden 1,2. Omvendt kan funktionelle foranstaltninger såsom ATP forøge eller formindske i mangel af parallelle ændringer i antallet af celler. Den afkobling af metaboliske udlæsninger fra celle nummer tyder på, at ATP og MTT-assays aldrig bør anvendes som den eneste levedygtighedsassay. I nærværende rapport er der tre levedygtighed assays denne undersøgelse både cellulære strukturer og stofskiftet beskrevet, for en mere omfattende billede af cellulær integritet end nogen analyse af sig selv har råd til.

To af vores analyser kræver en infrarød kamera, der måler fluorescens i de 700 og 800 nm kanaler. Støj er lav i de infrarøde bølgelængder, hvilket fører til højere signal-til-støj-forhold 3. Odyssey imager, som vi bruger, har en 4,5 log dynamikområde og en bit-dybde på 16, translating til 2 16 eller 65.536 nuancer af infrarød. Dette kan sammenholdes med 8-bit farve billedbehandling, som kun giver 2 8 eller 256 nuancer af farve for hver bølgelængde. Således, 16-bit billedbehandling har finere opløsning. Det skal bemærkes, at de oprindelige infrarøde billeder ofte pseudocolored grøn (800 nm) og rød (700 nm) i offentliggjorte rapporter for præsentation. Odyssey kameraer er almindeligt anvendt til både Western blotting og In-Cell Westerns 4-7. In-Cell Westerns på formaldehydfikserede celler bruger primære antistoffer mod ethvert protein af interesse og mærke dem til gengæld med infrarøde fluorescerende sekundære antistoffer. Denne teknik er kendt for at være særligt anvendelige til fosforylering endepunkter 6. I vores In-Cell Westerns, vi pletten faste celler til cytoskeletproteiner α-tubulin eller neuronal mikrotubuli associeret protein 2 (MAP2) i 800 nm-kanal. Disse proteiner er rigelige nok til at give høje signal-til-støj forhold. Vi plette også vores plader i 700nm kanal for kerner med DRAQ5 pletten og for cytoplasma med Sapphire pletten. Både cytoskeletproteiner og DRAQ5 + Sapphire pletter afspejler således cellulære strukturer.

Den tredje levedygtighedsassay måler metaboliske funktion og kaldes "Cell Titer Glo." I denne luciferase assay, luminescens værdier er i direkte forhold til ATP-niveauer. ATP assays er almindeligt anvendt til at kvantificere levedygtige celler 8-12. Imidlertid indeholder ordet "titer" i navnet af assayet er noget af en misvisende, fordi ATP produktion pr celle kan ændre sig som en funktion af toksin behandlinger, og er derfor ikke altid i forhold til celleantal 8. ATP niveauer kan også blive påvirket af døgnrytmen 13 og ved celledeling 14 og celledifferentiering 15. Alligevel ATP assay vist her, er enkel at udføre og nyttig, fordi ATP er en robust mål for metabolisklevedygtighed 16-21, hvis ikke celletal per se. Ved hjælp af denne analyse til at supplere den infrarøde In-Cell Westerns giver derfor et mere omfattende billede af cellulær integritet end nogen assay alene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En skematisk af de protokoller, der er illustreret i figur 1..

1.. Celleudpladning

Plate celler i 96-brønds plader ved forskellige plating tætheder (figur 2). For linearitetschecks på n2a neuroblastomcellelinie, plade 2.5k, 5k, 10k, og 15k brønd i 3 eller 6 brønde / gruppe. For linearitetschecks i rotte primære kortikale neuroner, plade 25k, 50k, 100k og 200k brønd i 3 eller 6 brønde / gruppe. Hvis cellelinjer eller primære celler af interesse ser sund på forskellige plating tætheder, plade ved og omkring den optimale celledensitet for denne celletype.

Bemærk: I den foreliggende undersøgelse blev N2A celler udpladet i 100 pi medie og primære corticale neuroner i 200 pi medier på plader, der er konstrueret til lavere fordampning. For detaljerede oplysninger om celle håndtering, medier, sera, antibiotika, og toksinvåben behandlinger, se venligst Unnithan et al. for n2a cells 8 og Posimo et al. for primære cortex kulturer 22.

    1. Gentag udpladning på en anden 96-brønds plade. Én plade vil blive analyseret for ATP (figur 2A) og den anden med de infrarøde assays (figur 2B). Man kan ikke bruge den samme plade for ATP og infrarøde analyser, fordi cellerne skal lyseres åben for intracellulære ATP målinger.
    2. Vær sikker på at pladen mindst 3 ekstra brønde til baggrundssubtraktion i de infrarøde analyser på det optimale udpladningsdensitet (kolonne 2, figur 2B).
  2. Tilføj medie uden celler eller mere billigt, sterilt vand til de ydre brønde i række A og H og i kolonne 1 og 12. Undgå at forlade sig på data fra boringer langs kanterne, da rentabiliteten er ofte lavere her fra virkningerne af medier fordampning og temperaturgradienter. Sådanne problemer med mikroplader kaldes randeffekter 23,24. Må ikke holde disse brønde tomfordi så rækkerne B og G og søjler 2 og 11 lider af randeffekt.
    Kanteffekter kan reduceres ved at inkubere en frisk seedet plade ved stuetemperatur i prøvningsbetingelser før overførsel til CO 2 inkubator 24. Desuden er en nylig undersøgelse fra Carralot beskriver en matematisk korrektion metode til mikrotiterplader ved hjælp af en enkelt kontrol kolonne 23. Oliver og kolleger brugte et specielt designet varmluft mikrotitreringsplade inkubator for at reducere termiske gradienter 25. Hvis kanten effekt er af stor bekymring, kan mikroplade stabilitet kamre (f.eks BT & C Incorporated) købes til at skabe en homogen mikromiljø med høj luftfugtighed og endda temperaturgradienter.
  3. Hvis der er behov, fordi yderligere reagens fortyndinger eller flere plating tætheder vil blive testet flere brønde end vist i figur 1, anvende de avancerede brønde til baggrundssubtraktion.
  4. Vente natten til fastgørelseaf celler og assay næste morgen som beskrevet nedenfor.

2. Selvlysende ATP Assay

  1. Følg Cell Titer Glo producentens anbefalinger til rekonstitution af underlaget med buffer og for inkubationstider.
    1. Fjern 50 eller 150 pi medier fra 100 eller 200 pi plating medier, hhv. Lidt mindre end 50 pi vil blive tilbage i brønden. Tilsæt 25 gl af reagenser (substrat plus buffer) til kolonnerne 2-6 (figur 2A) i en 1:02 fortynding.
      Bemærk: Varierende mængder af medier efterladt efter fjernelse kunne fortynde eller koncentrere ATP assayreagenser forskelligt på tværs af brønde. Sørge for, at niveauet af væske i alle multikanals pipettespidser er tilsvarende. Måle den resterende væske i udvalgte brønde over pladen med en pipette umiddelbart før tilsætning af ATP assayreagenser at sikre nøjagtighed. Hvis høj variabilitet eksisterer fra differentierede medier fordampetning på tværs af overfladen af ​​pladen, fjerne alle de gamle medier og tilføje det samme volumen af ​​friske medier eller phosphatbufret saltvand (PBS) til alle brønde umiddelbart før tilsætning af ATP assayreagenser. Hvis pladerne lider variable niveauer for fordampning, så prøv at skifte til den lave fordampning plader fra Costar Corning. I sidstnævnte plader 60 indvendige brønde er vist i figur 2 kun lider fra et gennemsnit på 0,995% ± 0.41 medier fordampning natten over. Der er således ubetydelig variation i medier volumen på tidspunktet for analysen.
    2. I kolonne 7 til 11, rækkerne B til D, fjerne nok medier til at forlade 50 pi bag, som beskrevet ovenfor, og tilføje 50 ul af reagenser i en 1:1 fortynding.
    3. I kolonne 7 til 11, rækker E til G, forlade cellerne i 100 ul medier og tilsæt 100 ul reagenser, igen i en 1:1 fortynding. Selskabet anbefaler, at 100 pi af reagenser skal fortyndes 1:01 i 100 pi medier.
      Bemærk: For atat spare på omkostningerne, er det muligt at skære disse henstillinger både i volumen og i fortynding. Men før du gør dette, skal du sikre, at det ikke reducerer linearitet og sensitivitet.
    4. Når én specifik volumen og fortyndingsfaktor af reagenser findes at være tilfredsstillende, holde med dem i alle efterfølgende eksperimenter. Kriterierne for tilfredsstillende data er beskrevet i afsnittet Resultater.
    5. Ubrugte rekonstituerede reagenser kan genfryses og bruges på et senere tidspunkt for at spare på omkostningerne. Ifølge producenten kan rekonstituerede reagenser opbevares ved -20 ° C i 21 uger med ~ 3% tab af aktivitet.
  2. Pladen anbringes på en orbitalryster i 2 minutter eller nikkende shaker i 10 min. Hvis en del af pladen, der analyseres for en anden måling, og det ikke kan rystes, agitere medierne med enkle up-and-down pipettering kun i brøndene af interesse. Store bobler genereres under dette trin, vil dog forstyrre luminescent output.
    1. 10 minutter efter tilsætning af reagenserne overføres 60 ul af såvel indholdet i hvide 96 brønds-plader. Luminescens værdier er højere i hvide plader end i klare eller sorte plader, fordi de reflekterer lyset opad mod detektoren.
      Bemærk: Det er vores erfaring, celler overlever bedre på den lave fordampning, klare Costar plader end andre plader. Disse særlige plader sælges ikke med hvide vægge. For det andet, de uigennemsigtige vægge og klare bund plader er dyrere end helt klare plader. Hvis man overfører selvlysende væske til hvide plader, kan de hvide plader vaskes og genbruges, spare på omkostningerne ved at bruge nye hvide plader til hvert forsøg. Overførsel af væske er således den billigere løsning i det lange løb.
    2. Pop luftbobler forud for aflæsning af pladen med en nål eller fortrinsvis med varmluft fra en plastik overførselspipette pære. Læs pladen på et luminometer med 1 sek integrationstid (selskabet recommeNDS 0.25-1 sec som tilstrækkelig integration tid). Læs pladen 10-12 min efter tilsætning af ATP assayreagenser. Timing er afgørende for sammenligning på tværs af forskellige plader, fordi selvlysende signalet er forbigående med en hurtig henfaldsrate, som det fremgår af Gilbert og kolleger 26.
  3. Gennemsnittet af luminescerende værdier fra 3 eller 6 brønde i hver gruppe og plottet som en funktion af celleantal i et scatterplot (se figur 3). Først trække gennemsnitlige baggrundskoncentrationer luminescens værdier af de relevante tomme (brønde 2B - 2G, brønde 11B - 11D, og ​​brønde 11E - 11g) fra hvert tilsvarende datapunkt. Der vil være tre forskellige grupper for hver udpladningsdensitet i denne første forsøg (figur 2A). ATP-niveauet kan være lineært korreleret med celledensiteter i en eller alle af disse grupper. Fortsæt med den højeste fortynding af reagenser, der stadig giver tilfredsstillende resultater for at spare på omkostningerne. Kriterier for tilfredsstillende resultater er beskrevet in afsnittet Resultater.
    Bemærk: Med de medier, der anvendes i nærværende undersøgelse, baggrundsværdier med denne analyse er ikke høje, og det er muligt at springe de tomme brønde. Producenten Promega rapporterer imidlertid, forskelle i luminescens med forskellig kultur medier. Den foreliggende undersøgelse bruger Hyclone Fetal Clone III, en syntetisk version af kalvefosterserum til N2A celler og bovint kalveserum i primære corticale kulturer. Ifølge producenten, kalveserum falder luminescens værdier, men ikke reducere følsomheden af ​​assayet. Ikke desto mindre, hvis det er af væsentlig bekymring, fortyndes ATP assayreagenser i PBS i stedet for alle på tidspunktet for analysen.
    1. Hvis cellerne ser ud til at vokse ujævnt på tværs af kolonner natten, så prøv at analysere dem inden for 6 timer af plating. Men huske på, at tætheden på det sædvanlige tidspunkt assay (for eksempel 24 timer efter behandling) er massefylden ved hvilken linearitet skal opnås.

3. Infrared Analyser

  1. Morgenen efter udpladning fikseres cellerne i den anden plade ved stuetemperatur i et stinkskab. Vær sikker på at bære handsker til dette trin, og bortskaffe fiksativ som kemisk affald, fordi formaldehyd er kræftfremkaldende. Tilsæt 4% formaldehyd og 4% saccharose i 0,1 M phosphatbuffer til eksisterende medier i en 1:1 fortynding. Medierne kan også vaskes med PBS før fastsættelse i fuld styrke fiksativ. Enten teknik fungerer godt.
    1. Inkuber i fiksativ i 20 min og derefter fjerne fiksativ og vask 3x i 200 pi PBS.
  2. Opbevar pladen i PBS med 0,2% natriumazid ved 4 ° C, hvis analysen ikke vil ske på samme dag. Ellers gå videre med analysen og placere cellerne i blokerende opløsning for at minimere ikke-specifik binding af antistoffer.
    1. Fortynd fisk serum Odyssey blok 1:1 i PBS, og der tilsættes 0,3% Triton-X 100 som en celle permeabilisator. Gør nok blokerende løsning samt primær og sekundær Antibody løsninger, således at 35 pi kan pipetteres i hver brønd. Men hvis en masse bobler observeres under pipettering, at> 50 pi til hver brønd, ellers boblerne nå ned i cellerne og blokere antistoffer fra binding. Overdreven sæbevand bobler vises som en ufarvet cirkulær plet i midten af ​​brønden. Forsøge at justere pipettering, hvis dette forekommer.
    2. Inkuber i denne blokerende opløsning i 30-60 min ved stuetemperatur.
      Bemærk: 5% bovint serumalbumin eller normale sera fra den samme art som det sekundære antistof kan også anvendes som blokerer løsninger for at spare på udgifterne til fisk serum blok. Blokering løsninger kan påvirke ydeevnen af ​​antistoffet. Således er den optimale blok for hvert antistof bestemmes bedst empirisk.
      Bemærk: Nogle efterforskere placere In-Cell vestlige plader på shakers i inkubationstiden. Men dette er ikke nødvendigt.
  3. Foretag de primære antistoffer: 1:10.000 udvanding for anti-α-tubulin(Musemonoklonalt, tabel 1) og 1:2000 fortynding af anti-MAP2 (musemonoklonalt, tabel 1). Disse antistoffer er specifikke for proteiner af interesse i disse cellulære modeller, specificitet er afgørende for enhver immunocytokemiske pletten.
    Bemærk: MAP2 er en markør for neuroner og er velegnet til blandede neuronale / glial kulturer. Den postnatale kulturer vist her indeholder også nogle glia (~ 25%), fordi astrocytter vises først på embryonale dag 18, med deres numre toppede i begyndelsen neonatale periode 27,28. Man kan ikke skelne mellem astrocytter og neuroner i ATP og DRAQ5 + Sapphire assays. For at måle neuroner og astrocytter separat brug samtidig MAP2 og GFAP-farvning i 800 og 700 nm kanaler, som beskrevet af Mullett og kolleger 4,29, udelader DRAQ5 + Sapphire. Men hvis alle celler i kulturen ønsker at blive vurderet, skal du bruge et pan-cellulær markør, såsom α-tubulin, β-actin, eller GAPDH.
    Bemærk: Disse fortyndinger er blevet optimeret til n2a og primære kortikale celler og kan ikke generalisere til hver model. Derfor prøve mindst to primære antistoffortyndinger, en på venstre halvdel af pladen og en på højre halvdel (se figur 2b). Alternativt kan du prøve 3-4 fortyndinger af primære antistoffer på 3 brønde hver. For eksempel kan den anbefalede fortynding på antistoffet indskudsarket flankeres med to-fold ændringer. Med andre ord, hvis den anbefalede fortynding for immuncytokemi er 1:500, også prøve 1:250 og 1:1000 fortyndingsfaktorer.
    1. Fortynd antistoffer i 1:1 Odyssey blok: PBS og tilføje 0,3% Triton-X. At spare på omkostningerne, så prøv at gøre antistoffer i blokerende opløsning, der blev anvendt til de celler i trin 3.2.1 ved at fjerne denne løsning i slutningen af ​​inkubationen. Opbevar cellerne i PBS, mens du gør dette, og de må ikke tørre ud.
    2. Inkuber i primære antistoffer enten 1-2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C. For svagt bBINDENDE antistoffer og proteiner, der ikke er rigeligt, kan overnattende inkubationer bidrage til at øge signal.
      Bemærk: Lad mindst 3 brønde i blokerende opløsning for baggrundssubtraktion ved hvert sekundært koncentration antistof (brønde 2B-2D og brønde 2E-2G i figur 2B). Udsæt ikke disse brønde til enhver primære antistof overhovedet. De afslører omfanget af ikke-specifik binding af det sekundære antistof og er nyttige til beregning af signal-støj-forhold. Hvis der er en bekymring for, at de sekundære antistoffer vil føre til høje niveauer af uspecifik binding, også kontrolfordybninger, der ikke er udsat for enten primær eller sekundær antistof, men modtager det samme antal vaske. Forskellen mellem disse brønde og "sekundære kun" brønde vil afsløre omfanget af ikke-specifik binding på grund af det sekundære antistof alene. I vores test på mus n2a celler, signalerer intensitet med anti-mus sekundært antistof alene var 0,557 ± 0,032, signal med anti-kaninsekundært antistof alene var 0,533 ± 0,041, signalerer med noget sekundært antistof blev 0,357 ± 0,003, og signal med primære og sekundære antistoffer var 11,867 ± 0,911. Vi har således ikke observeret høje niveauer af ikke-specifik binding, selv når anvendelse af anti-muse-sekundære antistoffer på museceller. Der er flere producenten for infrarøde sekundære antistoffer, anbefaler vi kun at købe de meget cross-adsorberede dem. Bemærk, at koncentrationen af ​​sekundære IgG antistoffer kan variere afhængigt af kilden.
  4. Skyl primære antistoffer med 3 vaske på 200 ul PBS per brønd, 10 min hver. Primære antistoffer kan spares ved 4 ° C i et par uger i 0,2% natriumazid og genbruges indtil små pletter af vragdele bliver synlige, når løsningerne holdes op i lyset. Dette er kun gjort for at spare på omkostningerne. Hvis prisen ikke er et problem, gør friske antistoffer til hver brug.
  5. Fortynd det sekundære antistof ved 1:1000 eller 1:2000 i 1:1 Odyssey blok: PBS med 0,3% Triton-X (figur 2B). Tilsæt 1:1000 fortynding til den øverste halvdel af pladen og 1:2.000 til den nederste halvdel af pladen. Disse koncentrationer kan reduceres yderligere at spare på omkostningerne, men tjek for linearitet, før at forpligte sig til dette.
    Bemærk: Vær sikker på at tilføje den passende sekundære antistof løsning på baggrundssubtraktion brønde (kolonne 2 i figur 2B).
    1. Hvis et andet protein vil blive analyseret i stedet for DRAQ5 + Sapphire, label celler til α-tubulin eller MAP2 med 700 nm gede-anti-muse-IgG, og det andet protein i 800 nm kanal med primære antistoffer fra en anden art end mus arter. 800 nm kanal har mindre baggrund end 700 nm kanal og bør være forbeholdt de mest kritiske protein af interesse.
    2. Inkuber i sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur i en skuffe væk fra lys.
  6. Skyl sekundære antistoffer med 3 vaske på 200 ul PBS per brønd, 10 min hver.
  7. Gør DRAQ5 + Sapphire løsninger. Til venstre halvdel af pladen, fortyndes DRAQ5 1:10.000 (0,5 uM slutkoncentration) og Sapphire 1:1000 i PBS med 0,3% Triton-X (kolonne 3-6, figur 2B). Til højre halvdel af pladen, fortyndes DRAQ5 1:20.000 (0,25 uM) og Sapphire 1:2000 (kolonne 7-10; Figur 2B).
    Bemærk: DRAQ5 bruges til at blive solgt til en 1 mM bestand i stedet for en 5 mM lager. Nogle tidligere offentliggjorte rapporter bruges derfor 1:4,000 eller 1:2.000 fortyndinger af DRAQ5 8.
    1. At spare på omkostningerne, hvis to plader bliver analyseres samtidigt, kan samme DRAQ5 + Sapphire løsninger bruges på to plader i rækkefølge, pipettering det fra den første plade og tilføje det til den anden. Hvis de samme løsninger vil blive anvendt to gange på denne måde, anvende dem inden for en dag. Fortyndet DRAQ5 + Sapphire-løsninger kan ikke gemmes ved 4 ° C eller fryses til senere brug.
    2. Inkuber i disse opløsninger i 30 minutter ved stuetemperatur væk from lys. Hvis tiden er kort, og DRAQ5 + Sapphire løsninger ikke genbruges på andre plader med forskellige sekundærerne, tilsættes disse pletter til de sekundære antistof løsninger i trin 3,5 og inkuberes i 1 time.
      Bemærk: Du må ikke tilføje DRAQ5 + Sapphire løsning på baggrundssubtraktion brønde (kolonne 2 i figur 2B), da disse brønde ikke skal farves i 700 nm-kanal.
  8. Vask pladen 3 gange med 200 pi PBS per brønd i 10 minutter hver. Sæt 0,2% natriumazid i den endelige vask med PBS, hvis pladen vil blive farvet med andre synlige afstande sekundære antistoffer efter infrarød billeddannelse er færdig.
  9. Scan pladen på en odyssé Imager. Begynd ved at scanne pladerne ved intensitet 5 og 169 mm opløsning. Enten "middel kvalitet" eller "lav kvalitet"-indstillingerne er tilstrækkelig. Virksomheden frigiver ikke detaljeret excitation / emission filter information. Men emissionsfiltre er cirka 20 nm brede og centreret omkring 720 og 820 nm, ifølge fabrikanten.
    Bemærk: Det er muligt at scanne plader, mens de stadig er våde, da efterforskerne måtte ønske at fortsætte med at plette dem med andre markører. Men virksomheden foreslår i sin online protokol, tørre plader resulterer i mindre velstillede godt signal spredning. Hvis du scanner dem både våd og tør at sammenligne data, skal du sørge for at fjerne alt PBS fra brønden, fordi de resterende salte efter fordampning kan føre til forhøjet baggrundsfluorescens langs kanterne.
    1. Odyssey Imager scanner op og gennem bunden af ​​pladen. Plader fra forskellige producenter kan kræve forskellige fokus forskydninger fordi bunden af ​​brøndene kan variere i deres tykkelse og dybde i pladen. Prøv at scanne ved forskellige fokus forskydninger og se, hvor det højeste signal-til-støj-forhold og skarpeste (mest i fokus) signalet opnået: 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 mm. Forsøger også at måle dybden af ​​brønden fra bunden af ​​en plade med en lineal at bekræfte findings på Odysseen. Husk, at plasten i bunden af ​​brønden kan føje ekstra højde til linealen målinger. De Costar plader anvendes i den foreliggende undersøgelse kræve fokus forskydning på 4,0 mm.
    2. Brug In-Cell vestlige funktion i softwaren for at placere den rigtige størrelse gitter på billedet af pladen og eksportere data til Microsoft Excel. Undersøg de "integrerede intensitet" værdier af de samme brønde på tværs af forskellige fokus forskydninger at finde de højeste fluorescens værdier. Fokus offset, der giver det højeste signal-til-støj-forhold (signal i immunofarvet brønde versus "ingen primære negative kontrol" brønde) er den ene til at vælge herefter.
    3. Når man fokus offset er besluttet, scan igen i små intervaller. For eksempel, hvis den klareste signal var på 3,5 og 4,0 mm, prøve scanning ved 3,6, 3,7, 3,8 og 3,9 mm og se, om der er nogen yderligere forbedring i signalstyrke. Hvis fokus offset er forkert, signalintensiteter på tværs af de 12 kolonner på en tom plspiste (når alle søjler bør have lige signal) vises som en U-formet kurve i stedet for en flad linje. Hvis det fortsætter med at være et problem med plader, så prøv glasbund plader.
  10. Fratræk gennemsnittet af de integrerede intensiteter i baggrundssubtraktion brønde (figur 2B, brønde 2B - 2D eller brønde 2E - 2G) fra alle tilsvarende datapunkt i de 700 og 800 nm kanaler. Derefter gennemsnit de integrerede signalintensiteter for hver gruppe af brønde. Plot dataene som en scatterplot mod celledensitet (se figur 3).
    1. Sammenligne resultaterne af de to forskellige fortyndinger af primære og sekundære antistoffer og resultaterne af de to forskellige fortyndinger af DRAQ5 + Sapphire at slå sig ned på en fortynding hver for efterfølgende eksperimenter. Hvis der ikke opnås linearitet, prøve at scanne med en anden intensitet. Scanne med intensiteter 3 og 7 i stedet for 5 og genanalysere data. Hvis data forbedres ved en af ​​disse intensiteter mener stadig ikke tilfredsstillende, scanne i intervaller omkring denne intensitet.
    2. Vær forsigtig med ikke at analysere billeder, hvor softwaren viser hvide pletter i brøndene, disse pletter betyde mættet signal ud af den vifte af imager. Scanne ved en lavere intensitet, hvis dette forekommer.
    3. Hvis der ikke opnås linearitet, forsøger også at reparere cellerne indenfor 6 timer i yderklædningen, fordi de måske vokse eller dø ujævnt i forskellige kolonner natten over. Også prøve forskellige plating tætheder, forskellige scanning intensiteter, yderligere optimeringer af reagenser fortyndingsfaktorer, glas-bund plader, DRAQ5 af sig selv som en kerne kun plet eller andre end anti-α-tubulin eller anti-MAP2 forskellige antistoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den hastighedsbegrænsende faktor i disse eksperimenter er den infrarøde farvning, som ATP-assayet er forholdsvis kort varighed. For de infrarøde assays forventer vi, at otte plader med 96 brønde kan farves og scannes inden for én dag ved en gradvis to partier af fire plader hver (se figur 1). Dette skøn forudsætter 20 min af fiksering, 30 min vask, 30 min af blokering, 2 hr primære antistof inkubation efterfulgt af 30 min vask, 1 time sekundært antistof inkubation efterfulgt af 30 min vask, 30 min DRAQ5 + Sapphire efterfulgt af 30 min vask, og 34 min af scanningstid for 4 plader. Femten yderligere fem minutter er indregnet i figur 1 for vask med henblik på at redegøre for den forskudte afpipettering af fire individuelle plader. Tid til dataanalyser er ikke medtaget i denne vurdering. Hvis vil forekomme ATP assay målinger parallelt for hver infrarød plade, kan tolv plader analyseres på én dag - seks for den infrarøde plets og seks for ATP niveauer.

Kriterier for tilfredsstillende data i regressionsanalyserne (figur 3), som nævnt i protokol afsnittet indeholde en signifikant sammenhæng mellem udpladningsdensitet og signalstyrke (to halet p ≤ 0,05). Størrelsen af ​​ændringer i luminescens eller infrarødt signal bør også være i forhold til de ændringer i antallet af celler. Ideelt set bør 5k celler har cirka halvdelen af luminescens eller ATP niveauer af 10k celler og 15k celler bør have omkring 50% højere værdier end 10k celler osv. Denne proportionalitet afspejler assayets følsomhed og adskiller sig fra R 2-værdi eller determinantkoefficient. R 2 kun foranstaltninger, hvor godt regressionslinjen tilnærmer de sande datapunkter. Selv hvis dataene er lineære, kan de relative ændringer i signalstyrken ikke stå i forhold til størrelsen af ​​ændringerne i celle nummer. Dette kan ske whøne regressionslinjen har en høj R 2, men en lav skråning, hvilket tyder på, at analysen ikke er meget følsomme. Således bør kriterierne for signifikant sammenhæng og proportionalitet i de data, begge være opfyldt. Endelig bør ændringer i signalstyrke omkring den optimale udpladningsdensitet falder inden for det dynamiske område af instrumentet og assayet. Det dynamiske område er forholdet mellem de største og mindste mulige værdier. Odyssey imager har et 4,5 log dynamikområde og mættet signal viser sig som en lys hvid farve i stedet for de sædvanlige røde eller grønne image med henblik på at advare forskeren, at resultaterne ikke længere er kvantificerbare. Det dynamiske område under selve assayet er smallere på grund af problemer såsom maksimal og minimal udpladningsdensitet for en given celletype. Hvis en plader på stigende celledensiteter vil mætningskurven for disse assays afslører plating densiteter over hvilket der kan løses yderligere forskelle, enten fordi de er ude afvifte af billeddanneren, eller fordi cellerne ikke overleve fortrængning natten over. Tilsvarende, hvis én plader faldende celletætheder, kan man måle de mindstekrav celletætheder under hvilket der ikke er nogen yderligere ændringer i signalet. Det dynamiske område for analysen omfatter kun klædningen tætheder mellem minimum og maksimum antal celler / brønd, der kan løses. Vi har ikke målt hele det dynamiske område for disse særlige analyser, fordi vores celler ikke overlever godt ved tætheder over dem, der er rapporteret.

Efter optimering vi nu plette N2A mus neuroblastomceller med anti-α-tubulin ved en 1:10.000 fortynding med anti-muse-IgG ved en 1:2000 fortynding og med DRAQ5 + Sapphire løsninger på 1:20.000 og 1:2.000, hhv. Vi bruger også 25 pi ATP assayreagenser i 50 pi medier. Resultaterne under disse betingelser er vist i figur 3A, B og C og er offentliggjort before 8.. Signalstyrke i alle tre assays var signifikant korreleret med antallet af celler pr. Selvom alle tre analyser var meget lineær, de var ikke tilsvarende i følsomhed. For eksempel vidste 5k brønd ikke nøjagtigt halvdelen af ​​mængden af ​​infrarød farvning som 10k celler pr. I modsætning til de infrarøde assays ATP assay var mere følsomt for ændringer i udpladningsdensitet. Med andre ord, luminescens faldt omtrent halvdelen fra 10k til 5k og fra 5k til 2.5k celler pr. På trods af disse resultater vedrørende den højeste følsomhed af ATP-assay, er det bedst at udføre alle tre assays for levedygtighed for at få et bredere billede af cellulære sundhed.

Vi har nu plette rotte primære neuronale kulturer med anti-MAP2 ved en 1:2000 fortynding med anti-muse-IgG ved en 1:1000 fortynding og med DRAQ5 + Sapphire løsninger på 1:10.000 og 1:1.000, henholdsvis, og bruge 25 pi ATP assayreagenser i 50 pi medier (fig.3D, E og F). Signal styrke i DRAQ5 + Sapphire assay var den mindst lineær alle tre analyser, fordi der var lidt forskel mellem 100k og 200k celler pr i 700 nm-kanal. , Signalstyrke på 700 nm var dog godt i forhold til celle nummer under 100k celler pr godt, og vi altid pladen neuronkulturer på 100k celler pr godt alligevel. Ikke desto mindre har vi også observeret, at DRAQ5 + Sapphire analysen er ikke så følsomme over for toksin behandlinger som de to andre analyser (se nedenfor). I modsætning til DRAQ5 + Sapphire, var signalstyrke i bedre forhold med plating tætheder for både MAP2 og ATP assays. Det skal bemærkes, at en større mængde af ATP assayreagenser kan forbedre resultaterne på 200k celler pr. Med andre ord kan luminescerende output hæves til nøjagtig 200% af værdierne ved 100k celler per brønd, fordi der er mere af reagenset. Men vi aldrig plade corticale kulturer ved at høj en udpladningsdensitet for experimeNTS. Vi har også fundet, at MAP2 og ATP-niveauet er følsomme over for 20% ændringer i neocorticale neuronal udpladningsdensitet, der spænder fra 20k celler per brønd til 120k celler per brønd 22. Ikke desto mindre bør andre efterforskere teste disse analyser i deres eget laboratorium snarere end at bruge de optimale betingelser fra vores eksperimenter på grund af inter-lab variation i væv og celler håndtering.

For at illustrere anvendeligheden af disse assays følgende behandlinger med toksiner, viser vi dosisresponskurver af N2A celler behandlet med MG132 en proteasominhibitor (figur 4). MG132 blev anvendt i nærvær eller fravær af glutathion forstadiet N-acetylcystein. Disse data kan også findes i vores seneste publikation om de beskyttende effekter af N-acetyl cystein 30. Celler blev analyseret 48 timer efter MG132 behandlinger. MG132 dosisafhængigt nedsat DRAQ5 + Sapphire signal (4A, D) og α-tubulin signal ( IC50-værdier i fravær eller nærvær af N-acetylcystein. Den anvendte ligning var Y = 100 / (1 ​​+ 10 ^ ((LOGIC 50-X) * HillSlope))). IC50-værdien for DRAQ5 + Sapphire var 1,64 pM MG132 (logisk 50 = 0,22 ± 0,03, R2 = 0,9477, Hill hældning = -1.26) og for α-tubulin niveauer var 1,96 pM MG132 (logisk 50 = 0,29 ± 0,04, R 2 = 0,9296, Hill hældning = -1,349). N-acetylcystein flyttet kurver til højre, hvilket tyder på, at mere MG132 var påkrævet til at dræbe celler i nærvær af denne beskyttende forbindelse. I nærvær af N-acetylcystein, IC50 værdi for DRAQ5 + Sapphire var 4,64 uM MG132 (logisk 50 = 0,67 ± 0,05, R2 = 0,8732, Hill hældning = -1,06) og for α-tubulin var 6,35 uM MG132 ( Logik 50 = 0,80 ± 0,04, R2 = 0,8802, Hill hældning = -10,382). En undersøgelse af N2A-celler ved Madeira og kolleger rapporterede cirka 50% tab af levedygtighed på 10 uM MG132, som målt ved MTT-assayet 31. Fioriti indberettet 60% tab af levedygtighed 4 timer efter behandling med 50 pM MG132, igen med MTT assay 32.. Endelig Zhang og kolleger rapporterede 60% ​​tab af levedygtighed ved 10 uM MG132, ved hjælp af tællinger af Hoechst-farvede kerner 33. Disse IC 50 værdier er højere end vores. Men vi assay for levedygtighed 48 timer efter initiering af behandling, i modsætning til disse tidligere undersøgelser.

Ifølge Cell Titer Glo assay blev ATP-niveauet hæves ved lave koncentrationer af MG132 (figur 4C), hvilket viser, at ATP-niveauet er ikke nødvendigvis i forhold til celle titer efter behandling. ATP-data er ikke desto mindre nyttige, idet de viser, at N-acetylcystein beskytter også metabolisk funktion, når N2A celler behandlet med MG132. Dette fremgår than skift i IC50-værdien af MG132 med N-acetylcystein. IC50-værdien for ATP var 3,05 uM MG132 (logisk 50 = 0,48 ± 0,07, R2 = 0,8616, Hill slope = -1.0) med køretøjet og 9,12 uM MG132 med N-acetylcystein (logisk 50 = 0,96 ± 0,04, R2 = 0,9261, Hill hældning = -1.0). Bemærk, at de koncentrationer, der førte til stigninger i ATP blev udelukket i denne analyse. Inklusive alle værdier i analysen sænkede determinationskoefficienten og øget IC 50 værdier til 4,03 uM MG132 (logisk 50 = 0,61 ± 0,09, R2 = 0,7224, Hill Slope = -1.4) i nærværelse af køretøjet og 9,24 uM MG132 (logisk 50 = 0,96 ± 0,07, R2 = 0,6607, Hill Slope = -2.1) i nærvær af N-acetylcystein (kontrast med figur 4C).

Et andet eksempel på disse tre assays er illustreret for primære kulturer i Figure 5.. Væv blev mikrodissekeres fra rotte neocortex og allocortex, dissocieret udpladet ved 100k celler per brønd og behandles parallelt med H 2 O 2. Vi testede den hypotese, at disse to områder af hjernen vil variere i deres håndtering af oxidativt stress, som de er forskelligt sårbare over for neurodegenerative sygdomme 34-39. Nogle af disse data er blevet udgivet før, og resultaterne diskuteres yderligere i denne undersøgelse 22. IC50-værdier for DRAQ5 + Sapphire var 22,84 uM H 2 O 2 i neocortex (logisk 50 = 1,36 ± 0,07, R2 = 0,7552, Hill hældning = -0.95) og 24.63 uM H 2 O 2 i allocortex (logisk 50 = 1,39 ± 0,03, R2 = 0,9379, Hill hældning = -1,74). IC50-værdier for MAP2 var 11,66 uM H 2 O 2 i neocortex (logisk 50 = 1,07 ± 0,04, R2 = 0,9332, Hill hældning = -2,13) ​​og 29,76 uM H 2 O 2 i allocortex (logisk 50 = 1,47 ± 0,04, R2 = 0,8934, Hill hældning = -4,45). IC50-værdier for ATP var 23,82 uM H 2 O 2 i neocortex (logisk 50 = 1,38 ± 0,03, R2 = 0,8907, Hill hældning = -2,56) og 44,5 uM H 2 O 2 i allocortex (logisk 50 = 1,65 ± 0,03 , R2 = 0,9204, Hill hældning = -2,71). Allocortex var betydeligt mere resistent over for oxidativ stress end neocortex ved koncentrationer af H 2 O 2 under 50 pM, men DRAQ5 + Sapphire analyse var den mindst følsomme illustrerer denne forskel. Det kan afspejle, at sidstnævnte analyse ikke kan skelne glia fra neuroner, i modsætning MAP2. Som tidligere nævnt vore kulturer indeholde noget glia, som de er høstet fra postnatal hjerne 22. Overraskende ved høje koncentrationer af H 2 O 2 (75 pM og derover), når alle MAP2 + astrocytter i disse kulturer er mere modstandsdygtige over for H 2 O 2 end MAP2 + neuroner (ikke vist), vi hypotesen, at neocortical astrocytter er mindre sårbar over for oxidative skader end allocortical astrocytter. Dette mønster kan afspejles i DRAQ5 + Sapphire assay, men ikke ATP-analysen, fordi oxidativt beskadigede astrocytter er ikke metabolisk levedygtige. Uanset årsagen til disse slående mønstre, er disse kultur data primære illustreret her kun for at afsløre, at analyserne ikke altid enige.

Endelig, for at illustrere den intraplate variabilitet med alle tre assays vi plottede anden og tredje Wells rå datapunkter fra ovennævnte dosis-respons-kurver i figur 6A-C og 6G-I >. Ligeledes for at illustrere variationen interplate afbildet vi gennemsnittet af rå datapunkter (middelværdien af tredobbelte brønde) to plader i figurerne 6D-F og 6J-L. Signal styrke i replikatbrønde og på tværs af uafhængige forsøg udviste signifikante sammenhænge for hver foranstaltning. Der var nogle variation i rå værdier på tværs af uafhængige forsøg i ubearbejdet neuronkulturer, måske fordi vi genbruger gamle antistof og DRAQ5 + Sapphire løsninger og refreeze ubrugt ATP assayreagenserne et par gange. En anden årsag til det højere interplate variation i primære kulturer kan være kvaliteten af ​​selve kulturen. Varierende postmortem intervaller og væv håndtering på tværs af forskellige eksperimentelle dage kan bidrage til varians.

jpg "/>
Figur 1.. Skematisk illustration af alle tre levedygtighed assays (A) og tidslinje for infrarød assays (B). Vist er de anbefalede procedurer for n2a celler. Hvis DRAQ5 + Sapphire løsninger ikke vil blive genbrugt på andre plader, der er farvet med forskellige sekundære antistoffer, kan de kombineres med anti-mus sekundært antistof løsning for en endelig 1 time inkubation, hvilket reducerer den procedure med et trin. Klik her for at se større billede.

Figur 2
Figur 2. Plade format ATP-assay (A) og de ​​infrarøde assays (B), der er beskrevet i Procedure sektion. Selv om en96 brønde er illustreret, disse analyser kan tilpasses til andre formater, såsom plader med 384 brønde, for at spare på reagenser og celler. Klik her for at se større billede.

Figur 3
Figur 3.. Lineær regressionsanalyse for alle tre levedygtighed analyser i n2a mus neuroblastomceller (A, B, C) ​​eller primære postnatal rotte neocortical neuroner (D, E, F). Signalstyrke for hver analyse er afbildet som en funktion af udpladningsdensitet. Mellemværker viser repræsentative infrarøde billeder af DRAQ5 + Sapphire (A, D) α-tubulin (B) eller MAP2 (E) pletten. Rå intensitet værdier er anført under hvert billede. Bemærk, at rå værdier ien individuel brønd kan være forskellig fra gennemsnittet af 3 brønde til dette eksperiment, og fra gennemsnittet af 3-4 uafhængige forsøg. De originale infrarøde billeder blev pseudocolored rød (700 nm) eller grøn (800 nm). Hvert forsøg blev udført i tredobbelte brønde og gentagne 3x for DRAQ5 + Sapphire både N2A-celler og primære neuroner, 3x for α-tubulin, 4x for MAP2, 3x for ATP i N2A-celler, og 4x for ATP i neuroner. Data fra tredobbelte brønde var gennemsnit for en endelig værdi for hver af 3-4 eksperimenter. Middelværdien og SEM af disse 3-4 endelige værdier er vist i grafen. Bemærk, at DRAQ5 + Sapphire værdier udviser lav standardafvigelser så SEM barer er ikke synlige. R 2 koefficient på beslutsomhed og to halet p-værdi vurdering af betydningen af sammenhængen illustreres også for hver foranstaltning. Data blev analyseret i GraphPad Prism (version 5.0). Gengivet fra Neurochemistry International, 61, ved Unnithen m.fl.: "Rescue fra en to hit high-throughput model af neurodegeneration med N-acetyl cystein", s. 356-368, med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se større billede.

Figur 4
Fig. 4. Beskyttelse af N2A celler mod MG132 toksicitet. N2A celler blev behandlet med angivne koncentrationer af proteasom-inhibitor MG132 i nærvær eller fravær af antioxidant N-acetylcystein (NAC, 3 mM). Alle tre levedygtighed blev udført 48 timer senere. Bemærk stigningen i ATP-niveauet ved lave koncentrationer af MG132 (C). Ingen parallel stigning i DRAQ5 + Sapphire farvning (A) or α-tubulin (B) var tilsyneladende. Repræsentative infrarøde billeder af DRAQ5 + Safir og α-tubulin pletter blev pseudocolored rødt og grønt i D og E, hhv. Hvert forsøg blev udført i tredobbelte brønde og gentagen 4x for DRAQ5 + Sapphire, 4x for α-tubulin og 3x til ATP. Data fra tredobbelte brønde var gennemsnit for en endelig værdi for hver af 3-4 eksperimenter. Middelværdien og SEM af disse 3-4 endelige værdier vises. * P ≤ 0,05 for sammenligning af N-acetyl cystein versus vand, Bonferroni korrektion efter to-vejs ANOVA. Data blev analyseret i GraphPad Prism (version 5.0). Gengivet fra Neuroscience, 255, af Jiang et al: "N-acetyl cystein sløver proteotoxicity i en varmechockproteinet-afhængig måde", s. 19-32, med tilladelse fra Elsevier. Cslikke her for at se større billede.

Figur 5
Figur 5.. Differentiel sårbarhed neocortical og allocortical kulturer til hydrogenperoxid toksicitet. Microdissections af postnatal primær motorisk og sensorisk neocortex og entorhinal og piriform allocortex blev dissocieret og belagt på 100k celler pr. På dag in vitro 2 blev celler behandlet med de angivne koncentrationer af H 2 O 2. Pladerne blev analyseret 48 timer senere. Bemærk, at allocortex overlever disse dyrkningsbetingelser bedre end neocortex og har højere celletal ved baseline. Hvert forsøg blev udført i tredobbelte brønde og gentagen 4x for DRAQ5 + Sapphire, 3x for MAP2 og 6x for ATP. Data fra tredobbelte brønde var gennemsnitfor én endelig værdi for hver af 3-6 eksperimenter. Middelværdien og SEM af disse 3-6 endelige værdier vises. * P ≤ 0,05 for sammenligning af neo-versus allocortex, Bonferroni korrektion efter to-vejs ANOVA. Data blev analyseret i GraphPad Prism (version 5.0). Klik her for at se større billede.

Figur 6
Figur 6. Intraplate og interplate korrelationer for MG132 og H 2 O 2 dosis-respons kurver i n2a celler og corticalneuroner. Alle individuelle eksperimenter blev udført i tredobbelte brønde. Rådata fra den anden to brønde inden for hver gruppe blev afbildet som replikerer 1 og 2 for at måle reproducerbarhed inden pladerne (A, C for n2a celler og G, H, og I for cortex). Data fra de samme grupper i to uafhængige forsøg (gennemsnittet af de tre brønde) blev afbildet som plade 1 og plade 2 for at måle reproducerbarhed tværs plader (D, E, og F for n2a celler og J, K, L for cortex). R 2 koefficient på beslutsomhed og to halet p-værdi vurdering af betydningen af sammenhængen illustreres også for hver foranstaltning. Data blev analyseret i GraphPad Prism (version 5.0). Klik her for at se større billede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har fundet, at signalstyrken i alle tre levedygtighed assays er lineær og korreleret med udpladningsdensitet. Men ikke alle assays er lige følsomme over for 2-fold eller 1,5-fold ændring i udpladningsdensitet. For N2A celler, infrarøde assays er mindre følsomme end ATP-assay, især ved lavere plating tætheder. Selvom de infrarøde assays er mindre følsomme end ATP, de DRAQ5 + Sapphire assays og de α-tubulin assays er i god overensstemmelse med, at de afslører meget beskyttende virkning af N-acetylcystein. Der var dosis-responsiv tab af infrarødt signal med begge assays, og alle tre levedygtighed kurver blev forskudt til højre med N-acetylcystein. Denne overlapning er dog ikke altid for alle typer af behandlinger af N2A-celler, som α-tubulin og ATP assays synes at være mere følsomme over for forbindelser, såsom ammoniumchlorid end DRAQ5 + Sapphire assay (se figur 4 i Unnithan et al. 8. ). Således levedygtighed phenotypes ikke altid ligeligt repræsenteret ved alle tre analyser. Selv om ATP-analysen var i bedre forhold til antallet af n2a celler belagt end α-tubulin og DRAQ5 + Sapphire analyser, den antagelse, at signalstyrken afspejler celletal var ikke altid opfyldt efter toksin behandling. ATP-niveauet steg på toksin koncentrationer, der fremkaldte ikke en tilsvarende stigning i signalet i de infrarøde analyser. Disse data viser kompenserende metaboliske ændringer i N2A celler som respons på proteasomhæmning og er nyttige i deres egen ret. Det U-formede ATP dosis-respons-kurve er karakteristisk for fænomenet hormesis. Hormesis defineres som gunstige biologiske reaktioner på eksponeringer lavt niveau til toksiner og andre stressfaktorer 40-42.

For neuroner, at DRAQ5 + Sapphire pletten var mindre følsom end MAP2 og ATP assays ved høje plating tætheder. Men DRAQ5 + Sapphire, MAP2, og ATP assays var godt i forhold til cell nummer i ubearbejdet corticalneuroner på eller under 100k celler pr. Vi plade neuroner på 100k celler pr. Neuroner fra cortex er ikke kendt for at kopiere, og derfor var vi mere bekymrede linearitet ved 100k eller lavere plating tætheder. Den DRAQ5 + Sapphire assay var mindre følsom over for forskelle mellem neocortex og allocortex end enten MAP2 eller ATP ved koncentrationer under 50 uM H 2 O 2. Desuden har ATP-niveauet ikke falder så drastisk ved H 2 O 2 behandling som infrarødt signal i de to andre analyser, måske igen tyder kompenserende stigning i ATP-output. Uoverensstemmelserne mellem de tre analyser i n2a celler og primære neuroner kan afspejle, at cellulære funktioner kan ændre inden brutto anatomiske strukturer er berørt, og at cellestrukturer, herunder cytoskeletproteiner, kan blive påvirket længe før cellerne selv er tabt. De seneste data om multiplex levedygtighed analyser af Gilbert og kolleger overbevisendeillustrere, at forskellige levedygtighed foranstaltninger såsom Hoechst nuklear farvning og ATP-målinger giver oplysninger om specifikke cellulære karakteristika, som kun delvist og indirekte afspejler levedygtighed som helhed 26. Vi anbefaler derfor, at udføre alle tre analyser samtidigt og ikke forlade sig på en enkelt analyse for metabolisk levedygtighed mange publikationer gør. For yderligere oplysninger om et af disse foranstaltninger, anbefaler vi at tælle de enkelte celler og derefter vurdere cytoskeletprotein udtryk og ATP-niveauet som funktion af celle nummer.

Selv om der er andre assays til metabolisk levedygtighed, såsom MTT, fordelen af ​​ATP-assayet ligger i dens følsomhed og dynamikområde. MTT-assayet kan overvurdere antallet af levedygtige celler i forhold til ATP-målinger og udviser en IC50, der er to gange højere 43. Desuden rapporteres Petty og kolleger, at ATP-analysen kunnedetektere den nedre grænse på 1563 celler pr henviser MTT-assayet ikke kunne detektere mindre end 25k celler / brønd 12. Signal-støj-forhold (signal fra brønde med levende celler versus brønde med ingen celler) er kun 7 for MTT men 230 for ATP 44. En anden fordel ved luminescerende ATP assays flere MTT er, at inkubationstiden er meget kortere. Desuden MTT assay fra Promega koster 0,28 ¢ per godt mens Cell Titer Glo analysen fra samme producent koster 0,09 ¢ per godt på vores anbefalede fortyndinger. Men der er begrænsninger til alle metaboliske assays, metabolisk aktivitet kan være koblet fra overlevelse, især i nekrose. Hvis dette er et problem, kan de assays, i den foreliggende rapport kombineres med målinger af lactatdehydrogenase frigivelse at fastslå tab af membran integritet. Dette vil ikke indebære nogen yderligere plader, som Lactatdehydrogenasemålinger simpelthen er lavet i det ekstracellulære medium.

Selvom vi præsentere disse analyser som alternativer til manuelle optællinger på mikroskopet, kan sidstnævnte være en meget følsom og nøjagtig metode til prøveudtagning celle nummer, hvis udført korrekt. Faktisk forventer vi, at tællinger af Hoechst-farvede kerner vil være mere følsomme over for små ændringer i n2a celletal end DRAQ5 + Sapphire analysen. Når alle assays mislykkes linearitetstest manuelle tællinger er afgørende. Et godt eksempel på dette er vores kulturperler primære astrocyt model, som vi udfører mere omstændelig manual tæller 45. Dog skal de iboende fordomme manuelle optællinger erindres når celletalsdata tolkning, ligesom de iboende mangler i edb-analyser ikke må fejes af bordet. En række af styrker og svagheder i rentabilitet assays er derfor beskrevet nedenfor.

Først, hvis DAPI eller Hoechst pletter er ansat, indskrumpet og kondenserede kerner bliver ofte betegnet somapoptotic 1.. Men cellestørrelse og kondensation af kerner ligger langs en glat kontinuum. I modsætning hertil, liv og død er gensidigt udelukkende, binære fænomener. Medmindre to meget forskellige grupper af levende eller døende celler er overholdt, synes det bedst at tælle alle celler under en tærskel nuklear diameter som apoptotisk med imaging software som MetaMorph eller ImageJ snarere end ved øjet. Selvfølgelig valget for en tærskel diameter er vilkårlig, fordi vi ikke ved, på hvilket tidspunkt en irreversibel apoptotisk kaskade initieres. Desuden ved definition, selv celler med aktiveret caspase 3 er ikke nødvendigvis på vej til døden og skulle måske regnes som stadig er i live på tidspunktet for fiksering 46.. Vores infrarøde analyser undgå sådanne bekymringer ved at behandle alle celler, der er knyttet til pladen på tidspunktet for fiksering som stadig lever. Kun celler, der har flydt væk tælles som døde. Dette placerer celler i en af ​​to forskellige kategorier og undgår faldgruberne ved at bruge en complex, kontinuert funktion ligesom nukleare diameter.

For det andet, manuelle tællinger typisk prøve en lille brøkdel af hele godt. Dette kan føre til prøveudtagning bias og lejlighedsvis høj standard fejl middelværdien. Med vores levedygtighed assays hele godt udtaget til ATP og tæt på det hele og er samplet med infrarøde assays. Denne prøveudtagning mønster øger stikprøvestørrelse og undgår undertiden vilkårlige beslutning om, hvor i brønden for at snap et fotografi til manuelle tællinger. Hvis fotos er taget af centrum af brønden, skal man huske på, at denne region er, hvor de mest vaske-off af celler sker, hvilket fører til potentielle overvurdering af toksicitet. I modsætning hertil infrarøde assays kaste et gitter på billedet af den 96-brønds plade, der kun udelukker de ekstreme hjørner af brøndene. Hvis det ønskes, kan hjørnerne af brøndene medtages ved at øge diameteren af ​​cirklerne i nettet.

For det tredje bør fotografen og den celle tæller både blive blændet under manuel tæller. Men når celler behandles med toksiner, de ofte antager morfologiske ændringer, som helt indlysende, selv for en utrænet øje. Det gør det meget mere udfordrende at forblive neutral. Blindhed er ikke et krav for vore analyser.

For det fjerde, manuelle optællinger er tidskrævende og koster hovedinvestigatoren mere i løn. Løn er et af de højeste omkostninger på forskning. Scanningen tid til en plade på Odyssey er kun 8 minutter lang på "middel kvalitet" indstilling, og kan sænkes yderligere på indstillingen "lav kvalitet". Det skal bemærkes, at Odyssey Imager er dyrt, selv når man køber en brugt demo-version, men det er en engangs-faste omkostninger. På den anden side, man også skal investere i relativt dyre epifluorescens mikroskoper til manuelle celletal på DAPI-eller Hoechst-farvede kerner. På trods af den oprindelige pris, Odysseen Imager er en multipurpose maskine, der også måler vestlige immunoblots på en kvantitativ måde 47,48. Vi har tilpasset brug af Odyssey for kvantificering af immunfarvning i makroskopiske hjernens strukturer såsom en rotte eller mus striatum eller telencephalic cortex. Denne tilgang er også blevet brugt af andre 49. En svaghed ved Odysseen Imager for væv billeddannelse er, at den højeste opløsning er kun 21 um. Det kan derfor ikke tælle de enkelte celler og er ikke beregnet til at visualisere finere anatomiske detaljer.

Endelig kan de infrarøde assays ikke så følsomme over for små ændringer i celleantal manuelle tællinger. IC50-værdierne kan derfor ikke anses for at vise den koncentration, der fremkalder netop 50% tab af celleantal, men kun som den koncentration, der fremkalder 50% tab af infrarødt signal. Denne advarsel sandsynligvis gælderalle levedygtighed assays, der omgår de enkelte celletal ved mikroskopi og prøve det hele godt på én gang. Unøjagtigheden forbundet med sådanne assays kan være en funktion af hypertrofi, atrofi, eller andre ændringer i udseende der påvirker signalstyrken. For eksempel, med nogle toksiner, α-tubulin immunoreaktivitet i hver celle kan stige som en funktion af toksicitet. Vi har observeret dette fænomen N2A celler behandlet med meget høje koncentrationer af MG132 8. Hvis dette er til bekymring, kan andre cytoskelet markørproteiner, såsom β-actin eller GAPDH anvendes. Desuden understregede n2a celler tendens til at danne bipolære processer 8,50,51. Med ændringer i celle størrelse, vil fluorescerende signal output per celle også forskellig i behandlingsgrupperne. Vi anbefaler, at toksin-behandlede celler undersøges ved standard høj opløsning mikroskopi efter immuncytokemi for de samme markører, som anvendes i In-Cell vestlige. Hvis cytoplasmaet ændrer meget i størrelse efter behandling, menkerne ikke, anbefaler vi at bruge DRAQ5 pletten uden Sapphire kun kvantificere kerner. Fremtidige studier med forskellige farvestoffer og med andre cytoskeletal eller andre rigelige proteiner er berettiget til at overvinde disse hindringer.

Vi konkluderer, at alle analyser lider forbehold og har udtrykt bekymring over følsomhed, linearitet, sampling fejl, signal-til-støj-forhold, menneskelige fordomme eller subjektivitet, tid og omkostninger. Desuden er alle analyser stole på forudsætninger, der ikke altid er opfyldt. Vi anbefaler derfor, at mindst to analyser bruges til at beskrive effekten af ​​behandling på cellekulturer, en, der måler metaboliske sundhed og én, der bygger på anatomisk levedygtighed. På denne måde kan man mere effektivt at kontrollere, hvorvidt terapeutiske forbindelser beskytte både struktur og funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen af ​​forfatterne har nogen konflikter at afsløre.

Acknowledgments

Vi anerkender Juliann Jaumotte for tanken om at spare på mængden af ​​reagenser i ATP-analysen. Vi er dybt taknemmelige for den fantastiske administrativ støtte til Mary Caruso, Deb Willson, og Jackie Farrer samt til Mylan School of Pharmacy for at yde økonomisk støtte til disse undersøgelser. Også tak til de Hunkele frygtede sygdomme Foundation og Parkinsons og bevægelsesforstyrrelser fundament for deres økonomiske støtte af de primære neuronale studier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Titer Glo Promega G7572 Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin Thermo-Shandon 9990244 Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block LI-COR 927-40003 This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100 Sigma-Aldrich 21568 We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic Fisher S468 One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic Fisher S373 See above
Sodium Azide (250x) Ricca Chemical Company 7144.8-16 Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin Sigma-Aldrich T5168 This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2 Sigma-Aldrich M9942 This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG LI-COR 926-32210 Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5 Biostatus DR50200 This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire LI-COR 928-40022
Luminometer PerkinElmer VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager LI-COR 9201-01
Shaker/Mixer Research Products International 248555

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
  2. Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G. Effects of GDNF on 6-OHDA-induced death in a dopaminergic cell line: modulation by inhibitors of PI3 kinase. J. Neurosci. 73, 105-112 (2003).
  3. Patonay, G., Antoine, M. Near-infrared fluorogenic labels: new approach to an old problem. Anal. Chem. 63, (1991).
  4. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 deficiency in astrocytes selectively enhances mitochondrial Complex I inhibitor-induced neurotoxicity. J. Neurochem. 117, 375-387 (2011).
  5. Egorina, E. M., Sovershaev, M. A., Osterud, B. In-cell Western assay: a new approach to visualize tissue factor in human monocytes. J. Thromb. Haemost. 4, 614-620 (2006).
  6. Aguilar, H. N., Zielnik, B., Tracey, C. N., Mitchell, B. F. Quantification of rapid Myosin regulatory light chain phosphorylation using high-throughput in-cell Western assays: comparison to Western immunoblots. PLoS One. 5, (2010).
  7. Jinwal, U. K., Dickey, C. A. Cell-based assays for regulators of tau biology. Methods Mol. Biol. 670, 93-108 (2011).
  8. Unnithan, A. S., Choi, H. J., Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Rescue from a two hit, high-throughput model of neurodegeneration with N-acetyl cysteine. Neurochem. Int. 61, 356-368 (2012).
  9. Hoskins, C., Wang, L., Cheng, W. P., Cuschieri, A. Dilemmas in the reliable estimation of the in-vitro cell viability in magnetic nanoparticle engineering: which tests and what protocols? Nanoscale Res. Lett.. 7, 10-1186 (2012).
  10. Essner, M. D., Javed, A., Eleazer, P. D. Effect of sodium hypochlorite on human pulp cells: an in vitro study. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 112, 662-666 (2011).
  11. Sims, J. T., Plattner, R. MTT assays cannot be utilized to study the effects of STI571/Gleevec on the viability of solid tumor cell lines. Cancer Chemother. Pharmacol. 64, 629-633 (2009).
  12. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  13. Womac, A. D., Burkeen, J. F., Neuendorff, N., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Circadian rhythms of extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus cells and cultured astrocytes. Eur. J. Neurosci. 30, 869-876 (2009).
  14. Ataullakhanov, F. I., Vitvitsky, V. M. What determines the intracellular ATP concentration. Biosci. Rep. 22, 501-511 (2002).
  15. Iglehart, J. D., Silver, D. P. Synthetic lethality--a new direction in cancer-drug development. New Engl. J. Med. 361, 189-191 (2009).
  16. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Methods. 160, 81-88 (1993).
  17. Kangas, L., Gronroos, M., Nieminen, A. L. Bioluminescence of cellular ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. Med. Biol. 62, 338-343 (1984).
  18. Lundin, A., Hasenson, M., Persson, J., Pousette, A. Estimation of biomass in growing cell lines by adenosine triphosphate assay. Methods Enzymol. 133, 27-42 (1986).
  19. Sevin, B. U., et al. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol. Oncol. 31, 191-204 (1988).
  20. Maehara, Y., Anai, H., Tamada, R., Sugimachi, K. The ATP assay is more sensitive than the succinate dehydrogenase inhibition test for predicting cell viability. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 23, 273-276 (1987).
  21. Andreotti, P. E., et al. Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Res. 55, 5276-5282 (1995).
  22. Posimo, J. M., Titler, A. M., Choi, H. J., Unnithan, A. S., Leak, R. K. Neocortex and allocortex respond differentially to cellular stress in vitro and aging in vivo. PLoS One. 8, (2013).
  23. Carralot, J. P., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28, 261-268 (2012).
  24. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
  25. Oliver, D. G., Sanders, A. H., Hogg, R. D., Hellman, J. W. Thermal gradients in microtitration plates. Effects on enzyme-linked immunoassay. J. Immunol. Methods. 42, 195-201 (1981).
  26. Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS One. 6, (2011).
  27. Bayer, S. A., Altman, J. Neocortical Development. , Raven Press. (1991).
  28. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54, 357-369 (2007).
  29. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 knock-down in astrocytes impairs astrocyte-mediated neuroprotection against rotenone. Neurobiol. Dis. 33, 28-36 (2009).
  30. Jiang, Y., et al. N-Acetyl cysteine blunts proteotoxicity in a heat shock protein-dependent manner. Neuroscience. 255, 19-32 (1016).
  31. Madeira, A., et al. Caveolin-1 interacts with alpha-synuclein and mediates toxic actions of cellular alpha-synuclein overexpression. Neurochem. Int. 59, 280-289 (2011).
  32. Fioriti, L., et al. Cytosolic prion protein (PrP) is not toxic in N2a cells and primary neurons expressing pathogenic PrP mutations. J. Biol. Chem. 280, 11320-11328 (2005).
  33. Zhang, L., et al. Proteasome inhibition modulates kinase activation in neural cells: relevance to ubiquitination, ribosomes, and survival. J. Neurosci. Res. 87, 3231-3238 (2009).
  34. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 24, 197-211 (2003).
  35. Stranahan, A. M., Mattson, M. P. Selective Vulnerability of Neurons in Layer II of the Entorhinal Cortex during Aging and Alzheimer's Disease. Neural Plast. 2010, (2010).
  36. Duyckaerts, C., Delatour, B., Potier, M. C. Classification and basic pathology of Alzheimer disease. Acta Neuropathol. 118, 5-36 (2009).
  37. Chu, C. C., Tranel, D., Damasio, A. R., Van Hoesen, G. W. The autonomic-related cortex: pathology in Alzheimer's disease. Cereb. Cortex. 7, 86-95 (1997).
  38. Braak, H., Del Tredici, K., Bohl, J., Bratzke, H., Braak, E. Pathological changes in the parahippocampal region in select non-Alzheimer's dementias. Ann. N.Y. Acad. Sci. 911, 221-239 (2000).
  39. Braak, H., Rub, U., Schultz, C., Del Tredici, K. Vulnerability of cortical neurons to Alzheimer's and Parkinson's diseases. J. Alzheimers Dis. 9, 35-44 (2006).
  40. Calabrese, E. J. Hormesis is central to toxicology, pharmacology and risk assessment. Hum. Exp. Toxicol. 29, 249-261 (2010).
  41. Giordano, J., Ives, J. A., Jonas, W. B. Hormetic responses in neural systems: consideration, contexts, and caveats. Crit. Rev. Toxicol. 38, 623-627 (2008).
  42. Mattson, M. P. Hormesis defined. Ageing Res. Rev.. 7, 1-7 (2008).
  43. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, (2010).
  44. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  45. Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Astrocyte plasticity revealed by adaptations to severe proteotoxic stress. Cell Tissue Res. , (2013).
  46. McLaughlin, B., et al. Caspase 3 activation is essential for neuroprotection in preconditioning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 715-720 (2003).
  47. Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol. Biol. 536, 499-513 (2009).
  48. Picariello, L., et al. A comparison of methods for the analysis of low abundance proteins in desmoid tumor cells. Anal. Biochem. 354, 205-212 (2006).
  49. Tapias, V., Cannon, J. R., Greenamyre, J. T. Melatonin treatment potentiates neurodegeneration in a rat rotenone Parkinson's disease model. J. Neurosci. Res. 88, 420-427 (2010).
  50. Fenteany, G., Schreiber, S. L. Specific inhibition of the chymotrypsin-like activity of the proteasome induces a bipolar morphology in neuroblastoma cells. Chem. Biol. 3, 905-912 (1996).
  51. Omura, S., et al. Lactacystin, a novel microbial metabolite, induces neuritogenesis of neuroblastoma cells. J. Antibiot. 44, 113-116 (1991).

Tags

Cellebiologi In-celle vestlige DRAQ5 Sapphire Cell Titer Glo ATP primære corticalneuroner toksicitet beskyttelse N-acetyl cystein hormesis
Levedygtighed Analyser for celler i kultur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Posimo, J. M., Unnithan, A. S.,… More

Posimo, J. M., Unnithan, A. S., Gleixner, A. M., Choi, H. J., Jiang, Y., Pulugulla, S. H., Leak, R. K. Viability Assays for Cells in Culture. J. Vis. Exp. (83), e50645, doi:10.3791/50645 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter