Therapeutische verbindingen worden vaak eerst in vitro, waarbij de levensvatbaarheid assays onderzocht. Blind celtellingen door een menselijke waarnemer kan zeer gevoelig zijn voor kleine veranderingen in het aantal cellen maar functioneren niet beoordelen. Computergestuurde levensvatbaarheid assays, zoals hier beschreven, kan zowel de structuur en functie op een objectieve manier te beoordelen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Levensvatbaarheid Testen voor Cellen in Cultuur
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Handmatige celtellingen op een microscoop een gevoelige manier is om de cellulaire levensvatbaarheid maar tijdrovend en dus duur. Geautomatiseerde levensvatbaarheid testen zijn duur in termen van apparatuur, maar kan sneller en objectiever dan handmatige cel tellingen zijn. Het voorliggende rapport beschrijft het gebruik van drie van dergelijke levensvatbaarheid assays. Twee van deze testen zijn infrarood en men luminescerende. Beide infrarood assays rekenen op een 16 bit Odyssey Imager. Een infrarood-test gebruikt de DRAQ5 vlek voor kernen in combinatie met de Sapphire vlek voor cytosol en wordt gevisualiseerd in de 700 nm kanaal. De andere infrarood-test, een In-Cell westerse, gebruikt antilichamen tegen cytoskeleteiwitten (α-tubuline of microtubuli geassocieerde proteïne 2) en noemt ze in de 800 nm kanaal. De derde levensvatbaarheid assay is een veel gebruikte luminescerende test voor ATP, maar we gebruiken een kwart van de aanbevolen hoeveelheid te besparen op kosten. Deze metingen zijn lineair en correleert met het aantal cells plated, maar verschillen in gevoeligheid. Alle drie de tests te omzeilen tijdrovende microscopie en proeven van de gehele goed, waardoor sampling error verminderen. Tenslotte alle assays gemakkelijk worden voltooid binnen een dag na afloop van het experiment, waardoor grotere aantallen proeven op korte tijdsbestek worden uitgevoerd. Echter, ze ervan uitgaan dat celaantallen evenredig blijven met de signaalsterkte na behandeling, een veronderstelling dat soms niet is voldaan, met name voor cellulaire ATP. Ook als de cellen stijgen of dalen in omvang na behandeling, kan dit signaalsterkte beïnvloeden zonder dat celaantal. We concluderen dat alle levensvatbaarheid assays, waaronder handmatige tellingen, lijdt aan een aantal kanttekeningen, maar dat geautomatiseerde levensvatbaarheid assays zijn goed de initiële investering waard. Met behulp van alle drie de testen levert samen een uitgebreid overzicht van de cellulaire structuur en functie.
Inleiding
De meest voorkomende levensvatbaarheid assay in de biologische wetenschappen impliceert cel-tellingen. Dit blijkt uit een analyse van de top (meest recente) 200 publicaties die verschenen in PubMed met een van de zoekwoorden "in vitro" of "cultuur" op 2013/04/29 en 2013/04/30. Van deze publicaties, gebruikt 23,5% celgetal assays, waaronder handmatige aantal cellen telt, geautomatiseerde aantal cellen telt met beeldbewerkingssoftware, en trypanblauwexclusie. De Live / Dead test werd in 1% van deze publicaties. Het aantal publicaties met de MTT (3 - (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide) assay voor metabole levensvatbaarheid was 11%. Dit overzicht....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Een schema van de protocollen wordt geïllustreerd in figuur 1.
1. Cell Plating
Plaat cellen in 96-well platen met verschillende plating dichtheden (figuur 2). Voor lineariteitscontroles op de N2a neuroblastoomcellijn, plaat 2.5k, 5k, 10k en 15k cellen per putje in 3 of 6 putten / groep. Voor lineariteit controles in de rat primaire corticale neuronen, plaat 25k, 50k, 100k en 200k cellen per putje in 3 of 6 putten / groep. Als de cellijnen of primaire cellen van belang er gezond bij verschillende plating dichtheden, plaat op en rond de optimale celdichtheid voor dat type cel.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het snelheidsbeperkende factor in deze experimenten is de infrarood kleuring, de ATP test relatief korte duur. Voor de infrarood assays, verwachten we dat acht 96-well platen kan worden gekleurd en gescand binnen een dag door maar liefst twee partijen van vier borden elk (zie figuur 1). Deze schatting gaat uit 20 min van fixatie, 30 min. van het wassen, 30 min van het blokkeren, 2 hr primaire antilichaam incubatie gevolgd door 30 min wasbeurten, 1 uur secundair antilichaam incubatie gevolgd door 30 min .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Wij hebben gevonden dat signaalsterkte in alle drie levensvatbaarheid assays lineair en gecorreleerd met plating dichtheid. Echter, niet alle testen zijn even gevoelig voor 2-voudige en 1,5-voudige veranderingen in uitplaatdichtheid. Voor N2a cellen, de infrarood testen zijn minder gevoelig dan de ATP-bepaling, met name bij lagere dichtheden plating. Hoewel de infrarood testen zijn minder gevoelig dan ATP, de DRAQ5 + Sapphire assays en de α-tubuline assays zijn goed overeen doordat zij onthullen de zeer beschermend effe.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen van de auteurs hebben eventuele conflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij erkennen Juliann Jaumotte voor het idee van besparing op de volumes van reagentia in de ATP-test. Wij zijn zeer dankbaar voor de uitstekende administratieve ondersteuning van Maria Caruso, Deb Willson, en Jackie Farrer en de Mylan School of Pharmacy voor het verstrekken van financiële steun voor deze studies. Dank ook aan de Hunkele gevreesde ziekten Foundation en de Parkinson en Movement Disorders Foundation voor hun financiële ondersteuning van de primaire neuronale studies.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Cell Titer Glo | Promega | G7572 | Koop in hoeveelheden van 100 ml en verdeel in aliquoten, in plaats van de duurdere hoeveelheid van 10 ml te kopen. Gereconstitueerde, ongebruikte reagentia kunnen opnieuw worden ingevroren bij -20 °C gedurende minimaal 21 weken |
| 18% Formalin | Thermo-Shandon | 9990244 | Door dit fixeermiddel te kopen, vermijdt u het afwegen van formaldehydepoeders en het koken van de oplossing; de blootstelling aan dampen wordt hierdoor geminimaliseerd |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Het is niet essentieel om dit toe te voegen aan formaldehydeoplossingen, maar het verbetert het uiterlijk van de gefixeerde cellen |
| Odyssey Block | LI-COR | 927-40003 | Dit visserum kan in bulk worden gekocht en bevroren bij -20 °C voor langdurig gebruik |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 21568 | We bewaren een voorraadoplossing van 10% Triton-X 100 in steriel water bij 4 °C |
| Natriumfosfaat Monobasisch | Fisher | S468 | Men kan ook PBS-tabletten of 10x PBS-oplossingen kopen, maar deze zijn duurder |
| Natriumfosfaat Dibasisch | Fisher | S373 | Zie hierboven |
| Natriumazid (250x) | Ricca Chemical Company | 7144.8-16 | Koop het poeder niet omdat natriumazid zeer giftig is. We bewaren al onze gebruikte antilichamen in 1x natriumazid bij 4 °C totdat ze besmet raken met puin |
| Muis anti-α-tubuline | Sigma-Aldrich | T5168 | Dit antilichaam is duur maar kan sterk worden verdund en is zeer specifiek |
| Muis anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M9942 | Dit antilichaam is duur maar is zeer specifiek (een voorwaarde voor In-Cell Westerns) |
| 800 nm Geit anti-muis IgG | LI-COR | 926-32210 | Andere bedrijven verkopen ook infrarode secundaire antilichamen. Zorg ervoor dat u de sterk geadsorbeerde antilichamen koopt en houd er rekening mee dat concentraties van IgG's kunnen variëren met de bron |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50200 | Deze verbinding werd vroeger door LI-COR verkocht bij 1 mM |
| Sapphire | LI-COR | 928-40022 | |
| Luminometer | PerkinElmer | VICTOR3 1420 multilabelteller | |
| Odyssey Imager | LI-COR | 9201-01 | |
| Schakelaar/Mixer | Research Products International | 248555 |
Referenties
- Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
- Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
