Summary
Therapeutische verbindingen worden vaak eerst in vitro, waarbij de levensvatbaarheid assays onderzocht. Blind celtellingen door een menselijke waarnemer kan zeer gevoelig zijn voor kleine veranderingen in het aantal cellen maar functioneren niet beoordelen. Computergestuurde levensvatbaarheid assays, zoals hier beschreven, kan zowel de structuur en functie op een objectieve manier te beoordelen.
Abstract
Handmatige celtellingen op een microscoop een gevoelige manier is om de cellulaire levensvatbaarheid maar tijdrovend en dus duur. Geautomatiseerde levensvatbaarheid testen zijn duur in termen van apparatuur, maar kan sneller en objectiever dan handmatige cel tellingen zijn. Het voorliggende rapport beschrijft het gebruik van drie van dergelijke levensvatbaarheid assays. Twee van deze testen zijn infrarood en men luminescerende. Beide infrarood assays rekenen op een 16 bit Odyssey Imager. Een infrarood-test gebruikt de DRAQ5 vlek voor kernen in combinatie met de Sapphire vlek voor cytosol en wordt gevisualiseerd in de 700 nm kanaal. De andere infrarood-test, een In-Cell westerse, gebruikt antilichamen tegen cytoskeleteiwitten (α-tubuline of microtubuli geassocieerde proteïne 2) en noemt ze in de 800 nm kanaal. De derde levensvatbaarheid assay is een veel gebruikte luminescerende test voor ATP, maar we gebruiken een kwart van de aanbevolen hoeveelheid te besparen op kosten. Deze metingen zijn lineair en correleert met het aantal cells plated, maar verschillen in gevoeligheid. Alle drie de tests te omzeilen tijdrovende microscopie en proeven van de gehele goed, waardoor sampling error verminderen. Tenslotte alle assays gemakkelijk worden voltooid binnen een dag na afloop van het experiment, waardoor grotere aantallen proeven op korte tijdsbestek worden uitgevoerd. Echter, ze ervan uitgaan dat celaantallen evenredig blijven met de signaalsterkte na behandeling, een veronderstelling dat soms niet is voldaan, met name voor cellulaire ATP. Ook als de cellen stijgen of dalen in omvang na behandeling, kan dit signaalsterkte beïnvloeden zonder dat celaantal. We concluderen dat alle levensvatbaarheid assays, waaronder handmatige tellingen, lijdt aan een aantal kanttekeningen, maar dat geautomatiseerde levensvatbaarheid assays zijn goed de initiële investering waard. Met behulp van alle drie de testen levert samen een uitgebreid overzicht van de cellulaire structuur en functie.
Introduction
De meest voorkomende levensvatbaarheid assay in de biologische wetenschappen impliceert cel-tellingen. Dit blijkt uit een analyse van de top (meest recente) 200 publicaties die verschenen in PubMed met een van de zoekwoorden "in vitro" of "cultuur" op 2013/04/29 en 2013/04/30. Van deze publicaties, gebruikt 23,5% celgetal assays, waaronder handmatige aantal cellen telt, geautomatiseerde aantal cellen telt met beeldbewerkingssoftware, en trypanblauwexclusie. De Live / Dead test werd in 1% van deze publicaties. Het aantal publicaties met de MTT (3 - (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide) assay voor metabole levensvatbaarheid was 11%. Dit overzicht van de literatuur blijkt ook dat het aantal publicaties met behulp van testen zoals MTT in combinatie met celgetal assays was slechts 3,5%. Ondanks lijkt de trend om een levensvatbaarheid test op zichzelf gebruiken, het beoordelen van cellulaire functie in combinatie met het aantal cellen de beste keuze voor de beoordeling van cellulaire integrity. Celtellingen op zich niet voldoende omdat de resterende cellen niet functioneel of gezond, hoewel zij in de put 1,2 zijn mogelijk. Omgekeerd kan functionele maatregelen zoals ATP verhogen of verlagen in afwezigheid van parallelle veranderingen in het aantal cellen. De ontkoppeling van metabole uitlezingen van aantal cellen suggereert dat ATP en MTT-tests nooit worden gebruikt als enige levensvatbaarheid assay. In dit rapport worden drie levensvatbaarheid testen die zowel cellulaire structuren en metabolische functie enquête beschreven, voor een meer uitgebreid overzicht van cellulaire integriteit dan een test op zich kan veroorloven.
Twee van onze analyses vereisen een infrarood imager die fluorescentie meet in de 700 en 800 nm kanalen. Lage ruis in het infrarode golflengten, wat leidt tot hogere signaal-tot-ruisverhoudingen 3. De Odyssey imager die we gebruiken heeft een 4,5 log dynamisch bereik en een bit-diepte van 16, Translating tot 2 16 of 65.536 tinten van infrarood. Dit in tegenstelling tot 8-bit kleuren weergave, die alleen biedt 2 8 of 256 tinten voor elke golflengte. Zo, 16-bits beeldvorming heeft fijnere resolutie. Opgemerkt zij dat de oorspronkelijke infraroodbeelden vaak pseudocolored groen (800 nm) en rood (700 nm) in gepubliceerde rapporten voor presentatie. Odyssey imagers worden vaak gebruikt voor zowel Western blotting en In-Cell Westerns 4-7. In-Cell Westerns op formaldehyde gefixeerde cellen gebruiken primaire antilichamen tegen een eiwit van interesse en label ze op zijn beurt met infrarood fluorescerende secundaire antilichamen. Deze techniek wordt vooral nuttig voor fosforylering eindpunten 6 zijn. In onze In-Cell Westerns, vlekken wij vaste cellen voor cytoskeleteiwitten α-tubuline of de neuronale microtubuli geassocieerde proteïne 2 (MAP2) in de 800 nm kanaal. Deze eiwitten zijn overvloedig hebben een hoge signaal-ruisverhoudingen leveren. We hebben ook vlekken op ons bord in de 700nm kanaal voor kernen met de DRAQ5 vlek en voor het cytoplasma met de Sapphire vlek. Zowel de cytoskeleteiwitten en de DRAQ5 + Sapphire vlekken weerspiegelen dus cellulaire structuren.
De derde levensvatbaarheid-assay meet metabolische functie en heet "Cell Titer Glo." In deze luciferase gebaseerde test, luminescentie waarden in directe verhouding tot ATP. ATP assays worden vaak gebruikt om levensvatbare cellen te kwantificeren 8-12. Echter, zoals het woord "titer" in de naam van de assay is iets van een verkeerde benaming omdat ATP productie per cel kan veranderen als functie van toxine behandelingen en daarom niet altijd in verhouding tot het aantal cellen 8. ATP niveaus kunnen ook worden beïnvloed door circadiaanse ritmes 13 en door celdeling 14 en celdifferentiatie 15. Niettemin, de ATP-bepaling hier is eenvoudig uit te voeren en nuttig omdat ATP is een robuuste maat voor metabolelevensvatbaarheid 16-21, zo niet het aantal cellen per se. gebruik van deze test om de infrarood te vullen In-Cell levert Westerns daarom een vollediger beeld van de cellulaire integriteit dan iemand test alleen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Een schema van de protocollen wordt geïllustreerd in figuur 1.
1. Cell Plating
Plaat cellen in 96-well platen met verschillende plating dichtheden (figuur 2). Voor lineariteitscontroles op de N2a neuroblastoomcellijn, plaat 2.5k, 5k, 10k en 15k cellen per putje in 3 of 6 putten / groep. Voor lineariteit controles in de rat primaire corticale neuronen, plaat 25k, 50k, 100k en 200k cellen per putje in 3 of 6 putten / groep. Als de cellijnen of primaire cellen van belang er gezond bij verschillende plating dichtheden, plaat op en rond de optimale celdichtheid voor dat type cel.
Opmerking: In de huidige studie werden N2a cellen uitgeplaat in 100 pl media en primaire corticale neuronen in 200 ul media op platen die zijn ontworpen voor een lagere verdamping. Voor gedetailleerde informatie over de mobiele handling, media, sera, antibiotica, en toxine behandelingen, zie Unnithan et al.. voor N2a cells 8 en Posimo et al.. voor de primaire cortex culturen 22.
- Herhaal de beplating op een tweede plaat met 96 putjes. Een plaat wordt getest op ATP (Figuur 2A) en de andere met de infrarood assays (figuur 2B). Men kan geen gebruik maken van dezelfde plaat voor de ATP en infrarood testen omdat de cellen geopend moet worden gelyseerd voor intracellulaire ATP-metingen.
- Zorg ervoor dat u ten minste 3 extra putten voor achtergrond aftrekken in het infrarood assays plaat op het optimale plating dichtheid (kolom 2; Figuur 2B).
- Media zonder cellen of, meer goedkoop, steriel water toe te voegen aan de buitenste putjes in rijen A en H en in de kolommen 1 en 12. Vermijd gebaseerd op gegevens uit putten langs de randen, zoals leefbaarheid vaak lager hier van effecten van media verdamping en temperatuur gradiënten. Dergelijke problemen met microplates worden gewoonlijk randeffecten 23,24. Mis deze putten niet leeg blijvenwant dan rij B en G en de kolommen 2 en 11 lijden aan de rand effect.
Rand effecten kunnen worden verminderd door het incuberen van een vers gezaaid plaat bij kamertemperatuur in omgevingscondities vóór de overdracht naar de CO 2 incubator 24. Bovendien is een recente studie van Carralot beschrijft een wiskundige correctiemethode voor microtiterplaten met een stuurknuppel 23. Oliver en collega's gebruikten een speciaal ontworpen geforceerde lucht microtitratieplaat incubator om thermische gradiënten 25 te verminderen. Als de rand effect is van groot belang, kan microplaat stabiliteit kamers (bijv. BT & C Incorporated) worden gekocht om een homogene micro-omgeving met een hoge luchtvochtigheid en zelfs temperatuur gradiënten creëren. - Indien meer dan putjes getoond in figuur 1 zijn nodig omdat aanvullende reagens verdunningen of meer platen dichtheden worden getest, gebruik de rand putjes achtergrond aftrek.
- Wacht 's nachts voor de bevestigingcellen en test de volgende ochtend zoals hieronder beschreven.
2. Lichtgevende ATP Assay
- Volg de aanbevelingen van de celtiter Glo fabrikant voor reconstructie van het substraat met buffer en voor incubatie tijden.
- Verwijder 50 of 150 ul media uit de 100 of 200 ul van plating media, respectievelijk. Iets minder dan 50 ul zal achterblijven in de put blijft. Voeg 25 ul van de reagentia (substraat plus buffer) kolommen 2-6 (Figuur 2A) in een 1:02 verdunning.
Opmerking: Variërend volumes media achtergelaten na verwijdering kunnen verdunnen of concentreren de ATP testreagentia differentieel over putten. Let erop dat het vloeistofniveau in de multichannel pipet tips gelijkwaardig. Meet de resterende vloeistof in geselecteerde putten over de plaat met een pipet onmiddellijk voor het toevoegen van de ATP testreagentia om nauwkeurigheid te garanderen. Als grote variabiliteit bestaat uit gedifferentieerde media Evaporatie over het oppervlak van de plaat, verwijder alle oude media en voeg dezelfde hoeveelheid vers medium of fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan alle putjes onmiddellijk vóór toevoeging van ATP assay reagentia. Als de platen lijdt variabele niveaus van verdamping, probeer dan het lage verdamping platen van Costar Corning. In deze platen, de 60 binnenkant putjes getoond in figuur 2 alleen lijden aan een gemiddelde van 0,995 ± 0,41% media verdamping overnacht. Er is dus verwaarloosbaar variabiliteit in media volume op het moment van bepaling. - In de kolommen 7 tot en met 11, rij B tot en met D, verwijder genoeg media om 50 pl achter te laten, zoals hierboven beschreven, en voeg 50 ul van de reagentia in een 1:01 verdunning.
- In de kolommen 7 tot 11, rij E tot G, laat cellen in 100 pl medium en voeg 100 ul van reagentia, opnieuw een 1:01 verdunning. Het bedrijf raadt 100 ul van reagentia moeten worden verdund 1:01 in 100 ul van media.
Opmerking: Omom te besparen op de kosten, is het mogelijk om deze aanbevelingen te snijden zowel in volume als in verdunning. Echter, voordat je dit doet, ervoor zorgen dat het niet de lineariteit en de gevoeligheid van de test doet verminderen. - Zodra een bepaald volume en verdunningsfactor van de reagentia worden bevredigend bevonden, stok met hen in alle volgende experimenten. De criteria voor bevredigende gegevens worden beschreven in de Resultaten.
- Ongebruikt gereconstitueerd reagentia kunnen worden ingevroren en gebruikt op een later tijdstip om te besparen op de kosten. Volgens de fabrikant kan gereconstitueerd reagentia worden bewaard bij -20 ° C gedurende 21 weken met ~ 3% verlies van activiteit.
- Verwijder 50 of 150 ul media uit de 100 of 200 ul van plating media, respectievelijk. Iets minder dan 50 ul zal achterblijven in de put blijft. Voeg 25 ul van de reagentia (substraat plus buffer) kolommen 2-6 (Figuur 2A) in een 1:02 verdunning.
- Plaats de plaat op een schudapparaat gedurende 2 minuten of een Tuimelschijfmeter gedurende 10 minuten. Als een deel van de plaat wordt getest op een andere meting en kan niet worden geschud, schud de media eenvoudig op en neer pipetteren alleen in de putjes van belang. Echter, overmatig belletjes die tijdens deze stap verstoren luminescent uitgang.
- 10 minuten na toevoeging van de reagentia, overdracht 60 ul van de inhoud ver in witte 96-wells platen. Luminescentie waarden zijn hoger in witte platen dan in helder of zwarte platen, omdat ze licht omhoog naar de detector weerspiegelen.
Opmerking: In onze ervaring, cellen overleven beter op de lage verdamping, duidelijk Costar platen dan andere platen. Deze specifieke platen worden niet verkocht met witte muren. Ten tweede, de ondoorzichtige wanden en duidelijke bodem platen zijn duurder dan helemaal duidelijk borden. Als men draagt de lichtgevende vloeistof witte platen, kan de witte platen worden gewassen en hergebruikt, besparen op de kosten van het gebruik van nieuwe witte platen voor elk experiment. Het overzetten vloeistof is dus de goedkopere optie op de lange termijn. - Pop luchtbellen vóór het lezen van de plaat met een naald of bij voorkeur met geforceerde lucht uit een plastic overdracht pipet lamp. Lees de plaat op een lichtmeter met een 1 sec integratie tijd (het bedrijf recommends 0,25-1 sec als voldoende integratie tijd). Lees de plaat 10-12 min na toevoeging van ATP bepalingsreagentia. Timing is van cruciaal belang voor de vergelijking tussen de verschillende platen, omdat de lichtgevende signaal is van voorbijgaande aard met een snelle verval snelheid, zoals getoond door Gilbert en collega's 26.
- 10 minuten na toevoeging van de reagentia, overdracht 60 ul van de inhoud ver in witte 96-wells platen. Luminescentie waarden zijn hoger in witte platen dan in helder of zwarte platen, omdat ze licht omhoog naar de detector weerspiegelen.
- Middel de luminescerende waarden uit de 3 of 6 putjes in elke groep en plot als functie van het aantal cellen in een spreidingsdiagram (zie figuur 3). Aftrekken eerste gemiddelde achtergrond luminescentie waarden van de juiste lege putten (putten 2B - 2G, putten 11B - 11D, en putten 11E - 11G) van elke overeenkomstige gegevenspunt. Er worden drie verschillende groepen per plating dichtheid in dit eerste experiment (Figuur 2A). ATP kan lineair gecorreleerd met dichtheden in een of meer van deze groepen. Ga verder met de hoogste verdunning van de reagentia die nog steeds geeft bevredigende resultaten te besparen op de kosten. Criteria voor bevredigende resultaten beschreven in de Resultaten.
Opmerking: Met de media die in de onderhavige studie, achtergrondwaarden met deze assay niet hoog en het is mogelijk om de blanco putjes slaan. Echter, de fabrikant Promega rapporteert verschillen in luminescentie met andere cultuur media. De huidige studie maakt gebruik Hyclone Foetale Clone III, een synthetische versie van foetaal bovine serum voor N2a cellen en runderkalfserum voor primaire corticale culturen. Volgens de fabrikant kalfsserum af fluorescentie waarden maar gevoeligheid van de test niet afneemt. Niettemin, als dit van groot belang, verdund ATP testreagentia in PBS in plaats van de media bij de assay.- Als de cellen blijken ongelijk nachts groeien over kolommen, probeer het testen van hen binnen 6 uur in de platen. Echter, in gedachten houden dat de dichtheid op de gebruikelijke tijd van de test (bijvoorbeeld 24 uur na de behandeling) is de dichtheid waaraan lineariteit moet worden bereikt.
3. Infrared Testen
- De ochtend na plating, bevestig de cellen in de tweede plaat bij kamertemperatuur in een zuurkast. Zorg ervoor dat u handschoenen te dragen voor deze stap en gooi de fixeermiddel als chemisch afval omdat formaldehyde is een kankerverwekkende stof. Voeg 4% formaldehyde en 4% sucrose in 0,1 M fosfaatbuffer bij de bestaande media in een 1:01 verdunning. De media kunnen ook uitgeschakeld worden gewassen met PBS voor bevestiging in volle sterkte fixeermiddel. Ofwel techniek werkt goed.
- Incubeer in fixatief gedurende 20 minuten en verwijder daarna de fixerende en was 3x in 200 ul PBS.
- Bewaar de plaat in PBS met 0,2% natriumazide bij 4 ° C indien de test niet zal plaatsvinden op dezelfde dag. Anders gaat de assay en zet de cellen in blokkerende oplossing om niet-specifieke binding van antilichamen te minimaliseren.
- Verdun de vis serum Odyssey block 1:01 in PBS en voeg 0,3% Triton X-100 als een cel permeabilisator. Maak genoeg blokkerende oplossing en als primaire en secundaire Antibody oplossingen voor 35 gl kunnen worden gepipetteerd in elk putje. Echter, als er veel belletjes tijdens pipetteren worden waargenomen, merken> 50 ul per put, anders bereikt de luchtbellen naar beneden in de cellen en blok antilichamen binden. Overmatige zeep bubbels verschijnt als een ongekleurde ronde plek in het midden van de put. Probeer de pipetteren aanpassen indien dit zich voordoet.
- Incubeer in deze blokkerende oplossing gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur.
Opmerking: 5% bovine serum albumine of normale sera van dezelfde soort als het secundaire antilichaam kan ook worden gebruikt als oplossingen blokkeren om te besparen op de kosten van de vis serum blok. Blokkeren oplossingen kunnen prestaties van het antilichaam beïnvloeden. Dus de optimale blok voor elk antilichaam best empirisch bepaald.
Opmerking: Sommige onderzoekers plaatsen In-Cell westerse platen op shakers tijdens incubatie. Dit is echter niet noodzakelijk.
- Maak de primaire antilichamen 1:10.000 verdunning van anti-α-tubuline(Monoklonale, tabel 1) en 1:2000 verdunning van anti-MAP2 (monoklonaal, tabel 1). Deze antilichamen zijn specifiek voor de eiwitten van belang in deze cellulaire modellen, specificiteit is essentieel voor immunocytochemische kleuring.
Opmerking: MAP2 is een merker voor neuronen en is geschikt voor gemengde neuronale / gliale culturen. De postnatale culturen hier getoonde bevatten ook een aantal glia (~ 25%), omdat astrocyten verschijnen eerst op embryonale dag 18, met hun nummers een piek in de vroege neonatale periode 27,28. Men kan geen onderscheid maken tussen astrocyten en neuronen in de ATP en DRAQ5 + Sapphire assays. Om neuronen en astrocyten gescheiden, gelijktijdig gebruik MAP2 en GFAP kleuring in de 800 en 700 nm kanalen, zoals beschreven door Mullett en collega 4,29, weglaten DRAQ5 + Sapphire. Echter, als alle cellen in de cultuur wensen te worden beoordeeld, gebruik dan een pan-cellulaire marker zoals α-tubuline, β-actine, of GAPDH.
Opmerking: Deze verdunningen werden geoptimaliseerd voor de N2a en primaire corticale cellen en niet generaliseren naar elk model. Daarom proberen ten minste twee primaire antilichaam verdunningen, een aan de linkerhelft van de plaat en een aan de rechterhelft (zie figuur 2B). Als alternatief, probeer dan 3-4 verdunningen van primaire antilichamen op 3 putten elk. Bijvoorbeeld kan de aanbevolen verdunning van het antilichaam inlegvel worden geflankeerd met tweeledig veranderingen. Met andere woorden, als de aanbevolen verdunning voor immunocytochemie 1:500, 1:250 en ook proberen 1:1000 verdunningsfactoren.- Verdunnen antilichamen in 01:01 Odyssey block: PBS en voeg 0,3% Triton-X. Om te besparen op de kosten, proberen om de antilichamen in de blokkerende oplossing werd aangebracht op de cellen in stap 3.2.1 door het verwijderen van deze oplossing aan het eind van de incubatie. Houd de cellen in PBS terwijl je dit doet, ze moeten niet uitdrogen.
- Incubeer in primaire antilichamen of 1-2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. Voor zwak bINDENDE antilichamen en eiwitten die niet in overvloed zijn, kan 's nachts incubaties helpen verhogen signaal.
Opmerking: Laat minstens 3 putten in het blokkeren oplossing voor achtergrond aftrekken bij elke secundaire concentratie antilichaam (putten 2B-2D en putten 2E-2G in figuur 2B). Mis deze putten niet helemaal bloot aan primaire antilichaam. Zij onthullen de mate van specifieke binding van het secundaire antilichaam en zijn bruikbaar voor berekeningen van signaal-ruisverhoudingen. Als er een bezorgdheid dat de secundaire antilichamen leidt tot hoge specifieke binding, ook controleputjes die niet zijn blootgesteld aan de primaire of secundaire antilichaam maar ontvangen hetzelfde aantal wasbeurten. Het verschil tussen deze putten en "secundaire enige" putten onthullen de mate van specifieke binding door het secundaire antilichaam alleen. In onze test op de muis N2a cellen, signaalintensiteit met anti-muis secundair antilichaam alleen was 0,557 ± 0,032, signaal met anti-konijnsecundaire antilichaam alleen was 0,533 ± 0,041, signaleren zonder secundaire antilichaam werd 0.357 ± 0.003 en signaal met primaire en secundaire antilichamen was 11,867 ± 0,911. We hebben dus niet waargenomen hoge specifieke binding zelfs bij gebruik van anti-muis secundaire antilichamen op muizencellen. Er zijn verschillende fabrikant voor infrarood secundaire antilichamen, adviseren wij alleen het kopen van de zeer cross-geadsorbeerd Ones. Merk op dat de concentratie van secundaire IgG antilichamen kunnen variëren afhankelijk van de bron.
- Afwassen primaire antilichamen met 3 wasbeurten van 200 ul PBS per well, 10 minuten elk. Primaire antilichamen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor een paar weken in 0,2% natrium azide en hergebruikt tot kleine vlekken van vuil worden duidelijk wanneer de oplossingen worden tegengehouden aan het licht. Dit wordt alleen gedaan om te besparen op de kosten. Als de kosten is geen probleem, maak verse antilichamen voor elk gebruik.
- Verdun de secundaire antilichaam door 1:1000 of 1:2000 in 01:01 Odyssey block: PBS met 0,3% Triton-X (Figuur 2B). Voeg de 1:1000 verdunning tot de bovenste helft van de plaat en 1:2000 de onderste helft van de plaat. Deze concentraties kunnen verder worden verlaagd om te besparen op de kosten, maar vraagt lineariteit voor het plegen van dit.
Opmerking: Zorg ervoor dat u de juiste secundaire antilichaam oplossing voor de achtergrond aftrekken putten (kolom 2 in figuur 2B) toe te voegen.- Als een tweede eiwit wordt getest in plaats van DRAQ5 + Sapphire, label cellen voor α-tubuline of MAP2 aan 700 nm geit anti-muis IgG en de tweede eiwit in het 800 nm kanaal met primaire antilichamen van een andere muis species. De 800 nm kanaal heeft minder achtergrond dan de 700 nm kanaal en moet worden gereserveerd voor de meest kritische eiwit van belang.
- Incubeer in secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een lade tegen licht.
- Afwassen secundaire antilichamen met 3 wasbeurten van 200 ul PBS per well, 10 minuten elk.
- Maak de DRAQ5 + Sapphire oplossingen. In de linkerhelft van de plaat verdund DRAQ5 1:10.000 (0,5 uM uiteindelijke concentratie) en Sapphire 1:1000 in PBS met 0,3% Triton-X (kolommen 3 - 6, Figuur 2B). Voor de rechter helft van de plaat, verdunnen DRAQ5 1:20.000 (0,25 uM) en Sapphire 1:2000 (kolommen 7-10; Figuur 2B).
Opmerking: DRAQ5 gebruikt worden verkocht tegen een 1 mM voorraad in plaats van een 5 mM voorraad. Sommige eerder gepubliceerde rapporten daarom gebruikt 1:4000 of 1:2000 verdunningen van DRAQ5 8.- Om te besparen op de kosten, wanneer twee platen tegelijk worden getest, kan dezelfde DRAQ5 + Sapphire oplossingen worden gebruikt op twee platen in volgorde pipetteren het uit de eerste plaat en toevoegen aan de tweede. Als dezelfde oplossingen tweemaal op deze wijze wordt gebruikt, gebruik ze binnen een dag. Verdund DRAQ5 + Sapphire oplossingen kunnen niet worden opgeslagen bij 4 ° C of voor later gebruik bevroren.
- Incubeer in deze oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur weg from licht. Als de tijd kort is en de DRAQ5 + Sapphire oplossingen niet toepasbaar andere platen met verschillende secundaire, voeg deze vlekken aan het secundaire antilichaam oplossing in stap 3.5 en incubeer gedurende 1 uur.
Opmerking: DRAQ5 + Sapphire oplossing toevoegen achtergrond aftrek putjes (kolom 2 in figuur 2B) als deze putten niet worden gekleurd in het 700 nm kanaal.
- Was de plaat 3x met 200 ul PBS per well gedurende 10 minuten elk. Doe 0,2% natriumazide in PBS laatste wassing als de plaat zal worden gekleurd met andere zichtbare bereik secundaire antilichamen na de infrarood imaging voltooid.
- Scan de plaat op een Odyssey Imager. Begin met het scannen van de platen bij intensiteit 5 en 169 mm resolutie. Ofwel "gemiddelde kwaliteit" of instellingen "lage kwaliteit" zijn voldoende. Het bedrijf geen gedetailleerde excitatie / emissie filter informatie vrij te geven. De emissiefilters ongeveer 20 nm breed zijn gecentreerd rond 720 en 820 nm, volgens de fabrikant.
Opmerking: Het is mogelijk om platen te scannen terwijl het nog nat als onderzoekers wenst te blijven om ze te kleuren met andere markers. Echter, het bedrijf stelt in zijn online protocol dat droge platen resulteren in minder well-to-well signaal verspreiden. Als je ze allebei nat en droog vervolgens de gegevens te vergelijken scannen, moet u alle de PBS uit de put te verwijderen omdat de resterende zouten na verdamping kan leiden tot hoge achtergrond fluorescentie langs de randen.- De Odyssey Imager scant en door de onderkant van de plaat. Platen van verschillende fabrikanten kunnen verschillende offsets aandacht vereisen vanwege de bodem van de putjes kunnen variëren in de dikte en diepte in de plaat. Probeer te scannen op andere focus offsets en zien waar de hoogste signaal-ruisverhouding en helderste (meest in beeld) signaal wordt bereikt: 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 mm. Probeer ook om de diepte van de put te meten van de bodem van een plaat met een liniaal om de Findin bevestigengs op de Odyssee. Vergeet niet dat het plastic in de bodem van de put extra hoogte kan toevoegen liniaalmaateenheden. De Costar platen gebruikt in de onderhavige studie vereisen een focus offset van 4,0 mm.
- Gebruik de In-Cell westerse functie in de software om de juiste maat raster te plaatsen op het beeld van de plaat en de gegevens te exporteren naar Microsoft Excel. Onderzoek de "geïntegreerde intensiteit" waarden van dezelfde putjes in andere focus offsets voor de hoogste fluorescentie waarden vinden. De focus offset die de hoogste signaal-ruisverhouding (signaal immuun-versus putjes "geen primaire negatieve controle" putjes) levert is een om hierna te kiezen.
- Zodra men de focus offset wordt besloten, opnieuw scannen in kleinere stappen. Als bijvoorbeeld de helderste signaal was 3,5 en 4,0 mm, probeer scannen met 3,6, 3,7, 3,8, en 3,9 mm en of er verdere verbetering van de signaalsterkte. Als de focus offset is fout, signaal intensiteiten over de 12 kolommen op een lege platen (wanneer alle kolommen gelijk signaal zou moeten hebben) zal verschijnen als een U-vormige curve in plaats van een vlakke lijn. Als dit nog steeds een probleem met plastic borden, probeer met glazen bodem platen.
- Trek de gemiddelde van de geïntegreerde intensiteiten op de achtergrond aftrekking putjes (Figuur 2B, putten 2B - 2D of boorputten 2E - 2G) van elke overeenkomstige gegevenspunt in de 700 en 800 nm kanalen. Gemiddeld dan de geïntegreerde signaal intensiteiten voor elke groep putten. Plot de gegevens als een puntenwolk tegen celdichtheid (zie figuur 3).
- Vergelijk de resultaten van de twee verschillende verdunningen van primaire en secundaire antilichamen en de resultaten van de twee verschillende verdunningen van DRAQ5 + Sapphire om zich te vestigen op een verdunning stuk voor de volgende experimenten. Als lineariteit niet bereikt, probeer scannen met een verschillende intensiteit. Opnieuw te scannen met intensiteiten 3 en 7 in plaats van 5 en opnieuw analyseren van de gegevens. Als de gegevens te verbeteren op een van deze intensiteiten maarzijn nog steeds niet bevredigend is, opnieuw scannen in stappen rond die intensiteit.
- Wees voorzichtig niet te beelden waar de software toont witte vlekken in de putten te analyseren; die plekken betekenen verzadigde signaal buiten het bereik van de imager. Scan met een lagere intensiteit als dit gebeurt.
- Als lineariteit niet bereikt, ook proberen om de cellen vast te stellen binnen 6 uur in de platen om problemen groeien of sterven ongelijk in verschillende kolommen overnacht. Probeer ook verschillende plating dichtheden, het scannen van verschillende intensiteiten, verdere optimalisaties van reagens dilutiefactoren, glazen bodem platen, DRAQ5 door zich als een alleen-kern vlek, of anders dan anti-α-tubuline of anti-MAP2 verschillende antilichamen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het snelheidsbeperkende factor in deze experimenten is de infrarood kleuring, de ATP test relatief korte duur. Voor de infrarood assays, verwachten we dat acht 96-well platen kan worden gekleurd en gescand binnen een dag door maar liefst twee partijen van vier borden elk (zie figuur 1). Deze schatting gaat uit 20 min van fixatie, 30 min. van het wassen, 30 min van het blokkeren, 2 hr primaire antilichaam incubatie gevolgd door 30 min wasbeurten, 1 uur secundair antilichaam incubatie gevolgd door 30 min wasbeurten, 30 min DRAQ5 + Sapphire gevolgd door 30 min wasbeurten, en 34 min van de scantijd voor 4 borden. Vijftien extra minuten zijn verwerkt in Figuur 1 voor wasbeurten om rekening te houden met de gespreide pipetteren van vier afzonderlijke platen. Tijd voor data-analyses is niet in deze schatting meegenomen. Als ATP-test metingen zullen optreden in parallel voor elk infrarood plaat, kan twaalf platen worden getest in een dag - zes voor de infrarode vleks en zes voor ATP.
Criteria voor nodige gegevens in de regressie analyse (Figuur 3), zoals vermeld in het protocol bevatten een significante correlatie tussen plating dichtheid en signaalsterkte (tweezijdige p ≤ 0,05). De grootte van de wijzigingen in luminescentie of infraroodsignaal moet ook evenredig met de veranderingen in het aantal cellen. Idealiter 5k cellen ongeveer de helft van de luminescentie of ATP-niveaus van cellen 10k en 15k cellen een ongeveer 50% hogere waarden hebben dan 10k cellen, enz. Deze evenredigheid geeft de gevoeligheid van de assay en verschilt van de waarde R2 of determinatiecoëfficiënt. R2 alleen meet hoe goed de regressielijn benadert de ware datapunten. Zelfs als de gegevens lineaire, kan de relatieve veranderingen in sterkte signaal in verhouding tot de omvang van de veranderingen in het aantal cellen. Dit kan gebeuren wanneer de regressielijn heeft een hoge R2, maar een lage helling, wat suggereert dat de test is niet erg gevoelig. De criteria van significante correlatie en evenredigheid van de gegevens moet zowel worden voldaan. Tenslotte moet veranderingen in signaalsterkte rond de optimale beplating dichtheid binnen het dynamische bereik van het instrument en de analyse valt. Het dynamisch bereik is de verhouding tussen de grootste en de kleinste mogelijke waarden. De Odyssey imager heeft een 4,5 log dynamisch bereik en verzadigde signaal zien als een heldere witte kleur in plaats van de gebruikelijke rode of groen om de onderzoeker dat de resultaten niet meer meetbaar te waarschuwen. Het dynamisch bereik tijdens de test zelf smaller vanwege aspecten zoals maximale en minimale plating densiteit voor een bepaald celtype. Als men platen bij toenemende cel dichtheden, zal de verzadigingscurve voor deze assays onthullen de plating dichtheden waarboven geen verschillen kunnen worden opgelost, hetzij omdat ze uitbereik van de imager of omdat de cellen de verdringing niet 's nachts wel overleven. Evenzo, als men platen afnemende cel dichtheden, kan men de minimale cel dichtheden waaronder er geen verdere veranderingen in het signaal te meten. Het dynamische bereik van de assay omvat alleen de beplating dichtheid tussen de minimum en maximum aantal cellen / putje dat kan worden opgelost. We hebben niet gemeten het volledige dynamische bereik voor deze specifieke assays omdat onze cellen niet goed overleven dichtheden dan die gerapporteerd.
Na optimalisatie we nu vlekken N2a muis neuroblastoma cellen met anti-α-tubuline bij een 1:10.000 verdunning met anti-muis IgG bij een 1:2000 verdunning en DRAQ5 + Sapphire oplossingen op 1:20.000 en 1:2000, respectievelijk. We gebruiken ook 25 ul van de ATP testreagentia in 50 ul medium. De resultaten van deze voorwaarden wordt geïllustreerd in Figuren 3A, B en C zijn befor gepubliceerde 8. Signaalsterkte in alle drie proeven was significant gecorreleerd met het aantal cellen per putje. Hoewel alle drie de tests waren zeer lineair, ze waren niet gelijk in gevoeligheid. Zo heeft 5k cellen per putje niet precies de helft van de hoeveelheid infrarood vlekken hebben als 10k cellen per putje. In tegenstelling tot de infrarood assays, ATP test was gevoelig voor veranderingen in uitplaatdichtheid. Met andere woorden, luminescentie daalde met ongeveer de helft van 10k naar 5k en van 5k tot 2.5k cellen per putje. Ondanks deze bevindingen de hoogste gevoeligheid van de ATP test het beste alle drie testen voor levensvatbaarheid uitvoeren om een breder beeld van cellulaire gezondheid.
We hebben nu vlek rat primaire neuronale kweken met anti-MAP2 in een 1:2000 verdunning van anti-muis IgG bij een 1:1000 verdunning en DRAQ5 + Sapphire oplossingen op 1:10.000 en 1:1.000, respectievelijk, en gebruik 25 pl van de ATP testreagentia in 50 ul medium (figuren3D, E en F). Signaalsterkte in de DRAQ5 + Sapphire test was de minst lineair van drie tests omdat er weinig verschil tussen 100k en 200k cellen per putje in het 700 nm kanaal. Echter, signaalsterkte bij 700 nm was goed in verhouding tot het aantal cellen onder 100k cellen per putje en we altijd plaat neuronale culturen op 100k cellen per putje toch. Toch hebben wij waargenomen dat de DRAQ5 + Sapphire test is niet zo gevoelig toxine behandelingen als de andere twee assays (zie hieronder). In tegenstelling tot DRAQ5 + Sapphire, signaalsterkte was in betere verhouding met plating dichtheden voor zowel de MAP2 en ATP assays. Opgemerkt wordt dat een groter volume van de ATP testreagentia de resultaten verbeteren bij 200k cellen per putje. Met andere woorden, luminescerende uitgang verhoogd tot exact 200% van de waarden 100k cellen per putje omdat er meer reagens. Echter, we nooit plaat corticale culturen op dat hoge uitplaatdichtheid voor experimegen. We hebben ook gevonden dat MAP2 en ATP niveaus zijn gevoelig voor 20% veranderingen in neuronale neocortical plating dichtheid variërend van 20k cellen per putje tot 120k cellen per putje 22. Niettemin moeten andere onderzoekers deze testen te testen in hun eigen laboratorium in plaats van de optimale omstandigheden van onze experimenten vanwege inter-lab variabiliteit in weefsel en cellen handling.
Ter illustratie van de bruikbaarheid van deze assays volgende behandelingen met giftige stoffen tonen wij dosis-respons curven van N2a cellen behandeld met MG132, een proteasoom inhibitor (figuur 4). MG132 werd toegepast in aanwezigheid of afwezigheid van de glutathion voorloper N-acetylcysteïne. Deze gegevens zijn ook te vinden in onze recente publicatie over de beschermende effecten van N-acetylcysteïne 30. Cellen werden bepaald 48 uur na MG132 behandelingen. MG132 dosisafhankelijk verlaagd DRAQ5 + Sapphire signaal (figuren 4A, D) en α-tubuline signaal (
Volgens de Cell Titer Glo test werden ATP opgewekt bij lage concentraties MG132 (figuur 4C), waaruit blijkt dat ATP niet noodzakelijkerwijs evenredig met celtiter bij behandeling. De ATP gegevens zijn niettemin nuttig omdat zij illustreren dat N-acetylcysteïne beschermt metabolische functie bij N2a cellen behandeld met MG132. Dit blijkt in tHij verschuiving van de IC50 waarde van MG132 met N-acetylcysteïne. De IC50 waarde voor ATP was 3,05 pM MG132 (logica 50 = 0,48 ± 0,07, R2 = 0,8616, Hill helling = -1,0) met vehikel en 9,12 uM MG132 met N-acetylcysteïne (logica 50 = 0,96 ± 0,04, R2 = 0,9261, Hill helling = -1.0). Merk op dat de concentraties die tot stijging van ATP werden uitgesloten van deze analyse. Inclusief alle waarden in de analyse verlaagde de determinatiecoëfficiënt en verhoogde de IC50 waarden 4,03 uM MG132 (logica 50 = 0,61 ± 0,09, R2 = 0,7224, helling = -1,4) in de aanwezigheid van het voertuig en 9,24 uM MG132 (logica 50 = 0,96 ± 0,07, R2 = 0,6607, helling = -2,1) in aanwezigheid van N-acetylcysteïne (contrast figuur 4C).
Een tweede voorbeeld van deze drie tests wordt geïllustreerd primaire culturen Figure 5. Weefsel werd gemicrodissecteerde van rat neocortex en allocortex, gedissocieerd, verguld op 100k cellen per putje, en behandeld in parallel met H 2 O 2. Wij testten de hypothese dat deze twee hersengebieden zouden verschillen in hun behandeling van oxidatieve stress ze differentieel kwetsbaar voor neurodegeneratieve ziekten 34-39. Sommige van deze gegevens eerder gepubliceerd en de resultaten worden verder besproken in deze studie 22. De IC50 waarden voor DRAQ5 + Sapphire waren 22,84 uM H 2 O 2 in neocortex (logica 50 = 1,36 ± 0,07, R2 = 0,7552, Hill helling = -0,95) en 24,63 uM H 2 O 2 in allocortex (logica 50 = 1,39 ± 0.03, R 2 = 0,9379, Hill helling = -1.74). De IC50 waarden voor MAP2 waren 11,66 uM H 2 O 2 in neocortex (logica 50 = 1,07 ± 0,04, R2 = 0,9332, Hill helling = -2,13) en 29.76 uM H 2 O 2 in allocortex (Logic 50 = 1,47 ± 0,04, R2 = 0,8934, Hill helling = -4,45). De IC50-waarden voor ATP was 23,82 uM H 2 O 2 in neocortex (logica 50 = 1,38 ± 0,03, R2 = 0,8907, Hill helling = -2,56) en 44,5 uM H 2 O 2 in allocortex (logica 50 = 1.65 ± 0.03 , R 2 = 0,9204, Hill helling = -2.71). Allocortex was significant beter bestand tegen oxidatieve stress dan neocortex bij concentraties van H 2 O 2 onder 50 uM, maar de DRAQ5 + Sapphire test was het minst gevoelig illustreren dit verschil. Dit kan wijzen dat de laatste test niet glia kan onderscheiden van neuronen, in tegenstelling tot MAP2. Zoals eerder vermeld, onze culturen bevatten enkele glia, aangezien zij van postnatale hersenen 22 geoogst. Verrassend, bij hoge concentraties H 2 O 2 (75 uM en hoger), wanneer alle MAP2
Ten slotte, om de variabiliteit intraplaat met alle drie testen illustreren we uitgezet de tweede en derde putjes "ruwe datapunten van de bovengenoemde dosis respons curven in figuren 6A-C en 6G-I >. Evenzo, teneinde de Interplate variabiliteit illustreren we uitgezet de gemiddelde ruwe datapunten (het gemiddelde van de drievoudige putjes) van twee platen in de Figuren 6D-F en 6J-L. Signaalsterkte in herhalingsputjes en over onafhankelijke experimenten vertoonden significante correlaties voor elke maatregel. Er was enige variatie in rauwe waarden in de onafhankelijke experimenten in primaire neuronale culturen, misschien omdat we hergebruiken oude antilichaam en DRAQ5 + Sapphire oplossingen en opnieuw invriezen ongebruikte ATP bepalingsreagentia een paar keer. Een andere reden voor de hogere Interplate variabiliteit in primaire, kan de kwaliteit van de kweek zelf. Variërend postmortem intervallen en weefsel behandeling in verschillende experimentele dagen kan bijdragen aan variantie.
jpg "/>
Figuur 1. Schematische weergave van drie levensvatbaarheid assays (A) en de tijdlijn voor infrarood assays (B). Weergegeven zijn de aanbevolen procedures voor N2a cellen. Als DRAQ5 + Sapphire oplossingen niet zullen worden hergebruikt op andere platen die worden gekleurd met verschillende secundaire antilichamen, kunnen ze worden gecombineerd met het anti-muis secundair antilichaam voor een uiteindelijke 1 uur incubatie, het verminderen van de procedure met een stap. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Plaatformaat van de ATP-bepaling (A) en infrarood assays (B) die worden beschreven in de sectie Procedures. Hoewel96-well plaat is geïllustreerd, deze testen kunnen worden aangepast aan andere formaten, zoals 384 putjes, om te besparen op reagentia en cellen. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Lineaire regressie voor alle drie levensvatbaarheid assays N2a muis neuroblastoma cellen (A, B, C) of primaire postnatale rat neocortex neuronen (D, E, F). Signaalsterkte voor elke assay wordt uitgezet als functie van uitplaatdichtheid. Inzetstukken tonen vertegenwoordiger infraroodbeelden van de DRAQ5 + Sapphire (A, D), α-tubuline (B), of MAP2 (E) vlek. Rauwe intensiteit waarden staan onder elke afbeelding. Merk op dat ruwe waarden ineen individuele en kunnen afwijken van de gemiddelde 3 putjes voor die proef en het gemiddelde van 3-4 onafhankelijke experimenten. De originele infrarood beelden werden pseudocolored rood (700 nm) of groen (800 nm). Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd putten en herhaalde 3x voor DRAQ5 + Sapphire in zowel N2a cellen en primaire neuronen, 3x voor α-tubuline, 4x voor MAP2, 3x voor ATP in N2a cellen, en 4x voor ATP in neuronen. De gegevens van de drievoudige putjes werden gemiddeld om een definitieve waarde voor elk van 3-4 experimenten. De gemiddelde en SEM van 3-4 deze eindwaarde wordt weergegeven in de grafiek. Merk op dat de DRAQ5 + Sapphire waarden vertonen een lage standaarddeviaties zodat SEM balken niet zichtbaar zijn. De R2 determinatiecoëfficiënt en tweezijdige p-waarde bepaling van de significantie van de correlatie wordt ook geïllustreerd voor elke maatregel. De gegevens werden geanalyseerd in GraphPad Prism (versie 5.0). Herdruk van Neurochemistry International, 61, door UnnithEen et al.: "Redding uit een twee hit high-throughput-model van neurodegeneratie met N-acetylcysteïne," blz. 356-368, met toestemming van Elsevier. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 4. Bescherming van N2a cellen tegen MG132 toxiciteit. N2A cellen werden behandeld met de aangegeven concentraties proteasoomremmer MG132 in aanwezigheid of afwezigheid van de antioxidant N-acetylcysteïne (NAC, 3 mM). 48 uur later werden alle drie de levensvatbaarheid tests uitgevoerd. Let op de stijging van ATP-gehalten bij lage concentraties MG132 (C). Geen parallelle toename van DRAQ5 + Sapphire kleuring (A) or α-tubuline (B) was duidelijk. Vertegenwoordiger infraroodbeelden van de DRAQ5 + Sapphire en α-tubuline vlekken waren rood en groen pseudocolored in D en E, respectievelijk. Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd putten en herhaald 4x voor DRAQ5 + Sapphire, 4x voor α-tubuline, en 3x voor ATP. De gegevens van de drievoudige putjes werden gemiddeld om een definitieve waarde voor elk van 3-4 experimenten. De gemiddelde en SEM van deze eindwaarden 3-4 weergegeven. * P ≤ 0,05 voor vergelijking van N-acetylcysteïne versus water, Bonferroni correctie als gevolg van twee-weg ANOVA. De gegevens werden geanalyseerd in GraphPad Prism (versie 5.0). Herdruk van Neuroscience, 255, door Jiang et al.: "N-acetylcysteïne joints proteotoxicity in een heat shock protein-afhankelijke manier," blz. 19-32, met toestemming van Elsevier. Clik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 5. Differentiële kwetsbaarheid van neocorticale en allocortical culturen toxiciteit waterstofperoxide. Microdissections van postnatale primaire motorische en sensorische neocortex en van Entorinale en piriformiscarcinoom allocortex werden gedissocieerd en uitgeplaat bij 100k cellen per putje. Op dag 2 in vitro, werden cellen behandeld met de aangegeven concentraties van H 2 O 2. 48 uur later werden de platen getest. Merk op dat allocortex overleeft deze kweekomstandigheden beter dan neocortex en heeft een hogere aantal cellen in de uitgangssituatie. Elk experiment werd in drievoud uitgevoerd putten en herhaald 4x voor DRAQ5 + Sapphire, 3x voor MAP2, en 6x voor ATP. De gegevens van de drievoudige putjes werden gemiddeldvoor een eindwaarde voor elk van 3-6 experimenten. De gemiddelde en SEM van deze eindwaarden 3-6 weergegeven. * P ≤ 0,05 voor vergelijking van de neo-versus allocortex, Bonferroni correctie als gevolg van twee-weg ANOVA. De gegevens werden geanalyseerd in GraphPad Prism (versie 5.0). Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 6. Intraplate en Interplate correlaties voor MG132 en H 2 O 2 dosis-respons curven in N2a cellen en corticale neuronen. Alle individuele experimenten werden uitgevoerd in drievoudige putjes. Ruwe gegevens van de tweede twee putjes in elke groep werden uitgezet als herhaling 1 en 2 reproduceerbaarheid te meten binnen de platen (A,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij hebben gevonden dat signaalsterkte in alle drie levensvatbaarheid assays lineair en gecorreleerd met plating dichtheid. Echter, niet alle testen zijn even gevoelig voor 2-voudige en 1,5-voudige veranderingen in uitplaatdichtheid. Voor N2a cellen, de infrarood testen zijn minder gevoelig dan de ATP-bepaling, met name bij lagere dichtheden plating. Hoewel de infrarood testen zijn minder gevoelig dan ATP, de DRAQ5 + Sapphire assays en de α-tubuline assays zijn goed overeen doordat zij onthullen de zeer beschermend effect van N-acetylcysteïne. Het dosis-responsieve verlies van infrarood signaal met beide testen en alle drie levensvatbaarheid curven werden verschoven naar rechts met N-acetylcysteïne. Deze overlap niet altijd waargenomen voor alle soorten behandelingen N2a cellen als α-tubuline en ATP tests lijken gevoeliger voor verbindingen zoals ammoniumchloride dan DRAQ5 + Sapphire assay (zie figuur 4 Unnithan et al. zijn. 8 ). Zo levensvatbaarheid phenotypes niet altijd gelijk vertegenwoordigd door alle drie testen. Hoewel het ATP-test was in betere verhouding tot het aantal N2a cellen uitgeplaat dan de α-tubuline en DRAQ5 + Sapphire assays, de veronderstelling dat de signaalsterkte weerspiegelt het aantal cellen werd niet altijd gehaald na toxine behandeling. ATP niveaus namen bij toxine concentraties die niet een soortgelijke stijging van het signaal in het infrarode tests lieten lokken. Deze gegevens tonen compenserende metabole veranderingen in N2a cellen in reactie op proteasoomremming en zijn bruikbaar op zichzelf. De U-vormige ATP dosis-respons curve is karakteristiek voor het fenomeen hormesis. Hormese wordt gedefinieerd als gunstige biologische reacties op low-level blootstelling aan toxines en andere stressoren 40-42.
Voor neuronen, de DRAQ5 + Sapphire vlek was minder gevoelig dan de MAP2 en ATP-testen bij hoge plating dichtheden. Echter, de DRAQ5 + Sapphire, MAP2 en ATP testen waren goed in verhouding tot cell nummer in primaire corticale neuronen op of onder 100k cellen per putje. We plaat neuronen bij 100k cellen per putje. Neuronen van cortex zijn niet bekend te repliceren, daarom waren we meer bezorgd over lineariteit bij 100k of lager plating dichtheden. De DRAQ5 + Sapphire test minder gevoelig voor verschillen tussen neocortex en allocortex dan of MAP2 of ATP bij concentraties onder 50 uM H 2 O 2. Bovendien heeft ATP minder dramatisch val op H 2 O 2 behandeling infrarood signaal in de andere twee assays wellicht opnieuw suggereert compenserende toename in ATP productie. De verschillen tussen de drie tests in N2a cellen en primaire neuronen kunnen weerspiegelen die cellulaire functies kunnen veranderen voordat bruto anatomische structuren worden aangetast, en dat celstructuren, waaronder cytoskeleteiwitten, kan beïnvloed worden lang voordat de cellen zelf verloren. Recente gegevens over multiplex levensvatbaarheid assays door Gilbert en collega overtuigendillustreren dat verschillende levensvatbaarheid maatregelen zoals Hoechst nucleaire kleuring en ATP-metingen ook informatie over specifieke cellulaire kenmerken die slechts gedeeltelijk en indirect levensvatbaarheid weerspiegelen als geheel 26. Wij adviseren daarom het uitvoeren van alle drie de tests tegelijk en niet te vertrouwen op een enkele test voor metabole levensvatbaarheid als vele publicaties te doen. Voor meer informatie over een van deze maatregelen, raden wij tellen individuele cellen en vervolgens beoordelen van cytoskelet eiwit expressie en ATP niveaus in functie van het aantal cellen.
Hoewel er andere metabole testen voor levensvatbaarheid, zoals MTT, het voordeel van de ATP bepaling ligt in de gevoeligheid en dynamisch bereik. De MTT test kan het aantal levensvatbare cellen overschatten vergeleken ATP metingen en vertoont een IC50 die tweemaal hoger 43. Bovendien Petty en zijn collega's gemeld dat de ATP-test kondetecteren de ondergrens van 1563 cellen per putje, terwijl de MTT-test niet minder dan 25k cellen / putje 12 kunnen detecteren. De signaal-ruisverhouding (signaal van putjes met levende cellen versus putjes zonder cellen) slechts 7 voor MTT maar 230 voor ATP 44. Een ander voordeel van luminescerende ATP testen via MTT is dat de incubatietijd is veel korter. Daarnaast is de MTT-test van Promega kost 0,28 ¢ per putje, terwijl de celtiter Glo test van dezelfde fabrikant kost 0,09 ¢ per goed bij onze aanbevolen verdunningen. Er zijn echter beperkingen aan alle metabolische assays, metabolische activiteit losgekoppeld van overleving, vooral tijdens necrose. Als dit een probleem is, kunnen de analyses in dit rapport worden gecombineerd met metingen van lactaat dehydrogenase vrijlating tot verlies van membraan integriteit vast te stellen. Dit zou geen extra platen omvatten, zoals lactaat dehydrogenase metingen gewoon in het extracellulaire medium.
Hoewel we presenteren deze testen als alternatief voor handmatige tellingen op de microscoop, kan de laatste zijn van een zeer gevoelige en nauwkeurige middel van steekproeven mobiele nummer indien goed uitgevoerd. Inderdaad, verwachten wij dat tellingen van Hoechst-gekleurde kernen meer gevoelig voor kleine veranderingen in N2a cel nummer dan de DRAQ5 + Sapphire test zou zijn. Wanneer alle assays niet de lineariteitstest versnellingsbak tellingen essentieel. Een goed voorbeeld hiervan is onze gekweekte primaire astrocyten model, waarop we voeren de meer bewerkelijke handmatige telt 45. Wel moet de inherente biases van handmatige tellingen worden gehouden bij het interpreteren van celgetalgegevens, net als de inherente gebreken van geautomatiseerde tests niet aan de kant moet worden geborsteld. Een aantal sterke en zwakke punten van de levensvatbaarheid assays worden daarom hieronder beschreven.
Ten eerste, als DAPI of Hoechst vlekken in dienst zijn, gekrompen en gecondenseerde kernen worden vaak aangeduid alsapoptotische 1. Echter, celgrootte en condensatie van kernen liggen langs een gladde continuüm. In tegenstelling, leven en dood elkaar uitsluiten, binaire fenomenen. Tenzij twee zeer verschillende groepen van levende of stervende cellen worden waargenomen, lijkt het het beste om alle cellen onder een drempel nucleaire diameter als apoptotische met imaging software zoals MetaMorph of ImageJ in plaats van door de ogen tellen. Natuurlijk, de keuze voor een drempel diameter is arbitrair, omdat we niet weten op welk punt een onomkeerbare apoptotische cascade wordt geïnitieerd. Bovendien, per definitie, zelfs cellen met geactiveerde caspase 3 niet noodzakelijkerwijs op weg naar de dood en moeten wellicht worden beschouwd als nog levend ten tijde van bevestiging 46. De infrarood assays voorkomen dat dergelijke problemen door behandeling van alle cellen die aan de plaat bij de fixatie als nog leeft. Alleen cellen die weg hebben gedreven worden geteld als dood. Dit plaatst cellen in een van twee verschillende categorieën en vermijdt de valkuilen van het gebruik van een complex, continue functie als nucleaire diameter.
Tweede handmatige tellingen monster slechts een klein deel van de gehele put. Dit kan leiden tot bemonstering vooroordelen en, bij gelegenheid, hoge standaard fouten van het gemiddelde. Met onze levensvatbaarheid assays wordt de gehele goed bemonsterd voor ATP en dichtbij de gehele put wordt bemonsterd met infrarood assays. Deze bemonstering patroon verhoogt steekproefgrootte en vermijdt de soms arbitraire beslissing van waar in de goed op een foto voor handmatige tellingen snap. Als de foto's worden genomen van het centrum van de put, moet men in gedachten houden dat deze regio is waar de meest wash-off van de cellen optreedt, wat leidt tot mogelijke overschattingen van toxiciteit. In tegenstelling, de infrarood assays gooien een raster op het beeld van de 96-well plaat die alleen uitsluit de uiterste hoeken van de putjes. Desgewenst kunnen de hoeken van de putjes worden opgenomen door de diameter van de cirkels in het raster.
Ten derde, de fotograaf en de cel teller moeten beide worden verblind tijdens handmatige tellingen. Echter, wanneer cellen worden behandeld met giftige stoffen, die vaak aan morfologische veranderingen die heel duidelijk zelfs een ongetrainde oog. Dit maakt het veel moeilijker onpartijdige te blijven. Blindheid is geen vereiste voor onze testen.
Ten vierde, handmatige tellingen zijn tijdrovend en kosten de belangrijkste onderzoeker meer in salaris. Salarissen zijn een van de hoogste kosten van het verrichten van onderzoek. De scantijd voor een plaat op de Odyssey ligt op slechts 8 minuten lang op de "gemiddelde kwaliteit" instelling en kan verder worden verlaagd over de instelling "lage kwaliteit". Opgemerkt zij dat de Odyssey Imager duur, zelfs wanneer een koopt een gebruikt demo, maar het is een eenmalige vaste kosten. Anderzijds heeft men ook investeren in relatief dure epifluorescentie microscopen handmatig celtellingen DAPI-of Hoechst gebeitst kernen. Ondanks de initiële kosten, de Odyssey Imager is een multifunctionele machine die ook maatregelen Western immunoblots op een kwantitatieve wijze 47,48. We hebben gebruik gemaakt van de Odyssey aangepast voor kwantificeringen van immunokleuring in macroscopische hersenstructuren zoals de rat of muis striatum of telencephalic cortex. Deze aanpak is ook gebruikt door anderen 49. Een zwakte van de Odyssey Imager voor tissue imaging is dat de hoogste resolutie is slechts 21 micrometer. Derhalve kan geen individuele cellen tellen en is niet bedoeld om fijnere anatomische details weergeven.
Tenslotte kan de infrarode assays niet gevoelig voor kleine veranderingen in celaantal handmatige tellingen. De IC50-waarden derhalve niet worden geacht met de concentratie die juist 50% verlies van cel nummers uitlokt, maar alleen als de concentratie die 50% verlies van infrarood signaal opwekt. Deze waarschuwing geldt waarschijnlijkalle levensvatbaarheid testen die individuele cel tellingen omzeilen door microscopie en proeven van de gehele goed in een keer. De onnauwkeurigheid die met deze assays functie van hypertrofie, atrofie of andere veranderingen in het uiterlijk die signaalsterkte beïnvloeden. Bijvoorbeeld, een aantal toxinen, α-tubuline immunoreactiviteit in elke cel kan stijgen als functie van toxiciteit. Wij hebben dit verschijnsel in N2a cellen behandeld met zeer hoge concentraties MG132 8 waargenomen. Indien dit van belang is, kunnen andere cytoskelet marker proteïnen, zoals β-actine en GAPDH gebruikt. Verder benadrukte N2a cellen hebben de neiging om bipolaire processen 8,50,51 vormen. Met veranderingen in celgrootte, zal fluorescerend signaal output per cel verschillen ook in de behandelgroepen. We raden-toxine behandelde cellen worden onderzocht door standaard hoge-resolutie microscopie na immunocytochemie voor dezelfde merkers zoals gebruikt in de in-cel Western. Als het cytoplasma verandert sterk in grootte na behandeling, maar dekern niet, raden wij u aan de DRAQ5 vlek zonder Sapphire alleen kwantificeren kernen. Toekomstige studies met verschillende kleurstoffen en met andere cytoskelet of andere overvloedige eiwitten gerechtvaardigd zijn om deze hindernissen te overwinnen.
We concluderen dat alle assays last van waarschuwingen en hebben zorgen over gevoeligheid, lineariteit, sampling error, signaal-ruis verhoudingen, menselijk vertekening of subjectiviteit, tijd en kosten verhoogd. Verder zijn alle analyses baseren op veronderstellingen die niet altijd wordt voldaan. Daarom raadzaam tenminste twee assays worden gebruikt om de effecten van de behandeling op celculturen beschrijven, die de gezondheid metabole en die steunt op anatomische levensvatbaarheid meet. Zo kan men beter bepalen of therapeutische verbindingen te beschermen zowel de structuur en functie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen van de auteurs hebben eventuele conflicten te onthullen.
Acknowledgments
Wij erkennen Juliann Jaumotte voor het idee van besparing op de volumes van reagentia in de ATP-test. Wij zijn zeer dankbaar voor de uitstekende administratieve ondersteuning van Maria Caruso, Deb Willson, en Jackie Farrer en de Mylan School of Pharmacy voor het verstrekken van financiële steun voor deze studies. Dank ook aan de Hunkele gevreesde ziekten Foundation en de Parkinson en Movement Disorders Foundation voor hun financiële ondersteuning van de primaire neuronale studies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Titer Glo | Promega | G7572 | Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks |
| 18% Formalin | Thermo-Shandon | 9990244 | Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells |
| Odyssey Block | LI-COR | 927-40003 | This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 21568 | We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | S468 | One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher | S373 | See above |
| Sodium Azide (250x) | Ricca Chemical Company | 7144.8-16 | Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris |
| Mouse anti-α-tubulin | Sigma-Aldrich | T5168 | This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific |
| Mouse anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M9942 | This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns) |
| 800 nm Goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50200 | This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM |
| Sapphire | LI-COR | 928-40022 | |
| Luminometer | PerkinElmer | VICTOR3 1420 multilabel counter | |
| Odyssey Imager | LI-COR | 9201-01 | |
| Shaker/Mixer | Research Products International | 248555 |
References
- Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
- Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G. Effects of GDNF on 6-OHDA-induced death in a dopaminergic cell line: modulation by inhibitors of PI3 kinase. J. Neurosci. 73, 105-112 (2003).
- Patonay, G., Antoine, M. Near-infrared fluorogenic labels: new approach to an old problem. Anal. Chem. 63, (1991).
- Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 deficiency in astrocytes selectively enhances mitochondrial Complex I inhibitor-induced neurotoxicity. J. Neurochem. 117, 375-387 (2011).
- Egorina, E. M., Sovershaev, M. A., Osterud, B. In-cell Western assay: a new approach to visualize tissue factor in human monocytes. J. Thromb. Haemost. 4, 614-620 (2006).
- Aguilar, H. N., Zielnik, B., Tracey, C. N., Mitchell, B. F. Quantification of rapid Myosin regulatory light chain phosphorylation using high-throughput in-cell Western assays: comparison to Western immunoblots. PLoS One. 5, (2010).
- Jinwal, U. K., Dickey, C. A. Cell-based assays for regulators of tau biology. Methods Mol. Biol. 670, 93-108 (2011).
- Unnithan, A. S., Choi, H. J., Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Rescue from a two hit, high-throughput model of neurodegeneration with N-acetyl cysteine. Neurochem. Int. 61, 356-368 (2012).
- Hoskins, C., Wang, L., Cheng, W. P., Cuschieri, A. Dilemmas in the reliable estimation of the in-vitro cell viability in magnetic nanoparticle engineering: which tests and what protocols? Nanoscale Res. Lett.. 7, 10-1186 (2012).
- Essner, M. D., Javed, A., Eleazer, P. D. Effect of sodium hypochlorite on human pulp cells: an in vitro study. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 112, 662-666 (2011).
- Sims, J. T., Plattner, R. MTT assays cannot be utilized to study the effects of STI571/Gleevec on the viability of solid tumor cell lines. Cancer Chemother. Pharmacol. 64, 629-633 (2009).
- Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
- Womac, A. D., Burkeen, J. F., Neuendorff, N., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Circadian rhythms of extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus cells and cultured astrocytes. Eur. J. Neurosci. 30, 869-876 (2009).
- Ataullakhanov, F. I., Vitvitsky, V. M. What determines the intracellular ATP concentration. Biosci. Rep. 22, 501-511 (2002).
- Iglehart, J. D., Silver, D. P. Synthetic lethality--a new direction in cancer-drug development. New Engl. J. Med. 361, 189-191 (2009).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Methods. 160, 81-88 (1993).
- Kangas, L., Gronroos, M., Nieminen, A. L. Bioluminescence of cellular ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. Med. Biol. 62, 338-343 (1984).
- Lundin, A., Hasenson, M., Persson, J., Pousette, A. Estimation of biomass in growing cell lines by adenosine triphosphate assay. Methods Enzymol. 133, 27-42 (1986).
- Sevin, B. U., et al. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol. Oncol. 31, 191-204 (1988).
- Maehara, Y., Anai, H., Tamada, R., Sugimachi, K. The ATP assay is more sensitive than the succinate dehydrogenase inhibition test for predicting cell viability. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 23, 273-276 (1987).
- Andreotti, P. E., et al. Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Res. 55, 5276-5282 (1995).
- Posimo, J. M., Titler, A. M., Choi, H. J., Unnithan, A. S., Leak, R. K. Neocortex and allocortex respond differentially to cellular stress in vitro and aging in vivo. PLoS One. 8, (2013).
- Carralot, J. P., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28, 261-268 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Oliver, D. G., Sanders, A. H., Hogg, R. D., Hellman, J. W. Thermal gradients in microtitration plates. Effects on enzyme-linked immunoassay. J. Immunol. Methods. 42, 195-201 (1981).
- Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS One. 6, (2011).
- Bayer, S. A., Altman, J. Neocortical Development. , Raven Press. (1991).
- Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54, 357-369 (2007).
- Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 knock-down in astrocytes impairs astrocyte-mediated neuroprotection against rotenone. Neurobiol. Dis. 33, 28-36 (2009).
- Jiang, Y., et al. N-Acetyl cysteine blunts proteotoxicity in a heat shock protein-dependent manner. Neuroscience. 255, 19-32 (1016).
- Madeira, A., et al. Caveolin-1 interacts with alpha-synuclein and mediates toxic actions of cellular alpha-synuclein overexpression. Neurochem. Int. 59, 280-289 (2011).
- Fioriti, L., et al. Cytosolic prion protein (PrP) is not toxic in N2a cells and primary neurons expressing pathogenic PrP mutations. J. Biol. Chem. 280, 11320-11328 (2005).
- Zhang, L., et al. Proteasome inhibition modulates kinase activation in neural cells: relevance to ubiquitination, ribosomes, and survival. J. Neurosci. Res. 87, 3231-3238 (2009).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 24, 197-211 (2003).
- Stranahan, A. M., Mattson, M. P. Selective Vulnerability of Neurons in Layer II of the Entorhinal Cortex during Aging and Alzheimer's Disease. Neural Plast. 2010, (2010).
- Duyckaerts, C., Delatour, B., Potier, M. C. Classification and basic pathology of Alzheimer disease. Acta Neuropathol. 118, 5-36 (2009).
- Chu, C. C., Tranel, D., Damasio, A. R., Van Hoesen, G. W. The autonomic-related cortex: pathology in Alzheimer's disease. Cereb. Cortex. 7, 86-95 (1997).
- Braak, H., Del Tredici, K., Bohl, J., Bratzke, H., Braak, E. Pathological changes in the parahippocampal region in select non-Alzheimer's dementias. Ann. N.Y. Acad. Sci. 911, 221-239 (2000).
- Braak, H., Rub, U., Schultz, C., Del Tredici, K. Vulnerability of cortical neurons to Alzheimer's and Parkinson's diseases. J. Alzheimers Dis. 9, 35-44 (2006).
- Calabrese, E. J. Hormesis is central to toxicology, pharmacology and risk assessment. Hum. Exp. Toxicol. 29, 249-261 (2010).
- Giordano, J., Ives, J. A., Jonas, W. B. Hormetic responses in neural systems: consideration, contexts, and caveats. Crit. Rev. Toxicol. 38, 623-627 (2008).
- Mattson, M. P.
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, (2010).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Astrocyte plasticity revealed by adaptations to severe proteotoxic stress. Cell Tissue Res. , (2013).
- McLaughlin, B., et al. Caspase 3 activation is essential for neuroprotection in preconditioning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 715-720 (2003).
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol. Biol. 536, 499-513 (2009).
- Picariello, L., et al. A comparison of methods for the analysis of low abundance proteins in desmoid tumor cells. Anal. Biochem. 354, 205-212 (2006).
- Tapias, V., Cannon, J. R., Greenamyre, J. T. Melatonin treatment potentiates neurodegeneration in a rat rotenone Parkinson's disease model. J. Neurosci. Res. 88, 420-427 (2010).
- Fenteany, G., Schreiber, S. L. Specific inhibition of the chymotrypsin-like activity of the proteasome induces a bipolar morphology in neuroblastoma cells. Chem. Biol. 3, 905-912 (1996).
- Omura, S., et al. Lactacystin, a novel microbial metabolite, induces neuritogenesis of neuroblastoma cells. J. Antibiot. 44, 113-116 (1991).
