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Biology

संस्कृति में कोशिकाओं के लिए व्यवहार्यता Assays

Published: January 20, 2014 doi: 10.3791/50645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Pharmaceutical Sciences, Mylan School of Pharmacy, Duquesne University

Summary

चिकित्सकीय यौगिकों अक्सर पहली व्यवहार्यता assays के साथ इन विट्रो में जांच कर रहे हैं. एक मानव पर्यवेक्षक द्वारा ब्लाइंड कोशिकाओं की गिनती सेल संख्या में छोटे बदलाव करने के लिए अत्यधिक संवेदनशील हो सकते हैं, लेकिन समारोह का आकलन नहीं करते. कम्प्यूटरीकृत व्यवहार्यता assays, यहाँ वर्णित के रूप में, एक उद्देश्य तरीके से दोनों संरचना और समारोह का आकलन कर सकते हैं.

Abstract

एक माइक्रोस्कोप पर मैनुअल कोशिकाओं की गिनती सेलुलर व्यवहार्यता का आकलन करने का एक संवेदनशील साधन हैं लेकिन समय लेने वाली और इसलिए महंगे हैं. कम्प्यूटरीकृत व्यवहार्यता assays के उपकरण के मामले में महंगे हैं, लेकिन तेजी से और अधिक उद्देश्य पुस्तिका कोशिकाओं की गिनती से हो सकता है. वर्तमान रिपोर्ट तीन ऐसे व्यवहार्यता assays के उपयोग का वर्णन करता है. इन assays के दो अवरक्त हैं और एक luminescent है. दोनों अवरक्त assays के एक 16 बिट ओडिसी Imager पर भरोसा करते हैं. एक अवरक्त परख cytosol के लिए नीलम दाग के साथ संयुक्त नाभिक के लिए DRAQ5 दाग का उपयोग करता है और 700 एनएम चैनल में कल्पना है. अन्य अवरक्त परख, एक कक्ष में पश्चिमी, cytoskeletal प्रोटीन (α-ट्यूबिलिन या microtubule जुड़े प्रोटीन 2) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करता है और 800 एनएम चैनल में उन्हें लेबल. तीसरे व्यवहार्यता परख एटीपी के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया luminescent परख है, लेकिन हम कीमत पर बचाने के लिए सिफारिश की मात्रा के एक चौथाई का उपयोग करें. इन मापों सभी रेखीय हैं और CE की संख्या के साथ सहसंबंधीLLS चढ़ाया, लेकिन संवेदनशीलता में भिन्नता है. सभी तीन assays समय लेने वाली माइक्रोस्कोपी दरकिनार और पूरे अच्छी तरह से नमूना, जिससे नमूना त्रुटि को कम करने. अंत में, assays के सभी आसानी से कम timeframes के भीतर किया जा प्रयोगों की अधिक से अधिक संख्या की अनुमति, प्रयोग के अंत में एक दिन के भीतर पूरा किया जा सकता है. हालांकि, वे सभी सेल नंबर उपचार, कभी कभी विशेष रूप से सेलुलर एटीपी के लिए, नहीं मिले है कि एक धारणा के बाद सिग्नल की शक्ति के अनुपात में ही रहते हैं कि इस धारणा पर विश्वास करते है. कोशिकाओं को बढ़ाने या उपचार के बाद आकार में कमी इसके अलावा, अगर, इस सेल नंबर को प्रभावित किए बिना सिग्नल की शक्ति प्रभावित हो सकती है. हम पुस्तिका मायने रखता सहित सभी व्यवहार्यता assays, निरंतर की एक संख्या से ग्रस्त निष्कर्ष है कि, लेकिन यह है कि कम्प्यूटरीकृत व्यवहार्यता assays के प्रारंभिक निवेश के लायक हैं. सभी तीन assays का उपयोग एक साथ सेलुलर संरचना और समारोह के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण पैदावार.

Introduction

जैविक विज्ञान में सबसे आम व्यवहार्यता परख कोशिकाओं की गिनती शामिल है. यह 2013/04/29 और 2013/04/30 पर कीवर्ड की या तो "इन विट्रो" या "संस्कृति" के साथ PubMed में दिखाई दिया कि शीर्ष (सबसे हाल ही में) 200 प्रकाशनों के एक विश्लेषण इसका सबूत है. इन प्रकाशनों की, पुस्तिका सेल संख्या गिनता सहित 23.5% इस्तेमाल सेल गिनती assays,, स्वचालित सेल नंबर इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ गिना जाता है, और Trypan नीले अपवर्जन. लाइव / मृत परख इन प्रकाशनों का 1% में इस्तेमाल किया गया था. MTT (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-YL) -2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड) का उपयोग प्रकाशनों की संख्या चयापचय व्यवहार्यता के लिए परख 11% थी. साहित्य के इस सर्वेक्षण में यह भी सेल गिनती assays के साथ संयोजन के रूप में इस तरह के MTT के रूप में assays का उपयोग प्रकाशनों की संख्या केवल 3.5% थी कि पता चलता है. सेल नंबर के साथ संयोजन में सेलुलर समारोह का आकलन करने, अपने आप में एक व्यवहार्यता परख का उपयोग करने की प्रवृत्ति सेलुलर मैं आकलन करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प लगता है के बावजूदntegrity. शेष कोशिकाओं कार्यात्मक या वे अच्छी तरह से 1,2 में मौजूद हैं, भले ही स्वस्थ नहीं हो सकता है क्योंकि स्वयं द्वारा कोशिकाओं की गिनती के लिए पर्याप्त नहीं हैं. इसके विपरीत, एटीपी के रूप में कार्य के उपायों को बढ़ाने या कोशिकाओं की संख्या में समानांतर परिवर्तन के अभाव में कम हो सकती है. सेल नंबर से चयापचय readouts की uncoupling एटीपी और MTT assays एकमात्र व्यवहार्यता परख के रूप में इस्तेमाल किया जा कभी नहीं करना चाहिए. वर्तमान रिपोर्ट में, सेलुलर संरचनाओं और चयापचय समारोह दोनों सर्वेक्षण कि तीन व्यवहार्यता assays खर्च कर सकते हैं अपने आप में किसी भी एक परख से सेलुलर अखंडता का एक अधिक व्यापक देखने के लिए, वर्णित हैं.

हमारे assays के दो 700 और 800 एनएम चैनलों में प्रतिदीप्ति उपाय है कि एक अवरक्त इमेजर की आवश्यकता होती है. शोर उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात 3 के लिए अग्रणी, अवरक्त तरंगदैर्ध्य में कम है. कि हम इस्तेमाल ओडिसी इमेजर 4.5 प्रवेश गतिशील रेंज और 16, translatin की एक बिट गहराई हैअवरक्त के 2 से 16 या 65,536 रंगों को जी. यह केवल एक तरंग दैर्ध्य के लिए रंग के 2 8 या 256 रंग देता है जो 8 बिट रंग इमेजिंग, करने के विपरीत किया जा सकता है. इस प्रकार, 16 बिट इमेजिंग महीन संकल्प किया है. यह मूल अवरक्त छवियों अक्सर प्रस्तुति के लिए प्रकाशित रिपोर्ट में (800 एनएम) और लाल (700 एनएम) ग्रीन pseudocolored रहे हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए. ओडिसी लगे आमतौर पर पश्चिमी सोख्ता के लिए और कक्ष में पाश्चात्य 4-7 दोनों का इस्तेमाल किया जाता है. कक्ष में formaldehyde तय कोशिकाओं पर पाश्चात्य हित के किसी भी प्रोटीन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें और अवरक्त फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ बदले में उन्हें लेबल. इस तकनीक phosphorylation endpoints के 6 विशेष रूप से उपयोगी माना जाता है. हमारे कक्ष में पाश्चात्य में, हम cytoskeletal प्रोटीन α-ट्यूबिलिन या 800 एनएम चैनल में neuronal microtubule जुड़े प्रोटीन 2 (MAP2) के लिए तय की कोशिकाओं दाग. ये प्रोटीन उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात उपज के लिए पर्याप्त प्रचुर मात्रा में हैं. हम भी 700 में हमारी प्लेटों दागDRAQ5 दाग के साथ और नीलम दाग के साथ कोशिका द्रव्य के नाभिक के लिए एनएम चैनल. Cytoskeletal प्रोटीन और DRAQ5 + नीलम दाग दोनों इस प्रकार सेलुलर संरचनाओं को दर्शाते हैं.

तीसरे व्यवहार्यता परख चयापचय समारोह के उपाय और कहा जाता है "सेल टिटर Glo." इस luciferase आधारित परख में, luminescence मूल्यों एटीपी के स्तर को सीधे अनुपात में हैं. एटीपी assays आमतौर पर व्यवहार्य कोशिकाओं 8-12 यों के लिए उपयोग किया जाता है. सेल प्रति एटीपी उत्पादन विष उपचार के एक समारोह के रूप में बदल सकते हैं क्योंकि हालांकि, परख के नाम में शब्द "अनुमापांक" सहित एक मिथ्या नाम की है और सेल नंबर 8 के अनुपात में इसलिए हमेशा नहीं है. एटीपी स्तर भी circadian लय द्वारा 13 और कोशिका विभाजन के 14 और सेल भेदभाव 15 से प्रभावित किया जा सकता है. एटीपी चयापचय की एक मजबूत उपाय है क्योंकि फिर भी, यहां दिखाया एटीपी परख प्रदर्शन करने के लिए सरल और उपयोगी हैव्यवहार्यता 16-21, दर असल संख्या सेल नहीं है. पाश्चात्य इसलिए किसी भी एक अकेले परख से सेलुलर अखंडता का एक अधिक व्यापक तस्वीर पैदावार में सेल अवरक्त पूरक करने के लिए इस परख का उपयोग करना.

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Protocol

प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्र 1 में सचित्र है.

1. सेल चढ़ाना

विभिन्न चढ़ाना घनत्व (चित्रा 2) में 96 अच्छी तरह प्लेटें में प्लेट कोशिकाओं. N2a neuroblastoma सेल लाइन, प्लेट 2.5k, 5k, 10k, और 3 या 6 कुओं / समूह में अच्छी तरह से प्रति 15k कोशिकाओं पर linearity की जाँच के लिए. चूहे प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स, थाली 25k, 50k, 100k, और 3 या 6 कुओं / समूह में अच्छी तरह से प्रति 200k कोशिकाओं में linearity की जाँच के लिए. सेल लाइनों या ब्याज की प्राथमिक कोशिकाओं विभिन्न चढ़ाना घनत्व, थाली है कि सेल प्रकार के लिए इष्टतम सेल घनत्व में और आसपास में स्वस्थ लग रहे हैं.

नोट: वर्तमान अध्ययन में, N2a कोशिकाओं कम वाष्पीकरण के लिए तैयार कर रहे हैं कि प्लेटों पर 200 μl मीडिया में 100 μl मीडिया और प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स में चढ़ाया गया. सेल हैंडलिंग, मीडिया, सीरा, एंटीबायोटिक दवाओं, और विष उपचार के बारे में विस्तृत जानकारी के लिए, उन्नीथन एट अल देखें. N2a सीईएल के लिएलोकसभा 8 और Posimo एट अल. प्राथमिक प्रांतस्था संस्कृतियों 22 के लिए.

    1. एक दूसरे 96 अच्छी तरह से थाली पर चढ़ाना दोहराएँ. एक थाली एटीपी (2A चित्रा) के लिए assayed और अवरक्त assays (चित्रा 2 बी) के साथ दूसरे की जाएगी. कोशिकाओं intracellular एटीपी माप के लिए खुला lysed किया जाना चाहिए क्योंकि एक एटीपी और अवरक्त assays के लिए एक ही थाली का उपयोग नहीं कर सकते हैं.
    2. इष्टतम चढ़ाना घनत्व (चित्रा 2B स्तंभ 2) में अवरक्त assays में पृष्ठभूमि घटाव के लिए कम से कम 3 अतिरिक्त कुओं थाली करने के लिए सुनिश्चित करें.
  2. पंक्तियाँ एक और एच में और स्तंभों 1 और 12 में बाहरी वेल्स को अधिक सस्ते में कोशिकाओं के बिना मीडिया या, बाँझ पानी जोड़ें. व्यवहार्यता मीडिया वाष्पीकरण और तापमान gradients के प्रभाव से कम यहां अक्सर है, के रूप में किनारों के साथ कुओं से डेटा पर भरोसा करने से बचें. Microplates के साथ इस तरह की समस्याएं आमतौर पर बढ़त प्रभाव 23,24 कहा जाता है. खाली इन कुओं न रखेंतो पंक्तियों बी और जी और कॉलम 2 और 11 बढ़त प्रभाव से ग्रस्त है.
    एज प्रभाव सीओ 2 इनक्यूबेटर 24 में स्थानांतरण से पहले परिवेश की स्थिति में कमरे के तापमान पर एक हौसले वरीयता प्राप्त थाली incubating द्वारा कम किया जा सकता है. इसके अलावा, Carralot ने हाल के एक अध्ययन एक नियंत्रण स्तंभ 23 का उपयोग microtiter प्लेट के लिए एक गणितीय सुधार विधि का वर्णन करता है. ओलिवर और उनके सहयोगियों ने थर्मल ढ़ाल 25 कम करने के लिए एक विशेष रूप से डिजाइन मजबूर हवा microtitration थाली इनक्यूबेटर इस्तेमाल किया. बढ़त प्रभाव महत्वपूर्ण चिंता की बात है, तो microplate स्थिरता कक्षों (जैसे बीटी और सी शामिल) उच्च आर्द्रता और भी तापमान gradients के साथ एक समरूप microenvironment बनाने के लिए खरीदा जा सकता है.
  3. अतिरिक्त अभिकर्मक dilutions या अधिक चढ़ाना घनत्व परीक्षण किया जाएगा क्योंकि चित्र 1 में दिखाया गया है और अधिक से अधिक कुओं की जरूरत है, पृष्ठभूमि घटाव के लिए बढ़त कुओं का उपयोग करें.
  4. कुर्की के लिए रात भर प्रतीक्षा करेंकोशिकाओं और परख नीचे वर्णित के रूप में अगली सुबह की.

2. Luminescent एटीपी परख

  1. बफर के साथ सब्सट्रेट के पुनर्गठन के लिए और ऊष्मायन समय के लिए सेल टिटर Glo निर्माता की सिफारिशों का पालन करें.
    1. क्रमशः, चढ़ाना मीडिया की 100 या 200 μl से 50 या 150 μl मीडिया निकालें. थोड़ा कम से कम 50 μl कुएं में पीछे रह जाएगा. एक 1:2 कमजोर पड़ने में कॉलम 2-6 (2A चित्रा) के लिए अभिकर्मकों (सब्सट्रेट प्लस बफर) के 25 μl जोड़ें.
      नोट: हटाने विभिन्न कुओं भर एटीपी परख अभिकर्मकों पतला या ध्यान केंद्रित कर सके बाद मीडिया के अलग संस्करणों को पीछे छोड़ दिया. सभी multichannel विंदुक युक्तियाँ में तरल के स्तर के बराबर है कि यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखना. तुरंत सटीकता सुनिश्चित करने के लिए एटीपी परख अभिकर्मकों जोड़ने से पहले एक विंदुक के साथ थाली भर में चुनिंदा कुओं में शेष तरल उपाय. उच्च परिवर्तनशीलता मीडिया evapor का अंतर दरों से मौजूद हैथाली की सतह के पार समझना, सभी पुराने मीडिया निकालें और तुरंत एटीपी परख अभिकर्मकों के अलावा पहले सभी कुओं को ताजा मीडिया या फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) के समान मात्रा में जोड़ें. प्लेटों वाष्पीकरण के चर स्तर से पीड़ित हैं, costar Corning से कम वाष्पीकरण प्लेटों को बदलने की कोशिश. उत्तरार्द्ध प्लेट में, चित्रा 2 में दिखाया गया 60 इंटीरियर कुओं केवल 0.995% की एक औसत से 0.41 मीडिया वाष्पीकरण रातोंरात ± पीड़ित हैं. परख के समय में मीडिया मात्रा में नगण्य परिवर्तनशीलता इस प्रकार है.
    2. ऊपर विस्तृत रूप कॉलम में 7 से 11, पंक्तियों बी डी के माध्यम से, पीछे, 50 μl छोड़ने के लिए पर्याप्त मीडिया को हटाने, और एक 1:1 कमजोर पड़ने में अभिकर्मकों के 50 μl जोड़ें.
    3. कॉलम में 7 से 11, जी के माध्यम से पंक्तियों ई, मीडिया के 100 μl में कोशिकाओं को छोड़ने और एक 1:1 कमजोर पड़ने में फिर से, अभिकर्मकों के 100 μl जोड़ें. कंपनी अभिकर्मकों के 100 μl मीडिया के 100 μl में 01:01 पतला होना चाहिए कि सिफारिश की.
      नोट: आदेश मेंलागत को बचाने के लिए, यह मात्रा में और कमजोर पड़ने से दोनों में इन सिफारिशों में कटौती संभव है. हालांकि, ऐसा करने से पहले, यह परख के linearity और संवेदनशीलता को कम नहीं करता है यह सुनिश्चित.
    4. एक विशिष्ट मात्रा और अभिकर्मकों के कमजोर पड़ने कारक संतोषजनक होना पाया जाता है एक बार, बाद के सभी प्रयोगों में उनके साथ रहना. संतोषजनक डेटा के लिए मापदंड परिणाम अनुभाग में वर्णित हैं.
    5. अप्रयुक्त पुनर्गठन अभिकर्मकों refrozen और लागत को बचाने के लिए एक बाद की तारीख में इस्तेमाल किया जा सकता है. निर्माता के अनुसार, पुनर्गठन अभिकर्मकों गतिविधि का ~ 3% के नुकसान के साथ 21 सप्ताह के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  2. 2 मिनट या 10 मिनट के लिए एक nutating प्रकार के बरतन के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर थाली रखें. थाली का हिस्सा एक अलग माप के लिए assayed किया जा रहा है और इसे कोई नहीं डिगा सकता है, तो केवल ब्याज के कुओं में सरल नीचे ऊपर और pipetting साथ मीडिया आंदोलन. हालांकि, इस कदम के दौरान उत्पन्न अत्यधिक बुलबुले LUMI के साथ हस्तक्षेप करेगाnescent उत्पादन.
    1. 10 मिनट अभिकर्मकों के बाद इसके अलावा, सफेद 96 अच्छी तरह प्लेटें में अच्छी तरह से सामग्री के 60 μl हस्तांतरण. वे ऊपर की तरफ डिटेक्टर की ओर प्रकाश को प्रतिबिंबित क्योंकि Luminescence मूल्यों स्पष्ट या काले प्लेटों में से सफेद प्लेट में ज्यादा हैं.
      नोट: हमारे अनुभव में, सेल, अन्य प्लेटों से स्पष्ट Costar प्लेटें कम वाष्पीकरण पर बेहतर जीवित रहते हैं. इन विशिष्ट प्लेटें सफेद दीवारों के साथ बेचा नहीं कर रहे हैं. दूसरा, दीवारों अपारदर्शी और स्पष्ट तली प्लेटें पूरी तरह से स्पष्ट प्लेटों से ज्यादा महंगे हैं. एक सफेद प्लेट को luminescent तरल स्थानान्तरण, तो सफेद प्लेटों धोया जा सकता है और हर प्रयोग के लिए नए सफेद प्लेटों के उपयोग की लागत पर बचत, पुन: उपयोग किया. तरल के हस्तांतरण इस प्रकार लंबे समय में सस्ता विकल्प है.
    2. पिछले एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक बल्ब से मजबूर हवा के साथ, अधिमानतः, एक सुई के साथ प्लेट पढ़ने के लिए या किसी भी हवाई बुलबुले पॉप. एक 1 सेकंड एकीकरण समय (कंपनी recomme साथ एक luminometer पर थाली पढ़ेंएनडीएस 0.25-1 सेकंड के रूप में पर्याप्त एकीकरण के समय). एटीपी परख अभिकर्मकों के अलावा के बाद थाली 10-12 मिनट पढ़ें. गिल्बर्ट और उनके सहयोगियों ने 26 से दिखाया luminescent संकेत, एक तेजी से क्षय की दर के साथ क्षणिक है क्योंकि समय, अलग प्लेटों भर में तुलना के लिए महत्वपूर्ण है.
  3. (चित्रा 3 देखें) एक scatterplot में सेल नंबर के एक समारोह के रूप में प्रत्येक समूह और साजिश में 3 या 6 कुओं से luminescent मूल्यों औसत. प्रत्येक संबंधित डेटा बिंदु से (11G - 2 जी, कुओं 11B - - 11D, और कुओं 11e कुओं 2 बी) प्रथम औसत उपयुक्त खाली कुओं की पृष्ठभूमि luminescence मूल्यों घटाना. इस आरंभिक प्रयोग (2A चित्रा) में प्रत्येक चढ़ाना घनत्व के लिए तीन अलग अलग समूहों की जाएगी. एटीपी के स्तर रैखिक इन समूहों में से एक या सभी में सेल घनत्व के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है. अभी भी कीमत पर बचाने के लिए संतोषजनक परिणाम देता है कि अभिकर्मकों के उच्चतम कमजोर पड़ने के साथ आगे बढ़ें. संतोषजनक परिणाम के लिए मानदंड वर्णित हैं मैंn परिणाम अनुभाग.
    नोट: वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल मीडिया के साथ, इस परख के साथ पृष्ठभूमि मूल्यों उच्च नहीं कर रहे हैं और यह खाली कुओं छोड़ करने के लिए संभव है. हालांकि, निर्माता Promega अलग संस्कृति मीडिया के साथ luminescence में मतभेद की रिपोर्ट. वर्तमान अध्ययन HyClone भ्रूण क्लोन तृतीय, N2a कोशिकाओं और प्राथमिक cortical संस्कृतियों के लिए गोजातीय बछड़ा सीरम के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम का एक सिंथेटिक संस्करण का उपयोग करता है. निर्माता के मुताबिक, बछड़ा सीरम luminescence मूल्यों कम हो जाती है लेकिन परख की संवेदनशीलता को कम नहीं करता. इस महत्वपूर्ण चिंता का विषय है फिर भी, अगर, परख के समय में पीबीएस के बजाय मीडिया में एटीपी परख अभिकर्मकों पतला.
    1. कोशिकाओं रातोंरात स्तंभों में असमान रूप से विकसित करने के लिए दिखाई देते हैं, चढ़ाना के 6 घंटा के भीतर उन्हें परख करने की क्रिया का प्रयास करें. हालांकि, परख के सामान्य समय (उपचार के बाद उदाहरण के लिए, 24 घंटा) पर घनत्व linearity हासिल किया जाना चाहिए, जिस पर घनत्व है कि दिमाग में रखना है.

3. Infrareडी Assays

  1. चढ़ाना के बाद सुबह, एक धूआं हुड में कमरे के तापमान पर दूसरे की थाली में कोशिकाओं को ठीक. Formaldehyde एक कैसरजन क्योंकि इस चरण के लिए दस्ताने पहनना और रासायनिक कचरे के रूप में लगानेवाला के निपटान के लिए सुनिश्चित करें. एक 1:1 कमजोर पड़ने में मौजूदा मीडिया के लिए 0.1 एम फॉस्फेट बफर में 4% formaldehyde और 4% sucrose जोड़ें. मीडिया भी पूर्ण शक्ति लगानेवाला में फिक्सिंग से पहले पीबीएस के साथ धोया जा सकता है. या तो तकनीक अच्छी तरह से काम करता है.
    1. 20 मिनट के लिए लगानेवाला में सेते हैं और फिर लगानेवाला हटाने और 200 μl पीबीएस में 3x धो लो.
  2. परख में एक ही दिन पर जगह नहीं ले जाएगा अगर 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.2% सोडियम azide साथ पीबीएस में थाली स्टोर. अन्यथा, परख के साथ आगे बढ़ना है और एंटीबॉडी के अविशिष्ट बंधन को कम करने के लिए अवरुद्ध समाधान में कोशिकाओं की जगह.
    1. पीबीएस में मछली सीरम ओडिसी ब्लॉक 01:01 पतला और एक सेल permeabilizer के रूप में 0.3% ट्राइटन-X 100 जोड़ें. पर्याप्त अवरुद्ध समाधान के साथ ही प्राथमिक और माध्यमिक antibo बनाओवि समाधान 35 μl अच्छी तरह से प्रत्येक में pipetted किया जा सकता है. बुलबुले का एक बहुत pipetting के दौरान मनाया जाता है हालांकि, अगर नहीं तो बुलबुले नीचे बंधन से कोशिकाओं और ब्लॉक एंटीबॉडी में पहुँचने के लिए, प्रत्येक के लिए अच्छी तरह> 50 μl बनाते हैं. अत्यधिक साबुन के बुलबुले अच्छी तरह से बीच में एक बेदाग परिपत्र स्थल के रूप में दिखाई देगा. यदि ऐसा होता है pipetting समायोजित करने का प्रयास करें.
    2. कमरे के तापमान पर 30-60 मिनट के लिए इस अवरुद्ध समाधान में सेते हैं.
      नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में एक ही प्रजाति से 5% गोजातीय सीरम albumin या सामान्य सीरा भी मछली सीरम ब्लॉक की कीमत पर बचाने के लिए समाधान अवरुद्ध रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. समाधान ब्लॉकिंग एंटीबॉडी के प्रदर्शन को प्रभावित कर सकते हैं. इस प्रकार, प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए इष्टतम ब्लॉक सबसे अच्छा अनुभव से निर्धारित है.
      नोट: कुछ जांचकर्ताओं incubations दौरान शेकर्स पर कक्ष में पश्चिमी प्लेटें प्लेस. बहरहाल, यह आवश्यक नहीं है.
  3. विरोधी α-ट्यूबिलिन के लिए 1:10,000 कमजोर पड़ने: प्राथमिक एंटीबॉडी(माउस मोनोक्लोनल, 1 टेबल) और विरोधी MAP2 (माउस मोनोक्लोनल, 1 टेबल) के लिए 1:2,000 कमजोर पड़ने. ये एंटीबॉडी इन सेलुलर मॉडल में ब्याज की प्रोटीन के लिए विशिष्ट हैं, विशिष्टता किसी भी immunocytochemical दाग के लिए आवश्यक है.
    नोट: MAP2 न्यूरॉन्स के लिए एक मार्कर है और मिश्रित glial / neuronal संस्कृतियों के लिए उपयुक्त है. astrocytes उनकी संख्या जल्दी नवजात अवधि 27,28 में बढ़ता जा के साथ, भ्रूण दिन 18 पर पहली बार प्रदर्शित क्योंकि यहाँ दिखाया प्रसव के बाद संस्कृतियों भी कुछ glia (~ 25%) होते हैं. एक astrocytes और न्यूरॉन्स एटीपी में और DRAQ5 + नीलम assays के बीच भेद नहीं कर सकते. , अलग न्यूरॉन्स और astrocytes उपाय Mullett और उनके सहयोगियों 4,29 द्वारा वर्णित के रूप में, 800 और 700 एनएम चैनलों में एक साथ MAP2 और GFAP धुंधला उपयोग, DRAQ5 + नीलम बाहर छोड़ने के लिए आदेश में. संस्कृति में सभी कक्षों का मूल्यांकन होना चाहते हैं हालांकि, इस तरह के α-ट्यूबिलिन, β-actin, या GAPDH के रूप में एक अखिल सेलुलर मार्कर का उपयोग करें.
    नोट: ये dilutions N2a और प्राथमिक cortical कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है और हर मॉडल के लिए सामान्य नहीं हो सकता है. इसलिए, कम से कम दो प्राथमिक एंटीबॉडी dilutions, प्लेट के बाएं हिस्से में एक और ठीक आधे पर एक (चित्रा 2B देखें) की कोशिश करो. वैकल्पिक रूप से, 3 कुओं प्रत्येक पर प्राथमिक एंटीबॉडी के 3-4 dilutions के लिए प्रयास करें. उदाहरण के लिए, एंटीबॉडी डालने शीट पर सिफारिश की कमजोर पड़ने दो गुना परिवर्तन के साथ flanked किया जा सकता है. Immunocytochemistry के लिए सिफारिश की कमजोर पड़ने 1:500 है अगर दूसरे शब्दों में, यह भी 1:250 और 1:1,000 कमजोर पड़ने कारकों का प्रयास करें.
    1. पीबीएस और 0.3% ट्राइटन-X जोड़ें: 01:01 ओडिसी ब्लॉक में एंटीबॉडी पतला. लागत पर बचाने के लिए, ऊष्मायन के अंत में इस समाधान को हटाने के द्वारा कदम 3.2.1 में कोशिकाओं को लागू किया गया था कि अवरुद्ध समाधान में एंटीबॉडी बनाने की कोशिश. जबकि यह कर पीबीएस में कोशिकाओं रखें, वे बाहर सूखी नहीं होना चाहिए.
    2. या तो 1-2 घंटे कमरे के तापमान पर या रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी में सेते कमजोर बी के लिएएंटीबॉडी और प्रचुर मात्रा में नहीं हैं कि प्रोटीन inding, रात भर incubations संकेत को बढ़ाने में मदद कर सकते हैं.
      नोट: प्रत्येक माध्यमिक एंटीबॉडी एकाग्रता (कुओं 2 बी 2 डी और कुओं चित्रा 2B में 2 ई-2G) में पृष्ठभूमि घटाव के लिए अवरुद्ध समाधान में कम से कम 3 कुओं छोड़ दें. किसी भी प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए इन कुओं का खुलासा नहीं करते. वे माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा अविशिष्ट बंधन की हद तक पता चलता है और संकेत करने वाली शोर अनुपात की गणना के लिए उपयोगी होते हैं. माध्यमिक एंटीबॉडी अविशिष्ट बंधन के उच्च स्तर तक ले जाएगा कि एक चिंता का विषय नहीं है, तो भी प्राथमिक या माध्यमिक या तो एंटीबॉडी से अवगत कराया लेकिन washes के एक ही नंबर प्राप्त नहीं कर रहे हैं कि नियंत्रण कुओं में शामिल हैं. इन कुओं और "माध्यमिक केवल" वेल्स के बीच अंतर अकेले माध्यमिक एंटीबॉडी की वजह से बाध्यकारी अविशिष्ट की हद खोलेगा. माउस N2a कोशिकाओं पर हमारे परीक्षण में, था अकेले विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ संकेत तीव्रता 0.557 ± 0.032, विरोधी खरगोश के साथ संकेतअकेले माध्यमिक एंटीबॉडी कोई माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ संकेत, 0.357 ± 0.003 0.533 ± 0.041 था, और प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ संकेत 11.867 ± 0.911 था. चूहे की कोशिकाओं पर विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग भी जब हम इस प्रकार अविशिष्ट बंधन के उच्च स्तर पर नहीं मनाया जाता है. कई निर्माता की अवरक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए कर रहे हैं, हम केवल अत्यधिक पार adsorbed लोगों को खरीदने की सलाह देते हैं. माध्यमिक आईजीजी की एकाग्रता स्रोत के आधार पर भिन्न हो सकते हैं नोट.
  4. खैर, 10 मिनट प्रत्येक प्रति 200 μl पीबीएस के 3 washes के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी से धो लें. प्राथमिक एंटीबॉडी 0.2% सोडियम azide में कुछ सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बचाया और समाधान प्रकाश अप करने के लिए आयोजित की जाती हैं जब मलबे के छोटे specks स्पष्ट हो जब तक पुन: उपयोग किया जा सकता है. यह केवल लागत को बचाने के लिए किया जाता है. लागत एक मुद्दा नहीं है, तो प्रत्येक उपयोग के लिए ताजा एंटीबॉडी बनाने.
  5. 01:01 ओडिसी ब्लॉक में 1:1,000 या 1:2,000 द्वारा माध्यमिक एंटीबॉडी पतला: 0.3% त्रि साथ पीबीएसटन एक्स (चित्रा 2 बी). प्लेट के नीचे आधा करने के लिए थाली और 1:2,000 के ऊपर से आधा 1:1,000 कमजोर पड़ने जोड़ें. इन सांद्रता आगे लागत पर बचाने के लिए, लेकिन यह करने से पहले linearity के लिए जाँच करने के लिए कम किया जा सकता है.
    नोट: पृष्ठभूमि घटाव कुओं (चित्रा 2B में स्तंभ 2) के लिए उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ने के लिए सुनिश्चित करें.
    1. एक दूसरे प्रोटीन DRAQ5 + नीलम, माउस के अलावा किसी अन्य प्रजातियों से प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 800 एनएम चैनल में 700 एनएम बकरी विरोधी माउस आईजीजी और दूसरे प्रोटीन के साथ α-ट्यूबिलिन या MAP2 के लिए लेबल कोशिकाओं के स्थान पर assayed किया जायेगा. 800 एनएम चैनल 700 एनएम चैनल से भी कम पृष्ठभूमि है और ब्याज की सबसे महत्वपूर्ण प्रोटीन के लिए आरक्षित किया जाना चाहिए.
    2. प्रकाश से दूर एक दराज में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी में सेते हैं.
  6. खैर, 10 मिनट प्रत्येक प्रति 200 μl पीबीएस के 3 washes के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी से धो लें.
  7. DRAQ5 + नीलम समाधान करें. थाली के बाईं आधे के लिए, DRAQ5 1:10,000 (0.5 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) पतला और पीबीएस में नीलम 1:1000 0.3% ट्राइटन-X के साथ (स्तंभों 3-6, चित्रा 2 बी). थाली के ठीक आधे के लिए, DRAQ5 1:20,000 (0.25 माइक्रोन) पतला और नीलम 1:2000 (स्तंभों 7-10, चित्रा 2 बी).
    नोट: बजाय एक 5 मिमी शेयर के एक 1 मिमी शेयर पर बेचा जा करने के लिए इस्तेमाल DRAQ5. कुछ पहले प्रकाशित रिपोर्ट इसलिए DRAQ5 8 1:4,000 या 1:2,000 dilutions इस्तेमाल किया.
    1. दो प्लेटें एक साथ assayed किया जा रहा है, तो लागत पर बचाने के लिए, एक ही DRAQ5 + नीलम समाधान पहले थाली इसे बंद pipetting और दूसरे को जोड़ने, अनुक्रम में दो प्लेटों पर इस्तेमाल किया जा सकता है. एक ही समाधान इस तरीके में दो बार इस्तेमाल किया जाएगा, तो एक दिन के भीतर उन्हें इस्तेमाल करते हैं. पतला DRAQ5 + नीलम समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर बचाया या बाद में उपयोग के लिए जमे हुए किया जा सकता.
    2. दूर च कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इन समाधान में सेतेROM प्रकाश. समय कम है और DRAQ5 + नीलम समाधान 3.5 चरण में माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के लिए इन दाग जोड़ने और 1 घंटे के लिए सेते हैं, विभिन्न secondaries साथ अन्य प्लेटों पर पुन: उपयोग किया जा नहीं होगा.
      नोट: इन कुओं 700 एनएम चैनल में दाग नहीं किया जाना चाहिए के रूप में पृष्ठभूमि घटाव कुओं (चित्रा 2B में स्तंभ 2) को DRAQ5 + नीलम समाधान न जोड़ें.
  8. 10 मिनट प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से प्रति 200 μl पीबीएस के साथ थाली 3x धो लें. थाली अवरक्त इमेजिंग पूर्ण होने के बाद अन्य दिखाई दूरी माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग होने जा रहा है अगर अंतिम पीबीएस धोने में 0.2% सोडियम azide रखो.
  9. एक ओडिसी Imager पर प्लेट स्कैन करें. तीव्रता 5 और 169 मिमी संकल्प पर प्लेटें स्कैनिंग द्वारा शुरू करो. "मध्यम गुणवत्ता" या "कम गुणवत्ता" सेटिंग्स या तो पर्याप्त हैं. कंपनी विस्तृत / उत्तेजना उत्सर्जन फिल्टर सूचना जारी नहीं करता है. हालांकि, उत्सर्जन फिल्टर लगभग 20 एनएम चौड़ा कर रहे हैं और 7 के आसपास केंद्रित कर रहे हैंनिर्माता के अनुसार 20 और 820 एनएम,.
    नोट: जांचकर्ताओं अन्य मार्कर के साथ उन्हें दाग को जारी रखना चाहते हो सकता है के रूप में यह अभी भी गीला है, जबकि प्लेटों को स्कैन करने के लिए संभव है. हालांकि, कंपनी सूखी प्लेटें कम अच्छी तरह से अच्छी तरह से संकेत प्रसार में परिणाम है कि अपनी ऑनलाइन प्रोटोकॉल में पता चलता है. आप डेटा की तुलना करने के लिए गीला और फिर सूखा दोनों उन्हें स्कैन, तो वाष्पीकरण के बाद शेष लवण किनारों के साथ उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का कारण बन सकता है क्योंकि अच्छी तरह से सभी पीबीएस निकाल लें.
    1. ओडिसी Imager अप को स्कैन करता है और प्लेट के नीचे के माध्यम से. कुओं के नीचे की थाली में उनकी मोटाई और गहराई में भिन्न हो सकती हैं क्योंकि विभिन्न निर्माताओं से प्लेट्स अलग ध्यान ऑफसेट मांग कर सकते हैं. अलग ध्यान ऑफसेट पर स्कैनिंग की कोशिश करो और देखो, जहां उच्चतम संकेत करने वाली शोर अनुपात और crispest (फोकस में सबसे) संकेत हासिल की है: 2.5 मिमी, 3.0 मिमी, 3.5 मिमी, 4.0 मिमी. Findin पुष्टि करने के लिए एक शासक के साथ एक थाली के नीचे से अच्छी तरह से गहराई मापने के लिए भी प्रयास करेंओडिसी पर जी एस. अच्छी तरह से नीचे में प्लास्टिक शासक माप के लिए अतिरिक्त ऊंचाई जोड़ सकते हैं कि याद रखें. वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल Costar प्लेटें 4.0 मिमी की भरपाई ध्यान देने की मांग.
    2. थाली की छवि पर सही आकार ग्रिड जगह है और माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल में डेटा निर्यात करने के लिए सॉफ्टवेयर में कक्ष में पश्चिमी समारोह का प्रयोग करें. उच्चतम प्रतिदीप्ति मूल्यों को खोजने के लिए अलग ध्यान ऑफसेट भर में एक ही कुओं की "एकीकृत तीव्रता" मूल्यों की जाँच करें. ("कोई प्राथमिक नकारात्मक नियंत्रण" वेल्स बनाम immunostained कुओं में संकेत) उच्चतम संकेत करने वाली शोर अनुपात पैदावार कि ऑफसेट फोकस इसके बाद चयन करने के लिए एक है.
    3. ऑफसेट एक फोकस पर फैसला हो जाने के बाद, छोटे वेतन वृद्धि में फिर से स्कैन. प्रतिभाशाली संकेत 3.5 और 4.0 मिमी था अगर उदाहरण के लिए, 3.6, 3.7, 3.8 पर स्कैनिंग की कोशिश, और 3.9 मिमी और सिग्नल की शक्ति में किसी भी आगे सुधार नहीं होता है, तो देखते हैं. ऑफसेट फोकस गलत है, तो एक खाली पी एल पर 12 स्तंभों में संकेत तीव्रताबजाय एक फ्लैट लाइन का एक यू के आकार का वक्र के रूप में दिखाई देगा (सभी स्तंभों बराबर संकेत देना चाहिए था जब) खा लिया. इस प्लास्टिक प्लेट के साथ एक समस्या बनी हुई है, गिलास तली प्लेटें कोशिश.
  10. 700 और 800 एनएम चैनलों में हर संबंधित डेटा बिंदु से, पृष्ठभूमि घटाव वेल्स (2 जी - - 2 डी या कुओं 2 ई कुओं 2B चित्रा 2 बी) में एकीकृत तीव्रता का औसत घटाना. तब कुओं में से प्रत्येक समूह के लिए एकीकृत संकेत तीव्रता औसत. सेल घनत्व के खिलाफ एक scatterplot के रूप में डेटा साजिश (चित्रा 3 देखें).
    1. प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी और बाद के प्रयोगों के लिए एक कमजोर पड़ने से प्रत्येक पर व्यवस्थित करने के लिए DRAQ5 + नीलम के दो अलग dilutions के परिणामों की दो अलग dilutions के परिणामों की तुलना. Linearity हासिल नहीं है, तो एक अलग तीव्रता में स्कैनिंग की कोशिश. तीव्रता 3 और बजाय 5 से 7 के साथ फिर स्कैन और डेटा reanalyze. डेटा उन तीव्रता से एक में सुधार है लेकिन अगर, अभी भी संतोषजनक नहीं हैं कि तीव्रता के आसपास वेतन वृद्धि में फिर स्कैन.
    2. सॉफ्टवेयर कुओं में सफेद धब्बे से पता चलता है जहां छवियों का विश्लेषण करने के लिए नहीं सावधान रहो, उन स्थानों इमेजर की सीमा से बाहर संतृप्त संकेत दर्शाते हैं. यदि ऐसा होता है एक कम तीव्रता पर स्कैन.
    3. Linearity हासिल नहीं है, तो वे विकास या रात भर विभिन्न स्तंभों में असमान रूप से मर सकता है क्योंकि चढ़ाना के 6 घंटा के भीतर कोशिकाओं को ठीक करने के लिए भी प्रयास करें. इसके अलावा विभिन्न चढ़ाना घनत्व, अलग स्कैनिंग तीव्रता, अभिकर्मक कमजोर पड़ने कारक, गिलास तली प्लेटें, एक नाभिक केवल दाग के रूप में स्वयं के द्वारा DRAQ5, या विरोधी α-ट्यूबिलिन या विरोधी MAP2 के अलावा अन्य विभिन्न एंटीबॉडी के आगे अनुकूलन का प्रयास करें.

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Representative Results

इन प्रयोगों में दर सीमित कारक एटीपी परख अवधि में अपेक्षाकृत संक्षिप्त है, के रूप में अवरक्त धुंधला हो जाना है. अवरक्त assays के लिए, हम आठ से 96 अच्छी तरह प्लेटें (चित्रा 1 देखें) चार प्लेटों प्रत्येक के चक्कर में दो बैचों से एक दिन के भीतर दाग और स्कैन किया जा सकता है कि आशा. इस आकलन के निर्धारण के लिए 20 मिनट हो जाती है, कपड़े धोने के लिए 30 मिनट, washes के 30 मिनट के द्वारा पीछा 2 घंटा प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन अवरुद्ध करने में 30 मिनट, washes के 30 मिनट के द्वारा पीछा 1 घंटा माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन, 30 मिनट DRAQ5 + नीलम 30 के द्वारा पीछा washes, और 4 प्लेटों के लिए स्कैन समय के 34 मिनट के मिनट. पंद्रह अतिरिक्त मिनट चार व्यक्ति प्लेटों के कंपित pipetting के लिए खाते के क्रम में washes के लिए चित्रा 1 में सकारात्मक असर कर रहे हैं. डेटा विश्लेषण के लिए समय इस आकलन में शामिल नहीं है. एटीपी परख माप हर अवरक्त थाली के लिए समानांतर में हो जाएगा, तो बारह प्लेटें एक दिन में assayed किया जा सकता है - इन्फ्रारेड दाग के लिए छहएस और एटीपी के स्तर के लिए छह.

प्रतिगमन विश्लेषण में संतोषजनक डेटा (चित्रा 3) के लिए मानदंड, प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लेख किया है, चढ़ाना घनत्व और सिग्नल की शक्ति (0.05 ≤ दो पूंछ पी) के बीच एक महत्वपूर्ण संबंध भी हैं. luminescence या अवरक्त संकेत में परिवर्तन का आकार भी कोशिकाओं की संख्या में परिवर्तन के अनुपात में होना चाहिए. आदर्श रूप में, 5k कोशिकाओं लगभग आधा luminescence या 10k कोशिकाओं की एटीपी स्तर होना चाहिए, और 15k कोशिकाओं आदि 10k कोशिकाओं की तुलना में लगभग 50% अधिक से अधिक मूल्यों होनी चाहिए. इस समानता परख की संवेदनशीलता को दर्शाता है और दृढ़ संकल्प की आर 2 मूल्य या गुणांक से अलग है. प्रतिगमन लाइन सच डेटा बिंदुओं का अनुमान लगाती कैसे अच्छी तरह से आर 2 ही उपाय. डेटा रैखिक रहे हैं, भले ही सिग्नल की शक्ति में रिश्तेदार परिवर्तन सेल नंबर में परिवर्तन के आकार के अनुपात में नहीं हो सकता है. यह डब्ल्यू हो सकता हैमुर्गी प्रतिगमन लाइन परख बहुत संवेदनशील नहीं है, सुझाव है कि एक उच्च आर 2, लेकिन एक कम ढाल दिया है. इस प्रकार, महत्वपूर्ण संबंध और डेटा की समानता के मापदंड दोनों संतुष्ट होना चाहिए. अंत में, इष्टतम चढ़ाना घनत्व के आसपास सिग्नल की शक्ति में परिवर्तन साधन और परख के गतिशील रेंज के भीतर गिर चाहिए. गतिशील रेंज के सबसे बड़े और सबसे छोटी संभव मूल्यों के बीच का अनुपात है. ओडिसी इमेजर 4.5 प्रवेश गतिशील रेंज है और संतृप्त संकेत परिणाम अब quantifiable हैं कि अनुसंधानकर्ता को सचेत करने के क्रम में सामान्य लाल या हरी छवि के स्थान पर एक चमकदार सफेद रंग के रूप में दिखाता है. परख के दौरान ही गतिशील रेंज क्योंकि इस तरह के किसी भी कोशिका प्रकार के लिए अधिक से अधिक और कम से कम चढ़ाना घनत्व जैसे मुद्दों का संकरा है. सेल घनत्व में वृद्धि पर एक प्लेटें तो वे से बाहर हैं, क्योंकि इन assays के लिए संतृप्ति वक्र, या तो आगे कोई मतभेद हल किया जा सकता है, जो ऊपर चढ़ाना घनत्व खोलेगासीमा इमेजर की वजह से या कोशिकाओं रातोंरात भीड़ जीवित नहीं है. एक प्लेटें सेल घनत्व को कम इसी प्रकार, यदि एक संकेत में आगे कोई परिवर्तन कर रहे हैं जो नीचे न्यूनतम सेल घनत्व माप सकते हैं. परख के गतिशील रेंज केवल न्यूनतम और हल किया जा सकता है कि कोशिकाओं / अच्छी तरह से की अधिकतम संख्या के बीच चढ़ाना घनत्व भी शामिल है. हमारी कोशिकाओं रिपोर्ट कर रहे हैं कि उन परे घनत्व में अच्छी तरह से जीवित नहीं है क्योंकि हम इन विशेष assays के लिए पूर्ण गतिशील रेंज मापा नहीं है.

अनुकूलन के बाद, अब हम एक 1:2000 कमजोर पड़ने पर विरोधी माउस आईजीजी साथ, एक 1:10,000 कमजोर पड़ने पर विरोधी α-ट्यूबिलिन साथ N2a माउस neuroblastoma कोशिकाओं दाग, और 1:20,000 और 1:2,000 पर DRAQ5 + नीलम समाधान के साथ, क्रमशः. हम भी 50 μl मीडिया में एटीपी परख अभिकर्मकों के 25 μl का उपयोग करें. इन परिस्थितियों में परिणाम आंकड़े 3 ए, बी, और सी में सचित्र हैं और befor प्रकाशित किया गया हैई 8. सभी तीन assays में सिग्नल शक्ति काफी अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं की संख्या के साथ सहसंबद्ध था. सभी तीन assays उच्च रैखिक थे, वे संवेदनशीलता में बराबर नहीं थे. उदाहरण के लिए, अच्छी तरह से प्रति 5k कोशिकाओं अच्छी तरह से प्रति 10k कोशिकाओं के रूप में अवरक्त धुंधला की ठीक आधी राशि भी नहीं था. अवरक्त assays के विपरीत, एटीपी परख चढ़ाना घनत्व में परिवर्तन करने के लिए अधिक संवेदनशील था. दूसरे शब्दों में, luminescence 5k से अच्छी तरह से प्रति 2.5k कोशिकाओं को 5k और करने के लिए 10k से लगभग आधे से गिर गया. एटीपी परख के उच्चतम संवेदनशीलता पर इन निष्कर्षों के बावजूद, यह सेलुलर स्वास्थ्य का एक व्यापक तस्वीर प्राप्त करने के लिए व्यवहार्यता के लिए सभी तीन assays के प्रदर्शन करने के लिए सबसे अच्छा है.

अब हम एक 1:1,000 कमजोर पड़ने पर विरोधी माउस आईजीजी साथ एक 1:2,000 कमजोर पड़ने, पर विरोधी MAP2 साथ चूहे प्राथमिक neuronal संस्कृतियों दाग, और क्रमशः 1:10,000 और 1:1,000, पर DRAQ5 + नीलम समाधान के साथ, और 25 का उपयोग 50 μl मीडिया (आंकड़े में एटीपी परख अभिकर्मकों के μl3 डी, ई, और एफ). 700 एनएम चैनल में 100k और अच्छी तरह से प्रति 200k कोशिकाओं के बीच थोड़ा अंतर था क्योंकि DRAQ5 + नीलम परख में सिग्नल शक्ति सभी तीन assays के कम से कम रैखिक था. हालांकि, 700 एनएम पर सिग्नल की शक्ति का अच्छी तरह से प्रति 100k कोशिकाओं नीचे सेल संख्या के अनुपात में अच्छी तरह से किया गया था और हम हमेशा वैसे भी अच्छी तरह से प्रति 100k कोशिकाओं में neuronal संस्कृतियों थाली. बहरहाल, हम भी DRAQ5 + नीलम परख (नीचे देखें) अन्य दो assays के रूप में विष उपचार के रूप में संवेदनशील नहीं है कि मनाया है. DRAQ5 + नीलम के विपरीत, सिग्नल की शक्ति MAP2 और एटीपी assays दोनों के लिए चढ़ाना घनत्व के साथ बेहतर अनुपात में था. यह एटीपी परख अभिकर्मकों का अधिक से अधिक मात्रा में अच्छी तरह से प्रति 200k कोशिकाओं में परिणामों में सुधार कर सकते हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए. अधिक अभिकर्मक है क्योंकि वहाँ दूसरे शब्दों में, luminescent उत्पादन में अच्छी तरह से प्रति 100k कोशिकाओं में मूल्यों का बिल्कुल 200% करने के लिए उठाया जा सकता है. हालांकि, हम experime के लिए कि उच्च एक चढ़ाना घनत्व में cortical संस्कृतियों थाली कभी नहींएनटीएस. हम भी MAP2 और एटीपी के स्तर में अच्छी तरह से प्रति 20k कोशिकाओं से अच्छी तरह से 22 प्रति 120k कोशिकाओं से लेकर neocortical neuronal चढ़ाना घनत्व में 20% परिवर्तन के प्रति संवेदनशील हो पाया है. फिर भी, अन्य जांचकर्ताओं बल्कि क्योंकि ऊतकों और सेल से निपटने में अंतर - प्रयोगशाला परिवर्तनशीलता के हमारे प्रयोगों से इष्टतम स्थितियों का उपयोग करने से अपने स्वयं के प्रयोगशाला में इन assays का परीक्षण करना चाहिए.

विषाक्त पदार्थों के साथ उपचार के बाद इन assays की उपयोगिता को वर्णन करने के लिए, हम MG132, एक एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला (चित्रा 4) के साथ इलाज N2a कोशिकाओं की खुराक प्रतिक्रिया घटता दिखा. MG132 glutathione अग्रदूत एन एसिटाइल सिस्टीन की उपस्थिति या अनुपस्थिति में लागू किया गया था. ये आंकड़े यह भी एन एसिटाइल सिस्टीन 30 के सुरक्षात्मक प्रभाव पर अपने हाल के एक प्रकाशन में पाया जा सकता है. प्रकोष्ठों MG132 उपचार के बाद 48 घंटा assayed गया. MG132 खुराक dependently DRAQ5 + नीलम संकेत (आंकड़े -4 ए, डी) और α-ट्यूबिलिन संकेत (कमी हुई 50 मूल्यों को निकालने के लिए एक nonlinear प्रतिगमन विश्लेषण प्रदर्शन किया. इस्तेमाल किया समीकरण y = 100 / था () 1 + 10 ^ ((तर्क 50 एक्स * HillSlope))). DRAQ5 + नीलम के लिए आईसी 50 मूल्य (तर्क 50 = 0.22 ± 0.03, आर 2 = 0.9477, हिल ढलान = -1.26) और α-ट्यूबिलिन स्तरों के लिए 1.96 माइक्रोन MG132 (तर्क 50 = 0.29 ± 0.04, आर था 1.64 माइक्रोन MG132 था = 0.9296 2, हिल ढलान = -1.349). एन एसिटाइल सिस्टीन अधिक MG132 इस सुरक्षात्मक परिसर की उपस्थिति में कोशिकाओं को मारने के लिए आवश्यक था, सुझाव है कि सही करने के लिए घटता स्थानांतरित कर दिया. एन एसिटाइल सिस्टीन की उपस्थिति में, DRAQ5 + नीलम के लिए आईसी 50 मूल्य 4.64 माइक्रोन MG132 (तर्क 50 = 0.67 ± 0.05, आर 2 = 0.8732, हिल ढलान = -1.06) था और α-ट्यूबिलिन के लिए 6.35 माइक्रोन MG132 (था तर्क 50 = 0.80 ± 0.04, आर = 0.8802 2, हिल ढलान = -1.382). MTT परख 31 से मापा Madeira और उनके सहयोगियों द्वारा N2a कोशिकाओं के एक अध्ययन में 10 माइक्रोन MG132 पर व्यवहार्यता का लगभग 50% नुकसान की सूचना दी. Fioriti MTT परख 32 के साथ फिर से, 50 माइक्रोन MG132 के साथ इलाज के बाद व्यवहार्यता 4 घंटा की 60% नुकसान की सूचना दी. अंत में, जांग और उनके सहयोगियों Hoechst दाग नाभिक 33 की गिनती का उपयोग, 10 माइक्रोन MG132 पर व्यवहार्यता का 60% नुकसान की सूचना दी. ये आईसी 50 मूल्यों हमारी तुलना में अधिक है. हालांकि, हम इन पिछले अध्ययनों के विपरीत, उपचार की दीक्षा के बाद व्यवहार्यता 48 घंटे के लिए परख.

सेल टिटर Glo परख के मुताबिक, एटीपी के स्तर एटीपी के स्तर उपचार पर सेल टिटर के अनुपात में जरूरी नहीं हैं कि प्रदर्शन MG132 (चित्रा 4C) की कम मात्रा में उठाए गए थे. एटीपी डेटा वे N2a कोशिकाओं MG132 के साथ व्यवहार कर रहे हैं जब एन एसिटाइल सिस्टीन भी चयापचय समारोह की सुरक्षा करता है कि वर्णन में फिर भी उपयोगी होते हैं. यह टी में इसका सबूत हैवह एन एसिटाइल सिस्टीन साथ MG132 के आईसी 50 मूल्य में बदलाव. एटीपी के लिए आईसी 50 मूल्य 3.05 माइक्रोन MG132 था (तर्क 50 = 0.48 ± 0.07, आर 2 = 0.8616, हिल ढलान = -1.0) वाहन और एन एसिटाइल सिस्टीन (तर्क 50 = 0.96 ± 0.04, आर 2 के साथ 9.12 माइक्रोन MG132 के साथ = 0.9261, हिल ढलान = -1.0). एटीपी में उगता है कि नेतृत्व सांद्रता इस विश्लेषण में बाहर रखा गया है ध्यान दें. विश्लेषण में सभी मान सहित दृढ़ संकल्प के गुणांक उतारा और वाहन की उपस्थिति में और 9.24 माइक्रोन MG132 के लिए 4.03 माइक्रोन MG132 (तर्क 50 = 0.61 ± 0.09, आर 2 = 0.7224, हिल ढाल = -1.4) के लिए आईसी 50 मूल्यों में वृद्धि हुई (तर्क 50 = 0.96 ± 0.07, आर 2 = 0.6607, हिल ढाल = -2.1) एन एसिटाइल सिस्टीन (चित्रा 4C के साथ इसके विपरीत) की उपस्थिति में.

इन तीन assays के एक दूसरा उदाहरण Figur में प्राथमिक संस्कृतियों के लिए सचित्र हैई 5. ऊतक अच्छी तरह से प्रति 100k कोशिकाओं पर चढ़ाया, अलग, चूहे neocortex और allocortex से microdissected, और एच 2 ओ 2 के साथ समानांतर में इलाज किया गया था. हम वे neurodegenerative रोगों 34-39 के लिए विभिन्न प्रकार से कमजोर कर रहे हैं के रूप में इन दो मस्तिष्क क्षेत्रों oxidative तनाव से अपने को संभालने में अलग होगा कि परिकल्पना का परीक्षण किया. इन आंकड़ों से कुछ पहले प्रकाशित किया गया है और परिणाम है कि अध्ययन 22 में आगे चर्चा कर रहे हैं. DRAQ5 + नीलम के लिए आईसी 50 मूल्यों (तर्क 50 = 1.36 ± 0.07, आर 2 = 0.7552, हिल ढलान = -0.95) neocortex में 22.84 माइक्रोन एच 2 2 हे थे और allocortex में 24.63 माइक्रोन एच 2 ओ 2 (तर्क 50 = 1.39 0.03 ±, आर 2 = 0.9379, हिल ढलान = -1.74). MAP2 के लिए आईसी 50 मूल्यों neocortex में 11.66 माइक्रोन एच 2 2 हे थे (तर्क 50 = 1.07 ± 0.04, आर 2 = 0.9332, हिल ढलान = -2.13) और 29.76 माइक्रोन एच allocortex में 2 2 हे (तर्क 50 = 1.47 ± 0.04, आर 2 = 0.8934, हिल ढलान = -4.45). एटीपी के लिए आईसी 50 मूल्यों (तर्क 50 = 1.38 ± 0.03, आर 2 = 0.8907, हिल ढलान = -2.56) neocortex में 23.82 माइक्रोन एच 2 2 हे थे और allocortex में 44.5 माइक्रोन एच 2 ओ 2 (तर्क 50 = 1.65 ± 0.03 , आर 2 = 0.9204, हिल ढलान = -2.71). Allocortex एच 2 ओ 2 माइक्रोन 50 से नीचे की सांद्रता में काफी neocortex से oxidative तनाव के लिए प्रतिरोधी था, लेकिन DRAQ5 + नीलम परख इस अंतर illustrating में कम से कम संवेदनशील था. यह बाद परख MAP2 के विपरीत, न्यूरॉन्स से glia भेद नहीं कर सकते कि प्रतिबिंबित कर सकते हैं. जैसा कि पहले उल्लेख वे प्रसव के बाद मस्तिष्क 22 से काटा जाता है के रूप में, हमारी संस्कृति, कुछ glia होते हैं. हैरानी की बात है, एच 2 ओ 2 (75 माइक्रोन और ऊपर), जब सभी MAP2 की उच्च सांद्रता में + astrocytes MAP2 + न्यूरॉन्स से एच 2 ओ 2 के लिए प्रतिरोधी रहे हैं कि हमारी प्रारंभिक निष्कर्षों के आधार पर () नहीं दिखाया है, हम neocortical astrocytes allocortical astrocytes से oxidative नुकसान को कम जोखिम रहता है कि परिकल्पना है. Oxidatively क्षतिग्रस्त astrocytes मुमकिन व्यवहार्य नहीं कर रहे हैं क्योंकि यह पैटर्न DRAQ5 + नीलम परख लेकिन एटीपी परख नहीं परिलक्षित हो सकती है. कारण इन हड़ताली पैटर्न के लिए, इन प्राथमिक संस्कृति डेटा यहाँ सचित्र हैं जो कुछ ही assays के समझौते में हमेशा नहीं कर रहे हैं प्रकट करने के लिए.

अंत में, सभी तीन assays के साथ intraplate परिवर्तनशीलता को वर्णन करने के क्रम में, हम आंकड़े 6A सी और 6G-I में उपरोक्त खुराक प्रतिक्रिया घटता से दूसरे और तीसरे वेल्स 'कच्चे डेटा बिंदुओं साजिश रची >. इसी तरह, interplate परिवर्तनशीलता को वर्णन करने के क्रम में, हम आंकड़े 6D एफ और 6j-L में दो प्लेटों से कच्चे डेटा बिंदुओं का औसत (तीन प्रतियों कुओं का मतलब) साजिश रची. दोहराने के कुओं में और स्वतंत्र प्रयोगों भर में सिग्नल शक्ति हर उपाय के लिए महत्वपूर्ण सहसंबंध का प्रदर्शन किया. प्राथमिक neuronal संस्कृतियों में स्वतंत्र प्रयोगों भर में कच्चे मूल्यों में कुछ परिवर्तनशीलता हम पुराने एंटीबॉडी का पुन: उपयोग और DRAQ5 + नीलम समाधान और अप्रयुक्त एटीपी परख समय की एक जोड़ी अभिकर्मकों फ्रिज, शायद क्योंकि वहाँ था. प्राथमिक संस्कृतियों में उच्च interplate परिवर्तनशीलता के लिए एक अन्य कारण यह संस्कृति ही की गुणवत्ता हो सकता है. विभिन्न प्रयोगात्मक दिनों बदलती भर पोस्टमार्टम के अंतराल और ऊतक से निपटने के विचरण करने के लिए योगदान कर सकते हैं.

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दिखाया अवरक्त assays (बी) के लिए सभी तीन व्यवहार्यता assays (ए) और समय की चित्रा 1. योजनाबद्ध चित्रण. N2a कोशिकाओं के लिए सिफारिश की प्रक्रियाओं हैं. DRAQ5 + नीलम समाधान विभिन्न माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं कि अन्य प्लेटों पर पुन: उपयोग किया जा करने के लिए नहीं जा रहे हैं, वे एक कदम से प्रक्रिया को कम करने, एक अंतिम 1 घंटे ऊष्मायन के लिए विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ जोड़ा जा सकता है. यहां क्लिक करें बड़ी छवि को देखने के लिए.

चित्रा 2
एटीपी परख (ए) और प्रक्रियाएं खंड में वर्णित है कि अवरक्त assays (बी) के चित्रा 2. प्लेट प्रारूप. हालांकि एक96 अच्छी तरह से थाली इन assays अभिकर्मकों और कोशिकाओं को बचाने के लिए, इस तरह के 384 अच्छी तरह से प्लेटों के रूप में अन्य प्रारूपों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, यह साफ है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. N2a माउस neuroblastoma कोशिकाओं में सभी तीन व्यवहार्यता assays (ए, बी, सी) या प्राथमिक प्रसव के बाद चूहे neocortical न्यूरॉन्स (डी, ई, एफ) के लिए रेखीय प्रतिगमन. प्रत्येक परख के लिए सिग्नल शक्ति चढ़ाना घनत्व के एक समारोह के रूप में साजिश रची है. Insets DRAQ5 + नीलम (ए, डी), α-ट्यूबिलिन (बी), या MAP2 (ई) दाग के प्रतिनिधि अवरक्त छवियों को दिखाने के. कच्चे तीव्रता मूल्यों प्रत्येक छवि के नीचे सूचीबद्ध हैं. कि कच्चे मूल्यों में नोटएक व्यक्ति को अच्छी तरह से है कि प्रयोग के लिए 3 कुओं की औसत से और 3-4 स्वतंत्र प्रयोगों की औसत से अलग हो सकता है. मूल अवरक्त छवियों (700 एनएम) या ग्रीन (800 एनएम) लाल pseudocolored गया. प्रत्येक प्रयोग तीन प्रतियों कुओं में प्रदर्शन किया और DRAQ5 + नीलम के लिए 3x दोहराया N2a कोशिकाओं और प्राथमिक न्यूरॉन्स दोनों में, 3x α-ट्यूबिलिन, 4x लिए MAP2 के लिए, 3x एटीपी लिए N2a कोशिकाओं में था, और न्यूरॉन्स में एटीपी के लिए 4x. तीन प्रतियों कुओं से डेटा 3-4 प्रयोगों में से प्रत्येक के लिए एक अंतिम मूल्य के लिए औसत थे. इन 3-4 अंतिम मूल्यों का मतलब और SEM ग्राफ में दिखाया गया है. SEM सलाखों दिखाई नहीं देते हैं कि इतने DRAQ5 + नीलम मूल्यों कम मानक विचलन दिखा रहे हैं ध्यान दें. दृढ़ संकल्प और संबंध के महत्व का आकलन दो पूंछ पी मूल्य की आर 2 गुणांक भी प्रत्येक को मापने के लिए सचित्र हैं. डाटा GraphPad चश्मे (संस्करण 5.0) में विश्लेषण किया गया. Unnith द्वारा एक neurochemistry इंटरनेशनल, 61, से पुनर्प्रकाशितएक एट अल: Elsevier से अनुमति के साथ पी 356-368, "एन एसिटाइल सिस्टीन, साथ neurodegeneration के एक दो हिट उच्च throughput मॉडल से बचाव". बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
MG132 विषाक्तता के खिलाफ N2a कोशिकाओं की चित्रा 4. संरक्षण. N2a कोशिकाओं एंटीऑक्सीडेंट एन एसिटाइल सिस्टीन (3 मिमी एनएसी) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में एंटीबॉडी अवरोध करनेवाला MG132 के संकेत सांद्रता के साथ इलाज किया गया. सभी तीन व्यवहार्यता assays के 48 घंटा बाद में प्रदर्शन किया गया. MG132 (सी) की कम मात्रा में एटीपी के स्तर में वृद्धि के नोट. DRAQ5 + नीलम धुंधला (ए) ओ में कोई समानांतर वृद्धिआर α-ट्यूबिलिन (बी) स्पष्ट किया गया था. DRAQ5 + नीलम और α-ट्यूबिलिन दाग के प्रतिनिधि अवरक्त छवियों क्रमशः, डी और ई में लाल और हरे रंग pseudocolored गया. प्रत्येक प्रयोग तीन प्रतियों कुओं में प्रदर्शन किया और α-ट्यूबिलिन के लिए DRAQ5 + नीलम, 4x के लिए 4x दोहराया, और एटीपी के लिए 3x किया गया था. तीन प्रतियों कुओं से डेटा 3-4 प्रयोगों में से प्रत्येक के लिए एक अंतिम मूल्य के लिए औसत थे. इन 3-4 अंतिम मूल्यों का मतलब और SEM दिखाया गया है. * पी ≤ पानी बनाम एन एसिटाइल सिस्टीन की तुलना के लिए 0.05, दो तरह से एनोवा निम्नलिखित Bonferroni सुधार. डाटा GraphPad चश्मे (संस्करण 5.0) में विश्लेषण किया गया. तंत्रिका विज्ञान, 255 से पुनर्प्रकाशित, जियांग एट अल द्वारा:. Elsevier से अनुमति के साथ, पी. 19-32 "एन एसिटाइल सिस्टीन, एक गर्मी झटका प्रोटीन पर निर्भर ढंग से proteotoxicity blunts" सीबड़ी छवि को देखने के लिए यहां चाटना.

चित्रा 5
चित्रा 5. हाइड्रोजन पेरोक्साइड विषाक्तता को neocortical और allocortical संस्कृतियों का विभेदक भेद्यता. प्रसव के बाद प्राथमिक मोटर और संवेदी neocortex की और entorhinal और piriform allocortex की Microdissections अच्छी तरह से प्रति 100k कोशिकाओं को अलग और चढ़ाया गया. इन विट्रो 2 में दिन पर, कोशिकाओं एच 2 ओ 2 के संकेत सांद्रता के साथ इलाज किया गया. प्लेट्स 48 घंटा बाद assayed गया. कि allocortex neocortex से बेहतर इन संवर्धन शर्तों बचता है और बेस लाइन पर उच्च सेल नंबर नोट. प्रत्येक प्रयोग तीन प्रतियों कुओं में प्रदर्शन किया और MAP2 के लिए DRAQ5 + नीलम, 3x के लिए 4x दोहराया, और एटीपी के लिए 6x गया था. तीन प्रतियों कुओं से डेटा औसत थे3-6 प्रयोगों में से प्रत्येक के लिए एक अंतिम मूल्य के लिए. इन 3-6 अंतिम मूल्यों का मतलब और SEM दिखाया गया है. * पी ≤ नव बनाम allocortex, दो तरह से एनोवा निम्नलिखित Bonferroni सुधार की तुलना के लिए 0.05. डाटा GraphPad चश्मे (संस्करण 5.0) में विश्लेषण किया गया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
चित्रा 6. MG132 और एच 2 N2a कोशिकाओं और cortical न्यूरॉन्स में ओ 2 खुराक प्रतिक्रिया घटता के लिए Intraplate और interplate सहसंबंध. सभी व्यक्तिगत प्रयोगों तीन प्रतियों कुओं में चलाए जा रहे थे. प्लेट (ए के भीतर reproducibility को मापने के लिए 1 और 2 replicates के रूप में प्रत्येक समूह के भीतर दूसरा दो कुओं से कच्चे डेटा, साजिश रची गया जी, एच के लिए सी, और प्रांतस्था के लिए मैं). दो स्वतंत्र प्रयोगों (तीन प्रतियों कुओं का मतलब) में एक ही समूह से डाटा प्लेटें भर reproducibility को मापने के लिए प्लेट 1 और प्लेट 2 प्लॉट के रूप में (डी, ई, और N2a कोशिकाओं और जम्मू, कश्मीर, प्रांतस्था के लिए एल के लिए एफ) थे. दृढ़ संकल्प और संबंध के महत्व का आकलन दो पूंछ पी मूल्य की आर 2 गुणांक भी प्रत्येक को मापने के लिए सचित्र हैं. डाटा GraphPad चश्मे (संस्करण 5.0) में विश्लेषण किया गया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

हम सभी तीन व्यवहार्यता assays में सिग्नल की शक्ति रैखिक और चढ़ाना घनत्व के साथ सहसंबद्ध है कि मिल गया है. लेकिन, नहीं सभी assays 2 गुना या चढ़ाना घनत्व में 1.5 गुना परिवर्तन करने के लिए समान रूप से संवेदनशील हैं. N2a कोशिकाओं के लिए, अवरक्त assays विशेष रूप से कम चढ़ाना घनत्व, एटीपी परख की तुलना में कम संवेदनशील होते हैं. अवरक्त assays एटीपी की तुलना में कम संवेदनशील होते हैं, DRAQ5 + नीलम assays और α-ट्यूबिलिन assays में है कि वे एन एसिटाइल सिस्टीन की अत्यधिक सुरक्षात्मक प्रभाव प्रकट अच्छा समझौते में हैं. वहाँ दोनों assays के साथ अवरक्त संकेत की खुराक उत्तरदायी नुकसान था और सभी तीन व्यवहार्यता घटता एन एसिटाइल सिस्टीन साथ सही करने के लिए स्थानांतरित कर दिया गया. Α-ट्यूबिलिन और एटीपी assays DRAQ5 + नीलम परख (उन्नीथन एट अल में देखें चित्रा 4 से ऐसे अमोनियम क्लोराइड के रूप में यौगिकों के लिए अधिक संवेदनशील होने लगते हैं के रूप में इस ओवरलैप हमेशा N2a कोशिकाओं के उपचार के सभी प्रकार के लिए नहीं मनाया जाता है. 8 ). इस प्रकार, व्यवहार्यता phenotypतों हमेशा समान रूप से सभी तीन assays के द्वारा प्रतिनिधित्व नहीं कर रहे हैं. एटीपी परख α-ट्यूबिलिन और DRAQ5 + नीलम assays, शक्ति सेल नंबर को दर्शाता संकेत है कि इस धारणा से चढ़ाया N2a कोशिकाओं की संख्या को बेहतर अनुपात में था हालांकि हमेशा विष उपचार के बाद मुलाकात नहीं की गई थी. एटीपी के स्तर अवरक्त assays में संकेत में एक ऐसी ही वृद्धि नहीं बटोर कि विष सांद्रता में गुलाब. इन आंकड़ों एंटीबॉडी निषेध के जवाब में N2a कोशिकाओं में प्रतिपूरक चयापचय परिवर्तनों का पता चलता है और अपने आप में उपयोगी होते हैं. यू के आकार एटीपी खुराक प्रतिक्रिया वक्र hormesis बुलाया घटना की विशेषता है. Hormesis विषाक्त पदार्थों और अन्य तनाव 40-42 के लिए निम्न स्तर के जोखिम के लिए अनुकूल जैविक प्रतिक्रियाओं के रूप में परिभाषित किया गया है.

न्यूरॉन्स के लिए, DRAQ5 + नीलम दाग उच्च चढ़ाना घनत्व पर MAP2 और एटीपी assays की तुलना में कम संवेदनशील था. हालांकि, DRAQ5 + नीलम, MAP2, और एटीपी assays CE के अनुपात में अच्छी तरह से थेअच्छी तरह से प्रति 100k कोशिकाओं पर या नीचे प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स में डालूँगा संख्या. हम अच्छी तरह से प्रति 100k कोशिकाओं में न्यूरॉन्स थाली. प्रांतस्था से न्यूरॉन्स को दोहराने के लिए नहीं जाना जाता है, इसलिए हम 100k या कम चढ़ाना घनत्व पर linearity के बारे में अधिक चिंतित थे. DRAQ5 + नीलम परख 50 माइक्रोन एच 2 ओ 2 नीचे सांद्रता में MAP2 या एटीपी किसी से neocortex और allocortex के बीच मतभेदों को कम संवेदनशील था. इसके अलावा, एटीपी के स्तर एच पर के रूप में नाटकीय रूप से गिरावट नहीं किया 2 हे शायद फिर से एटीपी उत्पादन में प्रतिपूरक बढ़ जाती सुझाव अन्य दो assays में अवरक्त संकेत के रूप में 2 उपचार,. N2a कोशिकाओं और प्राथमिक न्यूरॉन्स में तीन assays के बीच फ़र्क सकल संरचनात्मक ढांचे प्रभावित हैं पहले सेलुलर कार्यों को बदल सकते हैं कि प्रतिबिंबित कर सकते हैं, और cytoskeletal प्रोटीन सहित कि सेल संरचनाओं, कोशिकाओं स्वयं खो रहे हैं लंबे समय से पहले प्रभावित किया जा सकता है. खांसने मल्टीप्लेक्स व्यवहार्यता गिल्बर्ट द्वारा assays और उनके सहयोगियों पर हाल के आंकड़ेऐसे Hoechst परमाणु धुंधला और एटीपी माप के रूप में अलग व्यवहार्यता उपाय केवल आंशिक रूप से और परोक्ष रूप से एक पूरे 26 के रूप में व्यवहार्यता को प्रतिबिंबित कि विशिष्ट सेलुलर विशेषताओं पर जानकारी उपज कि वर्णन. इसलिए हम के रूप में कई प्रकाशनों करते चयापचय व्यवहार्यता के लिए एक एकल परख पर भरोसा एक साथ और नहीं सभी तीन assays के प्रदर्शन की सिफारिश. इन उपायों में से किसी एक पर अधिक जानकारी के लिए, हम व्यक्ति की कोशिकाओं की गिनती और तब कक्ष संख्या के एक समारोह के रूप में cytoskeletal प्रोटीन अभिव्यक्ति और एटीपी के स्तर का आकलन करने की सलाह देते हैं.

ऐसे MTT के रूप में चयापचय व्यवहार्यता के लिए अन्य assays, हालांकि वहां एटीपी परख का लाभ इसकी संवेदनशीलता और गतिशील रेंज में है. MTT परख एटीपी माप की तुलना में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या overestimate और 43 दो गुना अधिक है कि एक आईसी 50 दर्शाती कर सकते हैं. इसके अलावा, छोटे और उनके सहयोगियों ने बताया कि एटीपी परख सकता हैMTT परख से कम 25k कोशिकाओं / अच्छी तरह से 12 का पता नहीं लगा सकता है, जबकि अच्छी तरह से प्रति 1,563 कोशिकाओं की निचली सीमा का पता लगाने. संकेत करने वाली शोर अनुपात (कोई कोशिकाओं के साथ कुओं बनाम जीवित कोशिकाओं के साथ कुओं से संकेत) एटीपी 44 के लिए केवल 7 MTT के लिए लेकिन 230 है. MTT से अधिक luminescent एटीपी assays का एक और लाभ ऊष्मायन समय बहुत कम है. इसके अलावा, Promega से MTT परख ही निर्माता से सेल टिटर Glo परख हमारी सिफारिश dilutions में अच्छी तरह से प्रति 0.09 ¢ लागत जबकि अच्छी तरह से प्रति 0.28 ¢ खर्च होती है. हालांकि, सभी चयापचय assays के लिए सीमाएं हैं, चयापचय गतिविधि विशेष रूप से गल जाना दौरान, अस्तित्व से uncoupled हो सकता है. यह एक चिंता का विषय है, वर्तमान रिपोर्ट में assays झिल्ली अखंडता के नुकसान का पता लगाने के लिए लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज रिहाई की माप के साथ जोड़ा जा सकता है. लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज माप बस कोशिकी मध्यम में किया जाता है, क्योंकि यह किसी भी अतिरिक्त प्लेटें शामिल नहीं होगा.

हम माइक्रोस्कोप पर मैनुअल गिनती के लिए विकल्प के रूप में इन assays उपस्थित हालांकि ठीक से आयोजित अगर, बाद नमूना सेल नंबर की एक बेहद संवेदनशील और सटीक साधन हो सकता है. दरअसल, हम Hoechst दाग नाभिक की गिनती DRAQ5 + नीलम परख से N2a सेल संख्या में छोटे बदलाव करने के लिए अधिक संवेदनशील होना होगा कि उम्मीद है. Assays के सभी linearity परीक्षण असफल हो, मार्गदर्शन की गिनती के लिए आवश्यक हैं. इस का एक अच्छा उदाहरण है कि हम अधिक श्रमसाध्य पुस्तिका 45 मायने रखता है जो प्रदर्शन पर हमारे सभ्य प्राथमिक astrocyte मॉडल, है. सेल गिनती डेटा की व्याख्या करते हैं, तथापि, मार्गदर्शन की गिनती के निहित पूर्वाग्रहों कम्प्यूटरीकृत assays के निहित खामियों को खारिज नहीं किया जाना चाहिए, जैसा मन में वहन किया जाना चाहिए. व्यवहार्यता assays की शक्तियों और कमजोरियों का एक संख्या इसलिए नीचे वर्णित है.

DAPI या Hoechst दाग कार्यरत हैं पहला, अगर, सिकुड़ा हुआ और गाढ़ा नाभिक अक्सर के रूप में नामित कर रहे हैंapoptotic 1. हालांकि, सेल आकार और नाभिक का संक्षेपण एक चिकनी निरंतरता के साथ झूठ बोलते हैं. इसके विपरीत, जीवन और मृत्यु परस्पर अनन्य, बाइनरी घटनाएं हैं. रहते हैं या मर कोशिकाओं के दो बहुत अलग समूहों मनाया जाता है, जब तक कि यह ऐसी MetaMorph या ImageJ रूप के बजाय आंख से इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ के रूप में apoptotic एक सीमा परमाणु व्यास से नीचे के सभी कक्षों की गिनती करने के लिए सबसे अच्छा लगता है. हम एक अपरिवर्तनीय apoptotic झरना शुरू की है क्या बिंदु पर पता नहीं है क्योंकि बेशक, एक सीमा व्यास के लिए चुनाव मनमाना है. इसके अलावा, परिभाषा से, सक्रिय कस्पासे 3 के साथ भी कोशिकाओं मौत के लिए रास्ते में जरूरी नहीं हैं और शायद निर्धारण 46 के समय में अभी भी जीवित के रूप में गिना जाना चाहिए. हमारे अवरक्त assays के निर्धारण के समय थाली के रूप में अभी भी रहते जुड़े होते हैं कि सभी कोशिकाओं के इलाज से इस तरह की चिंताओं से बचें. केवल दूर मंगाई है कि कोशिकाओं के मृत के रूप में गिने जाते हैं. यह दो अलग श्रेणियों में से किसी में कोशिकाओं देता है और एक सह का उपयोग कर के नुकसान से बचा जाता हैmplex, परमाणु व्यास की तरह निरंतर कार्य करते हैं.

दूसरा, पुस्तिका मायने रखता है आम तौर पर पूरे अच्छी तरह का एक छोटा सा अंश नमूना. यह नमूना पूर्वाग्रह के लिए नेतृत्व और, मतलब के अवसर पर, उच्च मानक त्रुटियों कर सकते हैं. हमारे व्यवहार्यता assays के साथ, पूरे अच्छी तरह से एटीपी के लिए नमूना है और पूरे अच्छी तरह से बंद करने के लिए अवरक्त assays के साथ नमूना है. यह नमूना पैटर्न नमूने का आकार बढ़ता है और मार्गदर्शन की गिनती के लिए एक तस्वीर तस्वीर के लिए जहां अच्छी तरह से में की कभी कभी मनमाना निर्णय टाल. तस्वीरों में अच्छी तरह से केंद्र का लिया जाता है, तो एक कोशिकाओं की सबसे धोना बंद विषाक्तता के संभावित overestimates के लिए अग्रणी होता है, जहां इस क्षेत्र है कि ध्यान में रखना चाहिए. इसके विपरीत, अवरक्त assays ही कुओं की चरम कोनों शामिल नहीं है कि 96 अच्छी तरह से थाली की छवि पर एक ग्रिड फेंक देते हैं. तो अगर वांछित, कुओं के कोनों ग्रिड में हलकों के व्यास में वृद्धि से शामिल किया जा सकता है.

तीसरा, फोटोग्राफर और सेल काउंटर दोनों मैनुअल मायने रखता दौरान अंधा किया जाना चाहिए. कोशिकाओं विषाक्त पदार्थों के साथ व्यवहार कर रहे हैं हालांकि, एक बार, वे अक्सर भी एक अप्रशिक्षित आँख करने के लिए काफी स्पष्ट हैं कि morphological परिवर्तन मान. यह इसे और अधिक चुनौतीपूर्ण निष्पक्ष रहने के लिए बना देता है. दृष्टिहीनता हमारे assays के लिए एक आवश्यकता नहीं है.

चौथा, मार्गदर्शन की गिनती के समय लेने वाली हैं और अधिक वेतन में प्रमुख अन्वेषक की लागत. वेतन शोध कार्यों के उच्चतम लागत से एक हैं. ओडिसी पर एक थाली के लिए स्कैन समय सेटिंग "मध्यम गुणवत्ता" पर लंबे समय केवल 8 मिनट है और "कम गुणवत्ता" सेटिंग पर आगे उतारा जा सकता है. यह ओडिसी Imager एक एक प्रयोग डेमो संस्करण खरीदता है, तब भी जब महंगा है, लेकिन यह एक बार की तय लागत है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. दूसरी ओर, एक भी DAPI या एच के मार्गदर्शन कोशिकाओं की गिनती के लिए अपेक्षाकृत महंगी epifluorescence सूक्ष्मदर्शी में निवेश करने के लिए हैनाभिक oechst से सना हुआ. प्रारंभिक लागत के बावजूद, ओडिसी Imager भी एक मात्रात्मक तरीके 47,48 में वेस्टर्न immunoblots उपाय है कि एक बहुउद्देशीय मशीन है. हम ऐसे चूहे या माउस striatum या telencephalic प्रांतस्था के रूप में macroscopic मस्तिष्क संरचना में immunostaining की quantifications के लिए ओडिसी का उपयोग ढाल लिया है. यह दृष्टिकोण भी दूसरों के 49 से इस्तेमाल किया गया है. ऊतक इमेजिंग के लिए ओडिसी Imager की एक कमजोरी उच्चतम संकल्प केवल 21 माइक्रोन है. इसलिए यह व्यक्ति की कोशिकाओं गिनती नहीं कर सकते और महीन संरचनात्मक विवरण कल्पना करने का इरादा नहीं है.

अंत में, अवरक्त assays पुस्तिका मायने रखता है के रूप में सेल संख्या में छोटे परिवर्तन के रूप में संवेदनशील नहीं हो सकता है. आईसी 50 मूल्यों इसलिए लेकिन केवल अवरक्त संकेत की 50% नुकसान elicits कि एकाग्रता के रूप में, सेल नंबर के ठीक 50% नुकसान elicits कि एकाग्रता दिखाने के रूप में नहीं माना जा सकता. इस चेतावनी को शायद करने के लिए लागू होता हैसभी व्यवहार्यता माइक्रोस्कोपी द्वारा व्यक्तिगत कोशिकाओं की गिनती दरकिनार और एक ही बार में पूरे अच्छी तरह से नमूना कि assays. ऐसे assays के साथ जुड़े अस्पष्टता अतिवृद्धि, शोष, या सिग्नल की शक्ति को प्रभावित करने वाले उपस्थिति में अन्य परिवर्तन के एक समारोह हो सकता है. उदाहरण के लिए, कुछ विषाक्त पदार्थों के साथ, α-ट्यूबिलिन प्रत्येक कक्ष में immunoreactivity विषाक्तता के एक समारोह के रूप में वृद्धि हो सकती है. हम MG132 8 की बहुत उच्च सांद्रता के साथ इलाज N2a कोशिकाओं में इस घटना मनाया है. इस चिंता की बात है, तो इस तरह के β-actin या GAPDH के रूप में अन्य cytoskeletal मार्कर प्रोटीन, इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, N2a कोशिकाओं द्विध्रुवी प्रक्रियाओं 8,50,51 रूप में करते हैं पर बल दिया. सेल आकार में परिवर्तन के साथ, सेल प्रति फ्लोरोसेंट संकेत उत्पादन भी उपचार समूहों में अलग होगा. हम विष का इलाज कोशिकाओं में सेल पश्चिमी में उपयोग के रूप में एक ही मार्करों के लिए immunocytochemistry निम्न मानक उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की जानी है कि सलाह देते हैं. कोशिका द्रव्य उपचार पर आकार में काफी परिवर्तन पर हैंनाभिक, हम केवल नाभिक यों तो नीलम बिना DRAQ5 दाग का उपयोग कर की सिफारिश नहीं करता. विभिन्न रंगों के साथ और अन्य cytoskeletal या अन्य प्रचुर मात्रा में प्रोटीन के साथ भविष्य के अध्ययन के लिए इन बाधाओं को दूर करने के लिए warranted रहे हैं.

हम सभी assays निरंतर से ग्रस्त हैं और संवेदनशीलता के बारे में चिंताओं, linearity, नमूना त्रुटि, संकेत करने वाली शोर अनुपात, मानव पूर्वाग्रह या आत्मीयता, समय और लागत को उठाया है कि समाप्त. इसके अलावा, सभी assays हमेशा नहीं मिले हैं कि मान्यताओं पर भरोसा करते हैं. इसलिए, हम कम से कम दो assays सेल संस्कृतियों पर उपचार के प्रभाव का वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया जा है कि उपापचयी स्वास्थ्य और शारीरिक व्यवहार्यता पर निर्भर करता है कि एक उपाय है कि एक सलाह देते हैं. इस तरह, एक अधिक प्रभावी ढंग से चिकित्सकीय यौगिकों दोनों संरचना और समारोह की रक्षा चाहे सुनिश्चित कर सकते हैं.

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Disclosures

लेखकों में से कोई भी खुलासा करने के लिए किसी भी संघर्ष किया है.

Acknowledgments

हम एटीपी परख में अभिकर्मकों की मात्रा पर बचत करने के विचार के लिए Juliann Jaumotte को स्वीकार करते हैं. हम इन अध्ययनों के लिए वित्तीय सहायता उपलब्ध कराने के लिए मैरी Caruso, देब विल्सन, और जैकी फर्रेर की और फार्मेसी Mylan स्कूल के लिए शानदार प्रशासनिक सहायता के लिए बहुत आभारी हैं. धन्यवाद भी Hunkele जानलेवा बीमारियों के इलाज फाउंडेशन और पार्किंसंस और आंदोलन विकार प्राथमिक neuronal पढ़ाई के अपने वित्तीय सहायता के लिए फाउंडेशन की वजह से कर रहे हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Titer Glo Promega G7572 Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin Thermo-Shandon 9990244 Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block LI-COR 927-40003 This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100 Sigma-Aldrich 21568 We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic Fisher S468 One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic Fisher S373 See above
Sodium Azide (250x) Ricca Chemical Company 7144.8-16 Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin Sigma-Aldrich T5168 This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2 Sigma-Aldrich M9942 This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG LI-COR 926-32210 Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5 Biostatus DR50200 This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire LI-COR 928-40022
Luminometer PerkinElmer VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager LI-COR 9201-01
Shaker/Mixer Research Products International 248555

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References

  1. Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
  2. Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G. Effects of GDNF on 6-OHDA-induced death in a dopaminergic cell line: modulation by inhibitors of PI3 kinase. J. Neurosci. 73, 105-112 (2003).
  3. Patonay, G., Antoine, M. Near-infrared fluorogenic labels: new approach to an old problem. Anal. Chem. 63, (1991).
  4. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 deficiency in astrocytes selectively enhances mitochondrial Complex I inhibitor-induced neurotoxicity. J. Neurochem. 117, 375-387 (2011).
  5. Egorina, E. M., Sovershaev, M. A., Osterud, B. In-cell Western assay: a new approach to visualize tissue factor in human monocytes. J. Thromb. Haemost. 4, 614-620 (2006).
  6. Aguilar, H. N., Zielnik, B., Tracey, C. N., Mitchell, B. F. Quantification of rapid Myosin regulatory light chain phosphorylation using high-throughput in-cell Western assays: comparison to Western immunoblots. PLoS One. 5, (2010).
  7. Jinwal, U. K., Dickey, C. A. Cell-based assays for regulators of tau biology. Methods Mol. Biol. 670, 93-108 (2011).
  8. Unnithan, A. S., Choi, H. J., Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Rescue from a two hit, high-throughput model of neurodegeneration with N-acetyl cysteine. Neurochem. Int. 61, 356-368 (2012).
  9. Hoskins, C., Wang, L., Cheng, W. P., Cuschieri, A. Dilemmas in the reliable estimation of the in-vitro cell viability in magnetic nanoparticle engineering: which tests and what protocols? Nanoscale Res. Lett.. 7, 10-1186 (2012).
  10. Essner, M. D., Javed, A., Eleazer, P. D. Effect of sodium hypochlorite on human pulp cells: an in vitro study. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 112, 662-666 (2011).
  11. Sims, J. T., Plattner, R. MTT assays cannot be utilized to study the effects of STI571/Gleevec on the viability of solid tumor cell lines. Cancer Chemother. Pharmacol. 64, 629-633 (2009).
  12. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  13. Womac, A. D., Burkeen, J. F., Neuendorff, N., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Circadian rhythms of extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus cells and cultured astrocytes. Eur. J. Neurosci. 30, 869-876 (2009).
  14. Ataullakhanov, F. I., Vitvitsky, V. M. What determines the intracellular ATP concentration. Biosci. Rep. 22, 501-511 (2002).
  15. Iglehart, J. D., Silver, D. P. Synthetic lethality--a new direction in cancer-drug development. New Engl. J. Med. 361, 189-191 (2009).
  16. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Methods. 160, 81-88 (1993).
  17. Kangas, L., Gronroos, M., Nieminen, A. L. Bioluminescence of cellular ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. Med. Biol. 62, 338-343 (1984).
  18. Lundin, A., Hasenson, M., Persson, J., Pousette, A. Estimation of biomass in growing cell lines by adenosine triphosphate assay. Methods Enzymol. 133, 27-42 (1986).
  19. Sevin, B. U., et al. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol. Oncol. 31, 191-204 (1988).
  20. Maehara, Y., Anai, H., Tamada, R., Sugimachi, K. The ATP assay is more sensitive than the succinate dehydrogenase inhibition test for predicting cell viability. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 23, 273-276 (1987).
  21. Andreotti, P. E., et al. Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Res. 55, 5276-5282 (1995).
  22. Posimo, J. M., Titler, A. M., Choi, H. J., Unnithan, A. S., Leak, R. K. Neocortex and allocortex respond differentially to cellular stress in vitro and aging in vivo. PLoS One. 8, (2013).
  23. Carralot, J. P., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28, 261-268 (2012).
  24. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
  25. Oliver, D. G., Sanders, A. H., Hogg, R. D., Hellman, J. W. Thermal gradients in microtitration plates. Effects on enzyme-linked immunoassay. J. Immunol. Methods. 42, 195-201 (1981).
  26. Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS One. 6, (2011).
  27. Bayer, S. A., Altman, J. Neocortical Development. , Raven Press. (1991).
  28. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54, 357-369 (2007).
  29. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 knock-down in astrocytes impairs astrocyte-mediated neuroprotection against rotenone. Neurobiol. Dis. 33, 28-36 (2009).
  30. Jiang, Y., et al. N-Acetyl cysteine blunts proteotoxicity in a heat shock protein-dependent manner. Neuroscience. 255, 19-32 (1016).
  31. Madeira, A., et al. Caveolin-1 interacts with alpha-synuclein and mediates toxic actions of cellular alpha-synuclein overexpression. Neurochem. Int. 59, 280-289 (2011).
  32. Fioriti, L., et al. Cytosolic prion protein (PrP) is not toxic in N2a cells and primary neurons expressing pathogenic PrP mutations. J. Biol. Chem. 280, 11320-11328 (2005).
  33. Zhang, L., et al. Proteasome inhibition modulates kinase activation in neural cells: relevance to ubiquitination, ribosomes, and survival. J. Neurosci. Res. 87, 3231-3238 (2009).
  34. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 24, 197-211 (2003).
  35. Stranahan, A. M., Mattson, M. P. Selective Vulnerability of Neurons in Layer II of the Entorhinal Cortex during Aging and Alzheimer's Disease. Neural Plast. 2010, (2010).
  36. Duyckaerts, C., Delatour, B., Potier, M. C. Classification and basic pathology of Alzheimer disease. Acta Neuropathol. 118, 5-36 (2009).
  37. Chu, C. C., Tranel, D., Damasio, A. R., Van Hoesen, G. W. The autonomic-related cortex: pathology in Alzheimer's disease. Cereb. Cortex. 7, 86-95 (1997).
  38. Braak, H., Del Tredici, K., Bohl, J., Bratzke, H., Braak, E. Pathological changes in the parahippocampal region in select non-Alzheimer's dementias. Ann. N.Y. Acad. Sci. 911, 221-239 (2000).
  39. Braak, H., Rub, U., Schultz, C., Del Tredici, K. Vulnerability of cortical neurons to Alzheimer's and Parkinson's diseases. J. Alzheimers Dis. 9, 35-44 (2006).
  40. Calabrese, E. J. Hormesis is central to toxicology, pharmacology and risk assessment. Hum. Exp. Toxicol. 29, 249-261 (2010).
  41. Giordano, J., Ives, J. A., Jonas, W. B. Hormetic responses in neural systems: consideration, contexts, and caveats. Crit. Rev. Toxicol. 38, 623-627 (2008).
  42. Mattson, M. P. Hormesis defined. Ageing Res. Rev.. 7, 1-7 (2008).
  43. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, (2010).
  44. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  45. Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Astrocyte plasticity revealed by adaptations to severe proteotoxic stress. Cell Tissue Res. , (2013).
  46. McLaughlin, B., et al. Caspase 3 activation is essential for neuroprotection in preconditioning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 715-720 (2003).
  47. Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol. Biol. 536, 499-513 (2009).
  48. Picariello, L., et al. A comparison of methods for the analysis of low abundance proteins in desmoid tumor cells. Anal. Biochem. 354, 205-212 (2006).
  49. Tapias, V., Cannon, J. R., Greenamyre, J. T. Melatonin treatment potentiates neurodegeneration in a rat rotenone Parkinson's disease model. J. Neurosci. Res. 88, 420-427 (2010).
  50. Fenteany, G., Schreiber, S. L. Specific inhibition of the chymotrypsin-like activity of the proteasome induces a bipolar morphology in neuroblastoma cells. Chem. Biol. 3, 905-912 (1996).
  51. Omura, S., et al. Lactacystin, a novel microbial metabolite, induces neuritogenesis of neuroblastoma cells. J. Antibiot. 44, 113-116 (1991).

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Posimo, J. M., Unnithan, A. S.,… More

Posimo, J. M., Unnithan, A. S., Gleixner, A. M., Choi, H. J., Jiang, Y., Pulugulla, S. H., Leak, R. K. Viability Assays for Cells in Culture. J. Vis. Exp. (83), e50645, doi:10.3791/50645 (2014).

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