Summary
治療用化合物は、多くの場合、最初の生存率アッセイとin vitroで調べられます。人間の観察者によってブラインド細胞数は、細胞数の小さな変化に非常に敏感であることができますが、機能を評価しないでください。コンピュータ化された生存率アッセイは、ここで説明するように、客観的に構造および機能の両方を評価することができる。
Abstract
顕微鏡で手動細胞数は、細胞の生存能力を評価する敏感な手段ですが、時間がかかり、従って高価である。コンピュータ化された生存率アッセイは、設備の面で高価であるが、より速く、より客観的な手動の細胞数よりもすることができます。今回の報告は、3つのそのような生存率アッセイの使用が記載されている。これらのアッセイの二つは、赤外線であり、1つが発光性である。両方の赤外線アッセイは、16ビット·オデッセイイメージャに依存しています。つの赤外線アッセイは、細胞質ゾルのためのサファイア染色と組み合わせる核についてDRAQ5染色を使用し、700 nmのチャネルで可視化される。他の赤外線分析、インセルウェスタン、細胞骨格タンパク質（α-チューブリンまたは微小管結合タンパク質2）に対する抗体を使用し、800 nmのチャネルでそれらにラベルを付けます。第三の生存率アッセイは、ATPのために一般的に使用される発光アッセイであるが、我々はコストを節約するための推奨量の四分の一を使用しています。これらの測定は、すべての線状であり、CEの数と相関LLSメッキが、感度が異なる。 3つ全てのアッセイは、時間のかかる顕微鏡を回避し、それによりサンプリング誤差を低減し、ウェル全体をサンプリングする。最後に、アッセイの全ては、容易に短期間内で実行される実験の大きな数字を可能にする、実験の終了の1日以内に完了することができる。しかしながら、それらはすべて細胞数が治療後の信号強度に比例、時には特にセルラATPのために、満たされていないという仮定に留まるという仮定に依存する。細胞は、治療後に増加又はサイズが減少した場合さらに、これは細胞数に影響を与えることなく、信号強度に影響を与える可能性がある。我々は、手動カウントを含む、すべての生存率アッセイは、いくつか補足説明に苦しむと結論が、コンピュータ化された生存率アッセイは、初期投資の価値があること。一緒にすべての3つのアッセイを使用して、細胞の構造および機能の包括的なビューをもたらす。
Introduction
生物科学の中で最も一般的な生存率アッセイは、細胞数が含まれます。これは、2013年4月29日およ び2013年4月30日に、キーワードのいずれかを「 インビトロ 」や「文化」とPubMedの中で登場し、トップ（最新の）200の出版物の分析によって証明されている。これらの刊行物の中でも、手動細胞数の計数を含む23.5％用いる細胞計数アッセイは、自動化された細胞数は、イメージングソフトウェアを使用してカウントし、トリパンブルー排除。生/死アッセイは、これらの刊行物の1％で使用した。 MTT（3 - （4,5 - ジメチルチアゾール-2 - イル）-2,5 - ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を用いて、多くの刊行物の代謝生存についてのアッセイは11％であった。文学のこの調査では、細胞数アッセイと組み合わせてMTTなどのアッセイを使用して多くの刊行物はわずか3.5％であったことを示しています。それ自体ずつ生存率アッセイを使用する傾向にもかかわらず、細胞数との組み合わせで細胞機能を評価することは私の細胞を評価するための最良の選択と思われるntegrity。残りの細胞が機能または彼らはよく、1,2に存在しているにもかかわらず、健康的ではない可能性があるため、それ自体で細胞数が十分ではない。逆に、例えばATPなどの機能措置が増加または細胞の数の並列の変化の非存在下で低下することがある。細胞数から代謝読み出しの脱共役は、ATPおよびMTTアッセイは唯一の生存率アッセイとして使用してはならないことを示唆している。今回の報告では、細胞構造および代謝機能の両方を調査する3生存率アッセイは、それ自体でアッセイは余裕がある任意の1以上の細胞の完全性のより包括的なビューに記載されている。
我々のアッセイのうちの2つは、700および800nmのチャネルで蛍光を測定する赤外線撮像装置を必要とする。ノイズは、より高い信号対雑音比3につながる、赤外線波長が低い。我々は4.5ログダイナミックレンジと16のビット深度、translatinを持って使用オデッセイイメージャ赤外線の2 16または65,536色合いにグラム。これは、波長ごとに色の2 8または256階調を与える8ビットのカラー画像に対比することができる。したがって、16ビットのイメージングは、より微細な分解能を有する。これは、元の赤外線画像は、多くの場合、プレゼンテーションのための公表された報告では緑色（800 nm）を赤（700 nm）を疑似カラーしていることに留意すべきである。オデッセイのイメージャは、一般的に西部劇4-7ウエスタンブロット法のためにと、セル内の両方に使用されます。セル内のホルムアルデヒド固定した細胞上の西部劇は、対象となる任意のタンパク質に対する一次抗体を使用し、赤外蛍光二次抗体で順番にそれらにラベルを付ける。この技術は、リンエンドポイント6のために特に有用であることが知られている。私たちにはセル西部劇では、細胞骨格タンパク質α-チューブリンまたは800 nmのチャネル内の神経細胞の微小管関連タンパク質2（MAP2）のための固定した細胞を染色する。これらのタンパク質は、高い信号対雑音比を得るために十分豊富である。また、700で私たちのプレートを染色DRAQ5染色でサファイア染色で細胞質の核のためのnmのチャネル。細胞骨格タンパク質とDRAQ5 +サファイアの汚れの両方は、このように細胞構造を反映している。
第三の生存率アッセイは、代謝機能を測定し、呼ばれて「セルタイターグロ。「このルシフェラーゼベースのアッセイにおいて、発光値がATPレベルに比例している。 ATPアッセイは一般に8-12生存細胞を定量するために使用される。細胞当たりのATP出力が毒素処置の関数として変化する可能性があるため、アッセイの名の下に単語「力価」を含むことは幾分誤った名称であり、セル番号8に比例して、したがって必ずしもである。 ATPレベルはまた、13概日リズムによって、細胞分裂および14細胞分化15によって影響され得る。 ATPは代謝の堅牢な尺度であるので、それにもかかわらず、ここに示されているATPアッセイは実施が簡単で便利です。西部劇はそのためだけではいずれか1アッセイよりも細胞の完全性のより包括的な画像を生成するセル内の赤外線を補完するために、このアッセイを使用して。それ自体が数をセルでない場合は、生存率16〜21、。
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Protocol
プロトコルの概略を図1に示す。
1。細胞播種
異なるめっき密度（ 図2）で、96ウェルプレート中の細胞をプレート。 N2aの神経芽腫細胞株、プレート2.5K、5K、10K、および3または6ウェル/グループのウェルあたり15K細胞上の直線性チェックのために。ラット初代皮質ニューロン、プレート25K、50K、100K、および3または6ウェル/グループのウェルあたり20万細胞での直線性チェックのために。細胞株または目的の初代細胞は、その細胞型のための最適細胞密度でかつ周囲に、異なるめっき密度でプレートを健康な見れば。
注：本研究では、N2a細胞下部の蒸発のために設計されているプレート上で200μlの培地中の100μlの培地および一次皮質ニューロンにプレーティングした。細胞処理、メディア、血清、抗生物質、および毒素治療の詳細については、Unnithan らを参照してください。 N2aはCELのためLS 8とPosimo ら 。一次皮質培養22。
- 第96ウェルプレートにプレーを繰り返します。一方のプレートは、赤外線アッセイ（ 図2B）でのATP（ 図2A）、および他のためにアッセイする。細胞は、細胞内のATP測定のために開いて溶解する必要があるため、一つは、ATPと赤外線アッセイのために同じプレートを使用することはできません。
- 最適な播種密度（; 図2B列2）の赤外線アッセイにおけるバックグラウンド除去のために少なくとも3余分な井戸をプレートにしてください。
- 列AとHでの列1および12外側のウェルに、より安価に細胞を含まないメディアや、滅菌水を追加します。生存率は、メディアの蒸発と温度勾配の影響から、ここで、多くの場合、低いほど、エッジに沿ってウェルからのデータに依存することは避けてください。マイクロプレートとのこのような問題は、一般的にエッジ効果23,24と呼ばれています。空のこれらのウェルは保管しないで[行のBとGと列2と11は、エッジ効果に苦しんでいるため。
エッジ効果は、CO 2インキュベーター中24への移行の前に周囲条件で室温にて新たに播種し、プレートをインキュベートすることによって低減することができる。さらに、Carralotによる最近の研究では、単一の制御列23を使用してマイクロタイタープレートのための数学的な補正方法について説明します。オリバーらは、温度勾配25を減らすために特別に設計された強制空気マイクロタイタープレートインキュベーターを使用していました。エッジ効果は、重要な関心事である場合、マイクロプレート安定性チャンバー（ 例えば、BT＆C社）は、高湿度および均一な温度勾配を有する均質な微小環境を作成するために購入することができる。 - 追加の試薬 希釈液又はそれ以上のメッキ密度がテストされるので、 図1に示されているよりも多くのウェルが必要な場合は、バックグラウンド減算のためのエッジウェルを使用。
- 取り付けのために一晩待つ細胞およびアッセイ以下に説明するように次の日の朝の。
2。発光ATPアッセイ
- バッファ基板の再構成のためのインキュベーション時間のための細胞タイターグロメーカーの推奨に従ってください。
- それぞれ、メッキのメディア100または200μLから50または150μlのメディアを取り出します。わずか50未満μlをウェル内の後ろのままになります。 1:2希釈の列2-6（ 図2A）に試薬（基質を加えた緩衝液）の25を添加する。
注：除去は差動で、ウェル間でのATPアッセイ試薬を希釈または集中できた後にメディアの変化させるボリュームは残した。すべてのマルチチャンネルピペットチップ内の液体のレベルが同等であることを保証するために注意してください。すぐに正確さを保証するために、ATPアッセイ試薬を加える前に、ピペットを用いて、プレート全体の選択ウェル内の残留液を測定します。高い変動性は、メディアエバポールの差動レートから存在している場合プレートの表面を横切るATION、すべての古い培地を除去し、直ちにATPアッセイ試薬の添加前に、すべてのウェルに新鮮な培地またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の同じボリュームを追加する。プレートは蒸発々のレベルに苦しむ場合、コスター·コーニングからの低蒸発プレートに切り替えてみてください。後者のプレートにおいて、 図2に示す内部60ウェルのみ0.995パーセントの平均値から0.41メディア蒸発晩±苦しむ。アッセイ時の培地容量を無視できる程度にばらつきが存在する。 - 列7〜11に、行B〜Dの、上記で詳述したように、背後に50μLを残すために十分なメディアを取り出し、1:1希釈試薬50μlを加える。
- 列7〜11に、行からG Eは、100μlの培地で細胞を残して、1:1の希釈で再度、試薬を100μlを加える。同社は、試薬100μlを100μlの培地で1:1に希釈する必要があることを推奨しています。
注：ためにコストを節約するために、ボリュームに、希釈の両方でこれらの推奨事項を切断することができる。しかし、これを実行する前に、それはアッセイの直線性と感度を低下させないことを確認してください。 - 1特定のボリュームおよび試薬の希釈倍率が十分であることが発見されると、すべてのその後の実験でそれらに固執。満足のいくデータの基準は結果セクションで説明します。
- 未使用の再構成された試薬は、再凍結とコストを節約するために、後日使用することができます。製造業者によると、再構成試薬は活性の約3％の損失で21週間、-20℃で保存することができる。
- それぞれ、メッキのメディア100または200μLから50または150μlのメディアを取り出します。わずか50未満μlをウェル内の後ろのままになります。 1:2希釈の列2-6（ 図2A）に試薬（基質を加えた緩衝液）の25を添加する。
- 2分または10分間章動シェーカーオービタルシェーカー上でプレートを置きます。プレートの一部が異なる測定についてアッセイされて、それを振とうすることができない場合、唯一の関心のウェルに単純な上下·アンド·ピペッティングでメディアを攪拌する。しかし、このステップの間に発生した過剰な気泡がルミに干渉しますルミネセント出力。
- 10分試薬の添加後、白色96ウェルプレートにウェル内容物の60μLを移す。彼らは上向きに検出器に向けて光を反射するので、発光値はクリアまたはブラックプレートよりも白のプレートに高い。
注：我々の経験では、細胞は、他のプレートよりも明確なコースタープレートを低蒸発に優れて生き残る。これらの特定のプレートは、白い壁と一緒に販売されていません。第二に、壁不透明と透明底板は完全に透明プレートよりも高価である。一つは白色プレートにルミネ液体を転送すると、白色プレートはすべての実験のために新たな白色プレートを使用するコストを節約し、洗浄し、再使用することができる。液体を移送することはこのように長期的に安価なオプションです。 - 前プラスチック転送ピペットバルブから強制空冷で、好ましくは、針でプレートを読んだりして気泡をポップします。 1秒の積分時間でルミノメーター上でプレートを読み取る（会社recommeNDS 0.25秒として十分な積分時間）。 ATPアッセイ用試薬を加えた後、プレートを10から12分をお読みください。ギルバートと同僚26で示すように、発光シグナルは、高速の減衰率との一時的なものであるので、タイミングが、異なるプレート間での比較のために重要である。
- 10分試薬の添加後、白色96ウェルプレートにウェル内容物の60μLを移す。彼らは上向きに検出器に向けて光を反射するので、発光値はクリアまたはブラックプレートよりも白のプレートに高い。
- 散布図中の細胞数（ 図3参照）の関数としてプロットし、各グループ内の3または6ウェルからの発光値を平均する。対応する各データポイントから（11G - 2G、井戸11B - - 11D、ウェル11E井戸2B）最初に適切な空のウェルの平均バックグラウンド発光値を減算します。この最初の実験（ 図2A）の各播種密度の3つの異なるグループが存在します。 ATPレベルは直線的に1つ以上のこれらの基の全ての細胞密度と相関させることができる。それでも、コストを節約するために満足のいく結果が得られる試薬の最高希釈を進める。満足な結果のための基準が記載されているIN結果セクション。
注：本研究で使用されるメディアでは、このアッセイでのバックグラウンド値が高くないと、それはブランクウェルをスキップすることが可能である。しかし、製造業者プロメガは異なる培養培地での発光の違いをレポートします。本研究は、ハイクローン胎児クローンIII、N2a細胞および一次皮質培養用のウシ胎児血清のためにウシ胎児血清の合成バージョンを使用しています。製造業者によると、胎児血清は、発光値を低下させるが、アッセイの感度を低下させない。これは重大な関心事である場合には、それにもかかわらず、検定の際に、PBSの代わりにメディア内のATPアッセイ試薬を希釈。- 細胞は、一晩の列にわたって不均一に成長するように見える場合は、メッキの6時間以内にそれらをアッセイしてみてください。しかし、アッセイの通常の時間（治療後例えば、24時間）での密度は直線性を達成しなければならないの密度であることに注意してください。
3。 InfrareDアッセイ
- めっき後の朝は、ヒュームフード中、室温で第二のプレートに細胞を固定。ホルムアルデヒドは発がん性物質であるため、このステップのために手袋を着用し、化学廃棄物として固定液を廃棄するようにしてください。 1：01希釈の既存のメディアに0.1 Mリン酸緩衝液中4％ホルムアルデヒドおよび4％スクロースを加える。媒体はまた、完全な強度の固定液中に固定する前にPBSで洗い流すことができる。どちらの技術がうまく動作します。
- 20分間固定液中でインキュベートした後、固定液を除去し、200μlのPBSで3回洗う。
- アッセイは同じ日に行われない場合は、4℃で0.2％のアジ化ナトリウムを含むPBSでプレートを保管してください。そうでなければ、アッセイを進め、抗体の非特異的結合を最小限にするためにブロッキング溶液で細胞を置く。
- PBSに魚の血清オデッセイブロック1:1に希釈し、細胞透過剤として0.3％のTriton-X 100を追加します。十分なブロッキング液だけでなく、一次および二次antiboを作る35μlを各ウェルにピペットでできるように、DYソリューションを提供しています。しかし、気泡の多くは、ピペッティングの際に認められた場合に、各ウェルについて> 50μLを行い、そうでない気泡が結合する細胞とブロックする抗体に分解達する。過度の石鹸の泡がウェルの中央に染色されていない円形のスポットとして表示されます。これが発生した場合、ピペッティングを調整してみてください。
- 室温で30〜60分間、このブロッキング溶液中でインキュベートする。
注：二次抗体と同一の種からの5％ウシ血清アルブミンまたは正常血清はまた、魚の血清ブロックのコストを節約するためのソリューションを阻止として使用することができる。溶液をブロックする抗体の性能に影響を与えることができる。したがって、各抗体の最適ブロックが最高の経験的に決定される。
注：一部の研究者は、インキュベーションの間、シェーカー上でセル内西洋のプレートを配置。しかしながら、これは必要ではない。
- 抗α-チューブリンのための1:10,000希釈：一次抗体を作る（マウスモノクローナル、 表1）および抗MAP2（マウスモノクローナル、 表1）1:2000希釈。これらの抗体は、これらの細胞モデルにおける目的のタンパク質に特異的である、特異性は、任意の免疫細胞化学染色のために不可欠です。
注意：MAP2は神経細胞のマーカーである、混合グリア/ニューロン培養に適しています。アストロサイトはその数は、早期新生児期27,28年をピークに、胎生18日目に最初に表示されるので、ここに示されている出生後の培養も、いくつかのグリア（〜25％）が含まれている。一つは、アストロサイトとニューロンのATPおよびDRAQ5 +サファイアアッセイを区別することはできません。別々に神経細胞とアストロサイトを測定Mullettや同僚4,29に記載されているように、800および700 nmのチャネル同時MAP2およびGFAP染色を使用して、DRAQ5 +サファイアを除外するためである。培養液中のすべてのセルが評価されることを望む場合は、このようなα-チューブリン、β-アクチン、またはGAPDHなどの汎細胞マーカーを使用しています。
注：これらの希釈はN2aは、一次皮質細胞のために最適化されており、すべてのモデルに一般化しない場合があります。したがって、少なくとも二つの一次抗体希釈液、プレートの左半分に1つ、右半分に1つ（ 図2B参照 ）を試みる。別の方法として、3つのウェルにそれぞれ一次抗体の希釈液3-4を試してみてください。例えば、抗体インサートシートに推奨される希釈液は、2倍の変化と隣接させることができる。言い換えると、免疫細胞化学のための推奨希釈は1:500である場合には、また、1:250および1:1,000希釈倍率を試してみてください。- 1時01分オデッセイブロックで抗体を希釈：PBSおよび0.3％トリトン-Xを追加します。コストを節約するために、インキュベーションの最後に、この溶液を除去することにより、ステップ3.2.1での細胞に適用したブロッキング溶液中で抗体を作製してみてください。これをやっている間、PBSで細胞を維持する、彼らは乾燥しない必要があります。
- 室温または4℃で一晩、一次抗体のいずれか1〜2時間でインキュベート弱いBの豊富ではない抗体およびタンパク質をinding、一晩のインキュベーションは、信号を高めるのを助けることができます。
注：各二次抗体濃度（井戸2B〜2Dおよび図2Bの井戸2E-2G）で背景差分のためのブロッキング溶液中で、少なくとも3ウェルのままにしておきます。いかなる一次抗体にこれらのウェルにさらさないでください。それらは、二次抗体による非特異的結合の程度を明らかにし、信号対雑音比を計算するために有用である。二次抗体の非特異的結合の高いレベルにつながることが懸念される場合には、一次又は二次のいずれかの抗体に曝露はなく洗浄の同じ番号を受信されていないコントロールウェルを含む。これらのウェルと「二次のみ "ウェル間の違いは、二次抗体のみに起因する非特異的結合の程度を明らかにする。マウスN2a細胞に対する我々の試験では、単独で抗マウス二次抗体とのシグナル強度は、抗ウサギの信号0.557±0.032であった二次抗体のみが二次抗体を用いて信号が0.357±0.003 0.533±0.041であったし、一次および二次抗体を用いた信号が11.867±0.911であった。そこで我々は、マウス細胞に対する抗マウス二次抗体を用いても、非特異的結合を高レベルで観察されなかった。いくつかのメーカーの赤外線二次抗体のがありますが、我々は唯一の高架橋吸着したものを買ってお勧めします。二次IgG抗体の濃度は、ソースに応じて変えることができることに注意してください。
- さて、10分ごとに200μlのPBSで3回洗浄して、一次抗体を洗い流す。一次抗体を、0.2％アジ化ナトリウム中で数週間、4℃で保存され、溶液が光に保持されているときに破片の小さな斑点が明らかとなるまで再利用することができる。これだけのコストを節約するために行われます。コストが問題ではない場合は、使用するたびに新鮮な抗体を作る。
- 1時01分オデッセイブロックで1:1,000や1:2,000で二次抗体を希釈0.3％のトリを含むPBSトン-X（ 図2B）。プレートの下半分に、天板の半分と1:2,000に1:1,000希釈を追加します。これらの濃度は、一層のコスト節約が、これにコミットする前に直線性をチェックするために減少させることができた。
注：背景差分ウェル（ 図2Bの列2）に適した二次抗体溶液を追加してください。- 第二のタンパク質は、700 nmのヤギ抗マウスIgGおよびマウス以外の種からの一次抗体と800 nmのチャネルでの第二のタンパク質とα-チューブリンまたはMAP2のためにDRAQ5 +サファイアの代わりに、ラベル細胞でアッセイされます。 800 nmのチャネルは、700 nmのチャネルより少ないバックグラウンドを持ち、関心の最も重要な蛋白質のために確保する必要があります。
- 光を避けて引き出しの中に、室温で1時間、二次抗体でインキュベートする。
- さて、10分ごとに200μlのPBSで3回洗浄した二次抗体を洗い流す。
- DRAQ5 +サファイア·ソリューションを作る。プレートの左半分のため、0.3％トリトン-X（列3から6、 図2B）でDRAQ5 1:10,000（0.5μM最終濃度）、PBS中のサファイア1:1000希釈する。プレートの右半分は、DRAQ5 1:20,000（0.25μM）を希釈し、サファイア1:2000（列7から10; 図2B）。
注意：DRAQ5ではなく、5 mMストックの1 mMストックで販売されていました。いくつかの以前に公表された報告は、したがって、DRAQ5 8の1:4,000または1:2,000希釈液を使用していました。- 二つのプレートは、同時にアッセイされている場合、コストを節約するために、同一のDRAQ5 +サファイア溶液は、第1のプレートを離れてそれをピペットで第二に追加し、シーケンス内の2つのプレートに使用することができる。同ソリューションは、このように二度使用された場合は、1日以内にそれらを使用しています。希釈したDRAQ5 +サファイア·ソリューションは、4℃で保存したり、後で使用するために凍結することができません。
- 室温離れるfで30分間この溶液中でインキュベートする。ROMライト。時間が短く、DRAQ5 +サファイア·ソリューションは、異なるセカンダリが他のプレート上で再利用されない場合は、ステップ3.5で、二次抗体溶液にこれらの汚れを追加し、1時間インキュベート。
注：これらのウェルは、700 nmのチャネルで染色してはならないように背景差分ウェル（ 図2Bの列2）にDRAQ5 +サファイアソリューションを追加しないでください。
- 10分ごとにウェルあたり200μlのPBSでプレート3回洗浄します。プレートは赤外線撮像が完了した後に他の可視域二次抗体で染色されようとしている場合は、0.2％アジ化ナトリウムは、最終的なPBS洗浄に入れる。
- オデッセイイメージャ上でプレートをスキャンします。震度5と169ミリメートルの分解能でプレートをスキャンすることから始めます。 「中程度の品質」や「低品質」の設定のどちらかで十分です。同社は詳細な励起/発光フィルタ情報を解放しません。しかしながら、発光フィルタは、約20nm幅であり、7を中心としているメーカーによると20〜820ナノメートル、。
注：研究者が他のマーカーとそれを染色していきたいと思うかもしれとしてそれがまだ湿っている間、プレートをスキャンすることが可能である。しかし、同社は、乾板はあまりウェル間の信号の広がりにつながる、オンラインプロトコルで示唆している。あなたはデータを比較する湿った後、乾燥の両方にそれらをスキャンすると、蒸発後に残った塩は、エッジに沿って高いバックグラウンド蛍光の原因となる場合があるので井戸からすべてのPBSを削除してください。- オデッセイイメージャは、最大スキャンして、プレートの底部を通って。ウェルの底板にその厚さと深さを変えることができるので、異なるメーカーのプレートが異なる焦点オフセットを要求することができる。異なる焦点オフセットでスキャンを試してみて、参照してくださいどこに最も高い信号対雑音比と最も鮮明（フォーカスで最も）信号が達成され、2.5ミリメートル、3.0ミリメートル、3.5ミリメートル、4.0ミリメートル。 findinを確認する定規でプレートの底から井戸の深さを測定することも試してみてくださいオデッセイにGS。井戸の底にあるプラスチック製の定規の測定値に追加の高さを追加することができますことを覚えておいてください。本研究で使用されるコースタープレートは、4.0ミリメートルの焦点オフセットが求められています。
- プレートの画像に適切なサイズのグリッドを配置し、Microsoft Excelにデータをエクスポートするためにソフトウェアではセル西洋関数を使用します。最も高い蛍光値を見つけるために、異なる焦点オフセットで同じ井戸の「積分強度」の値を確認します。最も高い信号対雑音比（「プライマリネガティブコントロール」井戸に対する免疫染色ウェルにおける信号）を生成するフォーカスオフセットは、以下を選択するものです。
- オフセット1フォーカス時に決定されると、より小さな単位で再びスキャンします。最も明るい信号が3.5と4.0ミリメートルにあった場合、3.6、3.7、3.8でスキャンを試して、3.9ミリメートルと信号強度の更なる改善があるかどうかを確認。フォーカスオフセットが間違っている場合は、空のPL上の12列にわたってシグナル強度代わりにフラットなラインのU字曲線として表示されます（すべての列が等しい信号を持っている必要がある場合）食べました。これはプラスチック板に問題が継続する場合は、ガラス底のプレートを試してみてください。
- 700および800nm のチャネル内のすべての対応するデータポイントから、バックグラウンド減算ウェル（2G - - 2D又はウェル2Eウェル2B 図2B）に積分強度の平均値を減算する。次いで、ウェルのグループごとに積算信号強度を平均化する。細胞密度に対する散布図などのデータをプロットします（ 図3を参照）。
- 一次および二次抗体と、その後の実験のための1の希釈ごとに決済するDRAQ5 +サファイアの2の異なる希釈の結果の2つの異なる希釈の結果を比較します。線形性が達成されない場合は、別の強度でスキャンをしてみてください。強度3と7の代わりに5を再スキャンし、データを再分析。データは、それらの強度の1に改善される場合が、まだ満足できるものではない、その強さの周りの単位で再スキャン。
- ソフトウェアは、ウェル中の白点を示して画像を分析しないように注意してください。これらのスポットは、イメージャの範囲外に飽和した信号を意味する。これが発生した場合、低強度でスキャンします。
- 線形性が達成されない場合、彼らが成長または一晩異なる列に偏って死ぬ可能性があるため、メッキの6時間以内に細胞を固定することもしてみてください。また、異なるメッキ密度、異なるスキャン強度、試薬希釈係数、ガラス底板、核のみ染色としてそれ自体でDRAQ5、または抗α-チューブリンまたは抗MAP2以外の異なる抗体のさらなる最適化を試してみてください。
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Representative Results
これらの実験における律速因子は、ATPアッセイは、持続時間が比較的短いほど、赤外線染色である。赤外線アッセイのために、我々は、8つの96ウェルプレート4枚のプレートの各々の驚異的な二つのバッチ（ 図1参照）により1日以内に染色し、走査することができると予想している。この推定は、固定の20分を想定し、洗浄30分、洗浄の30分、続いて2時間一次抗体インキュベーションを遮断する30分の洗浄を30分間、続いて1時間、二次抗体インキュベーションは、30分間のDRAQ5は+サファイア30に続く洗浄の分、4プレート用スキャン時間の34分。さらに15分には4個々のプレートの千鳥ペッティングを考慮するために洗浄のための図1に織り込まれている。データ分析のための時間は、この推計には含まれていません。 ATPアッセイの測定値は、すべての赤外線プレートについて並行して発生する場合は、12プレートは1日にアッセイすることができる - 赤外線染色のための6sおよびATPレベルのため6。
回帰分析で満足のデータ（ 図3）の基準は、議定書の項で述べたように、プレーティング密度と信号強度（0.05≤2両側p）との間に有意な相関関係があります。発光又は赤外線信号の変化の大きさは、細胞数の変化に比例するべきである。理想的には、5K細胞が約半分の発光または10K細胞のATPレベルを持っているべきであり、15K細胞は10K細胞などよりも約50％大きい値を持っている必要があります。この比例は、アッセイの感度を反映し、判定のR 2値又は係数は異なる。 R 2は、回帰直線が真のデータ点を近似する方法も測定します。データは線形であっても、信号強度の相対的変化は、細胞数の変化の大きさに比例していなくてもよい。これは、W発生することがあります鶏回帰直線は、アッセイが非常に敏感ではないことを示唆し、高いR 2が、低傾斜を有する。このように、データの有意な相関と比例の基準が両方満たされる必要があります。最後に、最適な播種密度付近の信号強度の変化は、器具およびアッセイのダイナミックレンジ内に入るべきである。ダイナミックレンジは、最大と最小の可能な値との比である。オデッセイのイメージャは、4.5ログダイナミックレンジと飽和信号は、結果はもはや定量化可能であることを研究者に警告するために、通常の赤や緑の画像の代わりに、明るい白の色として表示されています。アッセイ自体の間のダイナミックレンジは、そのような任意の所定の細胞型についての最大および最小のプレーティング密度などの問題が狭くなっている。細胞密度を増加させる少なくとも一つのプレート場合、それらは外であるため、これらのアッセイのための飽和曲線は、いずれかのさらなる差異を解決することができないその上にプレーティング密度を明らかにするレンジイメージャのため、または細胞は、一晩混雑が生存しない。同様に、一プレートは細胞密度を低下させる場合には、一方が信号におけるさらなる変更がないそれ以下の最小細胞密度を測定することができる。アッセイのダイナミックレンジは、最小値と解決することができる細胞/ウェルの最大数との間のメッキ密度を有する。我々の細胞が報告されているものを超えた密度でうまく生きていけないので、私たちは、これらの特定のアッセイのためのフルダイナミックレンジを測定していない。
最適化の後、我々は今、1:2000希釈の抗マウスIgGで、1:10,000希釈で抗α-チューブリンとのN2aマウス神経芽腫細胞を染色し、1:20,000および1:2,000でDRAQ5 +サファイアソリューションと、それぞれ。我々はまた、50μlの培地でのATP測定試薬を25μlを使用しています。これらの条件下での結果は、 図3A、B、およびCに示されており、beforの公表されているE 8。 3つ全てのアッセイにおける信号強度が有意にウェルあたりの細胞数と相関していた。すべての3つのアッセイは非常に直線的であったが、これらは感度が同等ではありませんでした。例えば、ウェルあたり5Kの細胞をウェルあたり10K細胞として赤外線染色のちょうど半分の量を持っていませんでした。赤外線のアッセイとは対照的に、ATPアッセイは、プレーティング密度の変化に対してより感受性であった。言い換えれば、発光は5Kからウェルあたり2.5K細胞に5Kとする10Kからおよそ半分に減少した。 ATPアッセイの最高感度にこれらの調査結果にもかかわらず、細胞の健康の広い画像を得るために実行可能性のためのすべての3つのアッセイを実行することをお勧めします。
我々は今、1:1,000希釈の抗マウスIgG 1:2,000希釈の抗MAP2とラット初代神経細胞培養を染色し、それぞれ1:10,000および1:1,000、でDRAQ5 +サファイアソリューション、および25を使用50μlのメディア（ 図中のATPアッセイ試薬の液3D、E、およびF）。 700 nmのチャネルでのウェルあたり100Kと200Kの細胞の間にはほとんど違いがあったためDRAQ5 +サファイアアッセイにおける信号強度は、すべての3つのアッセイの少なくとも直線的であった。しかし、700 nmでの信号強度は、ウェルあたり100Kの細胞下の細胞数に比例して十分だったし、我々は常にとにかくウェルあたり100K個の細胞で神経細胞培養プレート。それにもかかわらず、我々はまた、DRAQ5 +サファイアアッセイ（下記参照）、他の2つのアッセイのような毒素治療に敏感ではないことを観察した。 DRAQ5 +サファイアとは対照的に、信号強度は、MAP2およびATPアッセイの両方のためのめっき密度を有する良好な割合であった。これは、ATPアッセイ試薬のより大きな体積は、ウェル当たり20万個の細胞での結果を向上させることができることに留意されたい。複数の試薬があるため、換言すれば、発光出力はウェル当たり100,000細胞での値の正確に200％まで上昇させることができる。しかし、我々はexperimeのために、高プレーティング密度で皮質培養プレートはありませんNTS。また、MAP2とATPレベルはウェルあたり20K細胞からよく22あたり120Kの細胞に至るまで新皮質神経細胞プレーティング密度の20％の変化に敏感であることを発見した。それにもかかわらず、他の研究者はかなりいるため、組織や細胞取り扱いの間ラボ変動の我々の実験から最適な条件を使用するよりも、自分の研究室でこれらのアッセイをテストする必要があります。
毒素による処理後のこれらのアッセイの有用性を説明するために、我々はMG132、プロテアソーム阻害剤（ 図4）で処理したN2a細胞の用量応答曲線を示す。 MG132は、グルタチオン前駆体はN-アセチルシステインの存在下又は非存在下で適用した。これらのデータはまた、N-アセチルシステイン30の保護効果に関する我々の最近の出版物に記載されています。細胞はMG132処理後48時間後に測定した。 MG132は、用量依存的にDRAQ5 +サファイア信号（ 図4A、D）およびα-チューブリンの信号を（減少
細胞力価Gloアッセイによると、ATPレベルは、ATPレベルが治療の際に、細胞の力価に比例し、必ずしもではないことを実証し、MG132（ 図4C）の低濃度で飼育した。 ATPデータは、それらがN2a細胞はMG132で処理するとN-アセチルシステインはまた、代謝機能を保護することを示しているという点で、それでもなお有用である。これは、Tで証明されている彼は、N-アセチルシステインとMG132のIC 50値にシフトする。 ATPに対するIC 50値は、N-アセチルシステイン（ロジック50 = 0.96±0.04、R 2と車両と9.12μMMG132で3.05μMMG132（ロジック50 = 0.48±0.07、R 2 = 0.8616、ヒル勾配= -1.0）であった= 0.9261、ヒル勾配= -1.0）。 ATPの上昇につながった濃度は、この分析では除外されたことに注意してください。分析のすべての値を含む、決定係数を低下させ、車両の存在下で、および9.24μMMG132に4.03μMMG132（ロジック50 = 0.61±0.09、R 2 = 0.7224、ヒル勾配= -1.4）にIC 50値を増加（ロジック50 = 0.96±0.07、R 2 = 0.6607、ヒル勾配= -2.1）、N-アセチルシステイン（ 図4Cとは対照的）の存在下で。
これらの3つのアッセイの第二の例はFigurにおける初代培養のために例示されているE 5。組織は、ラットの新皮質および異種皮質から顕微解剖解離し、ウェル当たり10万個の細胞で播種し、H 2 O 2と平行して処理した。我々は、彼らが神経変性疾患34から39への差別的脆弱であるように、これらの2つの脳領域は、酸化ストレスの処理方法が異なるだろうという仮説を検証した。これらのデータの中には、以前に発表されて、結果はその研究22で詳しく説明されています。 DRAQ5 +サファイアのIC 50値は、新皮質で22.84100μMのH 2 O 2であった異種皮質内（ロジック50 = 1.36±0.07、R 2 = 0.7552、ヒル勾配= -0.95）と24.63100μMのH 2 O 2（ロジック50 = 1.39 0.03±R 2 = 0.9379、ヒル勾配= -1.74）。 MAP2のIC 50値は、11.66100μMの新皮質中のH 2 O 2（ロジック50 = 1.07±0.04、R 2 = 0.9332、ヒル勾配= -2.13）および29.7であった異種皮質における6100μMのH 2 O 2（ロジック50 = 1.47±0.04、R 2 = 0.8934、ヒル勾配= -4.45）。 ATPに対するIC 50値は、異種皮質における新皮質23.82100μMのH 2 O 2（ロジック50 = 1.38±0.03、R 2 = 0.8907、ヒル勾配= -2.56）と44.5μMのH 2 O 2（ロジック50 = 1.65±0.03であった、R 2 = 0.9204、ヒル勾配= -2.71）。異種皮質は、50μM以下のH 2 O 2の濃度で、新皮質よりも酸化ストレスが有意に耐性であったが、DRAQ5 +サファイアアッセイは、この違いを説明するために少なくとも感受性であった。これは後者のアッセイは、MAP2とは異なり、ニューロンからグリアを区別できないことを反映しているのかもしれない。先に述べたように、彼らは、出生後の脳22から収穫されるように、私たちの文化は、いくつかのグリアが含まれています。驚くべきことに、H 2 O 2（75μM以上）、すべてのMAP2の高濃度で
最後に、すべての3つのアッセイを有するプレート内変動性を説明するために、我々は、 図6A〜Cおよび6G-Iにおける上記の用量応答曲線から第二および第三のウェル「生データ点をプロット >。同様に、プレート間の変動を説明するために、我々は、 図6D-Fおよび6J-Lの2つのプレートからの生データポイントの平均（三連ウェルの平均）をプロットした。複製ウェル中で独立した実験全体の信号強度は、すべてのメジャーの有意な相関を示した。初代神経培養中の独立した実験全体の生の値に多少のばらつきは、我々は古い抗体を再利用し、DRAQ5 +サファイアソリューションおよび未使用のATPアッセイを数回試薬再凍結せいか、ありました。初代培養におけるより高い地震変動のもう一つの理由は、文化自体の品質があります。異なる実験日にわたって死後間隔および組織処理の分散を変化させることに寄与し得る。
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図1。赤外線アッセイ（B）用の3つのすべての生存率アッセイ（A）とタイムラインの模式図に示すには、N2a細胞のための推奨手順です。 DRAQ5 +サファイア溶液は異なる二次抗体で染色された他のプレート上で再利用する予定がない場合は、一段階手順を低減する、最終的な1時間のインキュベーションのために抗マウス二次抗体溶液と組み合わせることができる。 ここをクリックしてください。拡大画像を表示します。
ATPアッセイ（A）および手順の節に記載されている赤外線アッセイ（B）は図2（プレートの構成）。ものの96ウェルプレートを示しているが、これらのアッセイは試薬及び細胞を節約するために、384ウェルプレートなどの他の形式に適合させることができる。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図3のN2aマウス神経芽細胞腫細胞における3つ全ての生存率アッセイ（A、B、C）または第一出生後のラットの新皮質ニューロン（D、E、F）のための線形回帰 。それぞれのアッセイのための信号強度は、プレーティング密度の関数としてプロットされている。挿入図はDRAQ5 +サファイア（A、D）、α-チューブリン（B）、またはMAP2（E）染色の代表赤外線画像を示す。生の強度値は、各画像の下に記載されています。でその生の値に注意してください個々のウェルは、その実験について3ウェルの平均から3〜4回の独立した実験の平均値と異なっていてもよい。オリジナルの赤外線画像は、赤（700 nm）以下の緑色（800 nm）の疑似カラーた。各実験は神経細胞に三連のウェルで実施し、N2a細胞および一次ニューロンの両方でDRAQ5 +サファイア3回繰り返して、3倍のα-チューブリンのために、4X MAP2ため、3X ATPに対するN2a細胞であり、ATPに対する4Xた。三連のウェルからのデータは3-4の実験のそれぞれに対して1つの最終値のために平均した。これらの最終的な3-4の値の平均およびSEMをグラフに示されている。 SEMのバーが表示されないようにDRAQ5 +サファイアの値が低い標準偏差を示すことに注意してください。相関の有意性を評価する判定係数R 2及び両側検定p値は、各測定値のために示されている。データは、グラフパッドプリズム（バージョン5.0）で分析した。 Unnithによって、神経化学·インターナショナル、61より転載ら ：エルゼビアの許可を得て、P 356から368 "2からの救助は、N-アセチルシステインと神経変性のハイスループットモデルを打つ」。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図4。MG132毒性に対するN2a細胞の保護 。 N2a細胞を、抗酸化剤N-アセチルシステイン（; 3mMのNAC）の存在下または非存在下でのプロテアソーム阻害剤MG132の指示濃度で処理した。すべての3つの生存能力アッセイを48時間後に実施した。 MG132（C）の低濃度のATPレベルの上昇に注意してください。 DRAQ5 +サファイア染色（A）の Oには、並列増加しないRα-チューブリン（B）は明らかであった。 DRAQ5 +サファイアおよびα-チューブリンの汚れの代表的な赤外線画像を、それぞれ、DとEに赤と緑の疑似カラーた。各実験は三連のウェルで実施し、α-チューブリンのためにDRAQ5 +サファイア、4X用4Xを繰り返し、ATPに対する3Xた。三連のウェルからのデータは3-4の実験のそれぞれに対して1つの最終値のために平均した。これらの最終的な3-4の値の平均およびSEMを示す。 * P≤0.05、N-アセチルシステインに対する水、2方向ANOVA次のボンフェローニ補正の比較について。データは、グラフパッドプリズム（バージョン5.0）で分析した。神経科学、255より転載、江沢民ら ：エルゼビアの許可を得て、P 19-32「N-アセチルシステインは、熱ショックタンパク質依存的にproteotoxicityを鈍く" C拡大画像を表示するためにここになめる。
図5。過酸化水素毒性に対する新皮質とallocortical文化の差の脆弱性 。出生後、一次運動感覚新皮質のと嗅内と梨状異種皮質のMicrodissectionsウェルあたり100K個の細胞で分離し、プレーティングした。 インビトロでの 2日目に、細胞をH 2 O 2の示される濃度で処理した。プレートを48時間後にアッセイした。その異種皮質は新皮質よりも優れたこれらの培養条件を存続し、ベースライン時に高い細胞数を持って注意してください。各実験は三連のウェルで実施し、MAP2のためにDRAQ5 +サファイア、3倍のために4倍を繰り返し、ATPに対する6Xた。三連のウェルからのデータを平均した3-6実験のそれぞれに1つの最終値。これらの最終的な3-6の値の平均およびSEMを示す。 * P≤0.05ネオ対異種皮質、2方向ANOVA次のボンフェローニ補正の比較について。データは、グラフパッドプリズム（バージョン5.0）で分析した。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図6。プレート内およびN2a細胞や皮質ニューロンにおけるMG132とH 2 O 2の用量反応曲線のためのプレート間の相関関係 。すべての個々の実験は三連ウェルで行った。 1及び2を複製するように、各グループ内の第二の2つのウェルからの生データは、A（プレート内で再現性を測定するためにプロットした
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Discussion
我々は、すべての3つの生存能力アッセイにおける信号強度が線形でプレーティング密度と相関することを見出した。ただし、すべてのアッセイは、メッキ密度が2倍または1.5倍の変化にも同様に区別されます。 N2a細胞の場合は、赤外線のアッセイは、特に低メッキ密度で、ATPアッセイよりも感度が低い。赤外線アッセイは、ATPよりも感度が低いですが、彼らは、N-アセチルシステインの高度な保護の影響を明らかにすることで、DRAQ5 +サファイアアッセイおよびα-チューブリンアッセイはよく一致している。そこに両方の分析と赤外線信号の用量反応ロスがあったし、すべての3の生存曲線は、N-アセチルシステインを右にシフトした。 α-チューブリンおよびATPアッセイをDRAQ5 +サファイアアッセイ（Unnithan らの図4を参照してより塩化アンモニウムのような化合物に対してより感受性であると思われるので、このオーバーラップは常に、N2a細胞の処置のすべてのタイプの観察されない。8 ）。このようにして、生存率表現型解析ESは常に平等にすべての3つのアッセイでは表されません。 ATPアッセイは、α-チューブリン及びDRAQ5 +サファイアアッセイ、強度は細胞数を反映した信号の仮定よりもめっきN2a細胞の数に比例してより良好であったが、常に毒素処理後に満たされていない。 ATPレベルは、赤外線アッセイにおける信号で同様の上昇を誘発しなかった毒素濃度で上昇した。これらのデータは、プロテアソーム阻害に応答してN2a細胞の代償的な代謝変化を明らかにし、それ自体で有用である。 U字状のATP用量反応曲線は、ホルミシスと呼ばれる現象の特性である。ホルミシスは毒素や他のストレッサー40〜42への低レベルの暴露に有利な生物学的反応として定義されています。
ニューロンについて、DRAQ5 +サファイア染色は高いメッキ密度でMAP2とATPアッセイよりも感度だった。しかし、DRAQ5 +サファイア、MAP2、およびATPアッセイは、CEに比例して良くなかったウェルあたり100Kの細胞またはそれ以下の一次皮質ニューロンにおけるLL番号。私たちは、ウェルあたり100K個の細胞で神経細胞をプレート。皮質からニューロンは複製することが知られていません。したがって、我々は100K以下、メッキ密度で直線性の詳細については懸念していた。 DRAQ5 +サファイアアッセイは、50μMのH 2 O 2以下の濃度で、MAP2またはATPのいずれよりも新皮質と異種皮質の違いの影響を受けにくくした。さらに、ATPレベルは、おそらく再びATP出力の代償増加を示唆している他の2つのアッセイでの赤外線信号であるH 2 O 2処理、時に劇的に落ちませんでした。 N2a細胞および一次ニューロンにおける3つのアッセイの間の不一致は、総解剖学的構造に影響が及ぶ前に細胞機能を変更できることを反映している可能性があり、細胞骨格タンパク質を含むそのセル構造は、細胞そのものが失われるずっと前に影響を受ける可能性があります。ギルバートと説得力のある同僚による多重生存率アッセイに関する最近のデータこのようなヘキスト核染色とATP測定などの様々な生存能力の措置が部分的にしかして間接的に全体26として実行可能性を反映している特定の細胞特性に関する情報が得られることを示している。したがって、我々は、多くの出版物がそうであるように、代謝生存率を単一のアッセイに依存するすべての3つのアッセイを同時にではなく、実行することをお勧めします。これらの手段のいずれかの詳細については、我々は、個々の細胞を計数した後、細胞数の関数としての細胞骨格タンパク質発現およびATPレベルを評価することをお勧めします。
例えばMTTの代謝生存のための他のアッセイは、存在するが、ATPアッセイの利点は、その感度とダイナミックレンジにある。 MTTアッセイは、ATPの測定値と比較して、生存細胞の数を過大評価し、43 2倍も高いIC 50を示すことができる。さらに、ペティらは、ATPアッセイができることを報告したMTTアッセイは、より少ない25K細胞/ウェル12を検出できませんでしたのに対して、ウェルあたり1563細胞の下限を検出する。信号対雑音比（細胞を含まないウェルのに対して、生細胞を含むウェルからの信号）は、ATP 44のみ7 MTTのためではなく230である。 MTTオーバー発光ATPアッセイの別の利点は、インキュベーション時間がはるかに短いことである。また、PromegaのMTTアッセイは、同じ製造業者からの細胞力価Gloアッセイは、弊社推奨希釈でウェルあたり0.09¢いただきに対し、ウェルあたり0.28¢支払いいただきます。しかし、全ての代謝アッセイには限界がある。代謝活性は、特に壊死の間に、生存から分離することができます。これが問題になる場合、本レポートのアッセイは、膜の完全性の喪失を確認するために乳酸デヒドロゲナーゼ放出の測定と組み合わせることができる。乳酸脱水素酵素の測定は、単に細胞外培地中で行われ、これは、任意の追加のプレートを含まないであろう。
我々は、顕微鏡での手動計数の代替として、これらのアッセイを提示するが、適切に行われた場合、後者は、サンプリングセル数の高感度で正確な手段であることができる。確かに、我々はヘキスト染色された核の数はDRAQ5 +サファイアアッセイよりN2aの細胞数の小さな変化に敏感になることを期待しています。検定のすべてが直線性テストに失敗すると、手動のカウントが不可欠です。この良い例は、我々はより多くの面倒なマニュアルは45を数える実行した上で私たちの初代培養アストロサイトモデルです。細胞数のデータを解釈するときただし、手動カウントの固有のバイアスがコンピュータ化されたアッセイの固有の欠陥がわきブラシをかけてはいけないのと同様に、留意しなければならない。生存率アッセイの長所と短所の数は、したがって、以下に記載される。
DAPIまたはヘキスト汚れが採用されている場合、最初に、収縮した凝縮核はしばしばとして指定されているアポトーシス1。しかし、セルサイズおよび核の凝縮が滑らかな連続体に沿って存在する。これとは対照的に、生と死は、相互に排他的、バイナリ現象である。ライブまたは死細胞の二つの非常に異なるグループが観察されていない限り、このようなをMetaMorphやImageJのような画像処理ソフトウェアではなく、目でアポトーシスであるとしきい値の核の直径以下のすべてのセルをカウントするのが最善と思われる。我々は不可逆的なアポトーシスカスケードが開始されたどの時点でわからないので、当然のことながら、しきい値径の選択は任意である。さらに、定義によって、活性化カスパーゼ3でさえ細胞が死への途上限らないし、おそらく固定46時まだ生存としてカウントする必要があります。当社の赤外線アッセイは、まだ生きて定着時にプレートに接続されたすべての細胞を処理することによって、そのような懸念を回避します。だけ離れて浮いている細胞が死んだとしてカウントされます。これは、2つの別個のカテゴリーのいずれかに細胞を配置し、同時使用の落とし穴を回避するmplex、核の直径のような連続関数。
第二に、手動のカウントは、通常、ウェル全体のごく一部をサンプリング。これは、サンプリングバイアスにつながると、平均の際は、高い標準誤差ができます。私たちの生存率アッセイで、全体の井戸は、ATPのためにサンプリングされ、全ウェルに近い赤外アッセイでサンプリングされている。このサンプリングパターンは、サンプルサイズが大きくなり、十分に手動カウントのための写真をスナップする位置の、時には独断を避けることができます。写真は井戸の中心部を撮影する場合は、1が細胞のほとんど洗い流し毒性の潜在的な過大評価につながる、発生する場所、この領域があることを心に留めなければなりません。対照的に、赤外線のアッセイは、ウェルの極端なコーナーを除外した96ウェルプレートの画像上にグリッドを投げる。所望であれば、ウェルの角は、グリッド内の円の直径を大きくすることによって含めることができる。
第三に、写真家、細胞カウンターではマニュアルのカウント中に盲目にする必要があります。細胞は、毒素で処理されるしかし、一度、彼らはしばしばさえ素人目には非常に明白である形態学的変化を前提としています。これは、はるかに困難な公平を維持するレンダリングします。失明は、我々のアッセイのための要件ではありません。
第四に、手動のカウントは時間がかかり、より給与主任研究を要した。給与は研究を行って、最高のコストの一つです。オデッセイに1プレート用のスキャン時間が「中品質」の設定にのみ8分の長さで、「低品質」の設定にさらに低下させることができる。なお、オデッセイイメージャ一つは使用済みのデモ版を購入した場合であっても、高価であるが、それは一回の固定費であることに留意されたい。一方で、1はまた、DAPI-またはHの手動細胞数のための比較的高価な落射蛍光顕微鏡に投資しなければならないoechst染色された核。初期費用にもかかわらず、オデッセイイメージャも定量的に47,48にウエスタン免疫を測定多目的マシンです。我々は、ラットやマウスの線条体または終脳皮質のような巨視的な脳構造における免疫染色の定量化のためのオデッセイの使用を適応している。このアプローチは、他の人49によって使用されている。組織イメージングのためのオデッセイのイメージャの一つの弱点は、最高の解像度はわずか21程度であるということです。したがって、個々の細胞をカウントすることができず、より微細な解剖学的詳細を可視化することを意図するものではない。
最後に、赤外線のアッセイは、手動のカウントのような細胞数の小さな変化に敏感でないかもしれない。 IC 50値は、したがって、細胞数の正確に50％の損失を誘発する濃度を示すとみなすことはできないが、唯一の赤外線信号の50％の損失を誘発する濃度である。この警告は、おそらくに適用されます顕微鏡によって、個々の細胞数を回避し、全体を一度よくサンプリングすべての生存率アッセイ。このようなアッセイに関連付けられた不正確さが肥大、萎縮、または信号強度に影響を与える他の外観の変化の関数であってもよい。例えば、いくつかの毒素で、各セルにおけるα-チューブリンの免疫反応性は、毒性の関数として上昇することができる。我々は、MG132 8の非常に高い濃度で処理したN2a細胞におけるこの現象を観察した。これが問題である場合、例えば、β-アクチン又はGAPDHなどの他の細胞骨格マーカータンパク質を使用することができる。さらに、N2a細胞は、バイポーラプロセス8,50,51を形成する傾向があると強調した。細胞の大きさの変化と、細胞当たりの蛍光信号出力はまた、処置群にわたって異なる。我々は、毒素処理した細胞がインセル西洋で用いたのと同じマーカーの免疫細胞化学、次の標準の高解像度顕微鏡で検査することをお勧めします。細胞質は、治療の際に、サイズが大きく変化するが、場合核は、我々は核を定量化するためにサファイアずにDRAQ5染色を使用することはお勧めしません。異なる色素で、その他の細胞骨格または他の豊富なタンパク質との今後の研究は、これらの障害を克服するために保証されています。
我々は、すべてのアッセイは警告苦しむと感度懸念、直線性、サンプリング誤差、信号対雑音比、ヒトバイアスまたは主観、時間とコストが上昇していると結論付けている。さらに、すべてのアッセイは常に満たされていない仮定に依存しています。したがって、我々は、少なくとも2つのアッセイは、細胞培養物に対する治療の効果を記述するために使用されること代謝の健康および生存能力に依存して、解剖学的つを測定するものをお勧めします。このようにして、より効果的な治療化合物は、構造と機能の両方を保護するかどうかを確認することができる。
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Disclosures
著者はいずれも開示する競合はありません。
Acknowledgments
我々は、ATPアッセイにおける試薬の量を節約するという考えのためJuliann Jaumotteを認める。私たちは、これらの研究のための財政支援を提供するためのメアリー·カルーソ、デブウィルソン、ジャッキーファラーの見事な行政支援のため、製薬マイラン学校に深く感謝しています。おかげでまたHunkele恐怖の病財団とパーキンソン病と運動障害初代神経研究の彼らの財政支援のための基金によるものである。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Titer Glo | Promega | G7572 | Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks |
| 18% Formalin | Thermo-Shandon | 9990244 | Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells |
| Odyssey Block | LI-COR | 927-40003 | This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 21568 | We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | S468 | One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher | S373 | See above |
| Sodium Azide (250x) | Ricca Chemical Company | 7144.8-16 | Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris |
| Mouse anti-α-tubulin | Sigma-Aldrich | T5168 | This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific |
| Mouse anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M9942 | This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns) |
| 800 nm Goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50200 | This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM |
| Sapphire | LI-COR | 928-40022 | |
| Luminometer | PerkinElmer | VICTOR3 1420 multilabel counter | |
| Odyssey Imager | LI-COR | 9201-01 | |
| Shaker/Mixer | Research Products International | 248555 |
References
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