Summary
Terapeutiske forbindelser blir ofte først undersøkt in vitro med levedyktighet assays. Blindcelletellingene med en menneskelig observatør kan være meget følsom for små endringer i cellenummer, men ikke vurdere funksjon. Datastyrt levedyktighet analyser, slik det er beskrevet her, kan vurdere både struktur og funksjon på en objektiv måte.
Abstract
Manuelle celletall på et mikroskop er en følsom måte å vurdere cellelevedyktigheten, men er tidskrevende og derfor kostbart. Datastyrt levedyktighet analyser er dyrt i form av utstyr, men kan være raskere og mer objektiv enn manuelle celletall. Den foreliggende rapport beskriver bruken av tre slike levedyktighet assays. To av disse analysene er infrarødt og en er selvlysende. Begge infrarøde analyser stole på en 16 bit Odyssey Imager. En infrarød analysen bruker DRAQ5 flekken for kjerner kombinert med Sapphire flekken for cytosol og er visualisert i 700 nm kanal. Den andre infrarøde analysen, en I-Cell Western, bruker antistoffer mot cytoskeletal proteiner (α-tubulin eller mikrotubulus assosiert protein 2) og skiltene dem i 800 nm kanal. Den tredje levedyktighet analysen er en vanlig selvlysende analysen for ATP, men vi bruker en fjerdedel av det anbefalte volumet for å spare på kostnadene. Disse målingene er alle lineære og korrelerer med antallet cells belagt, men varierer i sensitivitet. Alle tre assays omgå tidkrevende mikroskopi og prøve den hele brønnen, og dermed redusere utvalgsfeil. Endelig alle assays kan lett fullføres i løpet av en dag ved slutten av eksperimentet, slik at et større antall forsøk som skal utføres i løpet av korte tidsrammer. Men alle er avhengige av antagelsen om at celletall forbli i forhold til signalstyrken etter behandlinger, en antagelse som noen ganger ikke er oppfylt, spesielt for mobilnettet ATP. Videre, hvis celler øke eller avta i størrelse etter behandling, kan dette påvirker signalstyrken uten å påvirke cellenummer. Vi konkluderer med at alle levedyktighet analyser, inkludert manuelle tellinger, lider av en rekke advarsler, men at datastyrte levedyktighet analysene er vel verdt den opprinnelige investeringen. Bruke alle tre analysene gir sammen et helhetlig syn på cellestruktur og funksjon.
Introduction
Den vanligste levedyktighet analysen i de biologiske vitenskaper innebærer celletall. Dette er dokumentert av en analyse av de beste (de siste) 200 publikasjoner som dukket opp i PubMed med noen av søkeordene "in vitro" eller "kultur" på 4/29/2013 og 4/30/2013. Av disse publikasjonene, 23,5% brukte celle count analyser, inkludert manuelle mobilnummer teller, teller automatiserte celle nummer med bildebehandlingsprogrammer, og Trypanblå eksklusjon. Live / Døde analysen ble brukt i 1% av disse publikasjonene. Den rekke publikasjoner ved hjelp av MTT (3 - (4,5-dimetyl-tiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) assay for metabolsk levedyktighet var 11%. Denne undersøkelse av litteraturen viser også at antallet publikasjoner bruke assays slik som MTT i forbindelse med celletall assays var bare 3,5%. Til tross for trenden å bruke en levedyktighet analysen av seg selv, vurdere cellular funksjon i kombinasjon med cellenummer synes det beste valget for å vurdere cellular jegntegrity. Celletellinger av seg selv er ikke tilstrekkelig, fordi de gjenværende celler ikke kan være funksjonelle eller friske selv om de er til stede i brønnen 1,2. Motsatt kan funksjonelle tiltak som ATP øke eller redusere i fravær av parallelle endringer i antall celler. Den frakopling av metabolske avlesninger fra celle nummer antyder at ATP og MTT-assay aldri skal brukes som eneste levedyktighet assay. I den foreliggende rapporten, er tre levedyktighet analyser som kartlegger både mobil strukturer og metabolsk funksjon beskrevet, for en mer omfattende oversikt over mobilnettet integritet enn noen én analyse av seg selv kan ha råd til.
To av våre analyser krever en infrarød imager som måler fluorescens i de 700 og 800 nm kanaler. Støy er lav i de infrarøde bølgelengder, noe som fører til høyere signal-til-støy-forhold tre. The Odyssey imager som vi bruker har en 4,5 log dynamisk område og en bit-dybde på 16, translating til to 16 eller 65 536 nyanser av infrarød. Dette kan stå i motsetning til 8-bits fargebilder, noe som bare gir 2 8 eller 256 nyanser av farge for hver bølgelengde. Således har 16-bit bilde finere oppløsning. Det bør bemerkes at de originale infrarøde bilder er ofte pseudocolored grønn (800 nm) og rødt (700 nm) i publiserte rapporter for presentasjon. Odyssey kameraer blir ofte brukt både for Western blotting og I-Cell Westerns 4-7. I-Cell Westerns på formaldehyd faste celler bruker primære antistoffer mot ethvert protein av interesse og merke dem i sving med infrarøde fluorescerende sekundære antistoffer. Denne teknikken er kjent for å være spesielt nyttig for fosforylering endepunkter seks. I vår I-Cell Westerns, beis vi faste celler for cytoskeletal proteiner α-tubulin eller nevronale microtubule assosiert protein 2 (MAP2) i 800 nm kanal. Disse proteinene er rikelig nok til å gi høye signal-til-støy-forhold. Vi har også beis våre plater i 700nm kanal for atomkjerner med DRAQ5 flekken og for cytoplasma med Sapphire flekken. Både cytoskeletal proteiner og DRAQ5 + Sapphire flekker dermed reflektere cellulære strukturer.
Den tredje analysen måler levedyktighet metabolsk funksjon, og kalles "Cell Titer Glo." I denne luciferase-baserte assay, luminescens verdier er i direkte forhold til ATP-nivåer. ATP-analyser blir ofte brukt til å kvantifisere levedyktige celler 8-12. Imidlertid inneholder ordet "titer" i navnet til analysen er misvisende, fordi ATP produksjon per celle kan endres som en funksjon av toksin-behandlinger, og er derfor ikke alltid i forhold til celletallet 8.. ATP-nivåer kan også bli påvirket av døgnrytme 13 og ved celledeling 14 og celledifferensiering 15. Ikke desto mindre ATP-analysen er vist her er enkel å utføre og nyttig fordi ATP er en robust mål for metabolsklevedyktighet 16-21, hvis ikke celle nummer per se. Ved hjelp av denne analysen for å utfylle den infrarøde I-Cell Westerns gir derfor et mer helhetlig bilde av cellulær integritet enn noen én analyse alene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Et skjema av protokollene er illustrert i figur 1..
En. Cell Plating
Plate-celler i 96-brønners plater ved forskjellige pletteringstettheter (figur 2). For linearitetskontroll på N2a neuroblastom cellelinje, plate 2.5k, 5k, 10k og 15k celler per brønn i tre eller seks brønner / gruppe. For linearitetskontroll hos rotte primære kortikale nevroner, plate 25k, 50k, 100k og 200k celler per brønn i tre eller seks brønner / gruppe. Hvis cellelinjer eller primærceller av interesse se sunn ved forskjellige pletteringstettheter, plate på og rundt den optimale celletetthet for den celletype.
Merk: I denne studien, ble N2a celler belagt i 100 mL media og primær kortikale nevroner i 200 mL media på platene som er laget for lavere fordampning. For detaljert informasjon om celle håndtering, media, sera, antibiotika, og toksin behandlinger, se Unnithan et al. for N2a cells 8 og Posimo et al. for primær cortex kulturer 22.
- Gjenta plating på en annen 96-brønns plate. En plate vil bli bestemt med hensyn til ATP (figur 2A) og den andre med de infrarøde analyser (figur 2B). Man kan ikke bruke samme plate for ATP og infrarøde analyser fordi cellene må lyseres åpen for intracellulære ATP målinger.
- Pass på å plate minst tre ekstra brønner for bakgrunnen subtraksjon i de infrarøde analyser på det optimale plating tetthet (kolonne 2, figur 2B).
- Legg media uten celler eller, mer inexpensively, sterilt vann til de ytre brønnene i radene A og H og i kolonnene 1 og 12. Unngå å stole på data fra brønner langs kantene, som levedyktighet er ofte lavere her fra effektene av media fordampning og temperaturgradienter. Slike problemer med mikroplater blir ofte kalt kanteffekter 23,24. Ikke holde disse brønnene tomfordi da radene B og G og kolonnene 2 og 11 lider av kanteffekten.
Kant effekter kan reduseres ved å inkubere en fersk sådd plate ved romtemperatur i omgivelsene før overføring til CO2 inkubator 24.. Videre, en fersk undersøkelse utført av Carralot beskriver en matematisk metode som justerer for mikrotiterplater ved hjelp av et enkelt kontroll kolonne 23. Oliver og kolleger brukte en spesialdesignet tvungen luft mikrotiteringsplate kuvøse for å redusere varmegradienter 25. Hvis kanten effekten er av stor betydning, kan kamre mikro stabilitet (f.eks BT & C Incorporated) kjøpes for å skape en homogen mikromiljø med høy luftfuktighet og jevn temperatur gradienter. - Dersom flere brønner enn det som vises i figur 1 er nødvendig fordi flere reagens-fortynninger eller flere pletteringstettheter vil bli testet, bruker brønner kant for bakgrunns subtraksjon.
- Vent natten for festeav celler og analyse neste morgen, som beskrevet nedenfor.
2. Selvlysende ATP-analyse
- Følg Cell Titer Glo produsentens anbefalinger for tilberedning av underlaget med buffer og for inkubasjonstidene.
- Fjern 50 eller 150 pl medier fra 100 eller 200 pl av Plating medier, henholdsvis. Litt mindre enn 50 mL vil forbli bak i brønnen. Tilsett 25 pl av de anvendte reagenser (substrat pluss buffer) til kolonnene 2-6 (fig. 2A) i en 1:02 fortynning.
Merk: Varierende mengder media igjen etter fjerning kunne utvanne eller konsentrere ATP analysereagensene differentially tvers brønner. Vær nøye med å sikre at nivået av væske i alle flerkanals pipetter er tilsvarende. Mål den gjenværende væske i utvalgte brønner på tvers av platen med en pipette umiddelbart før tilsetning av ATP analysereagensene for å sikre nøyaktighet. Hvis høy variabilitet finnes fra differensial priser av media fordampningasjon over overflaten av platen, fjernes alle de gamle mediet og tilsett samme volum av friskt media eller fosfatbufret saltvann (PBS) til alle brønner umiddelbart før tilsetning av ATP analysereagensene. Hvis platene lider av variable nivåer av fordampning, prøver å skifte til den lave fordampnings-plater fra Costar Corning. I de sistnevnte plater, de 60 indre brønner som er vist i figur 2 kun lide et gjennomsnitt på 0.995% ± 0,41 media fordampning over natten. Det er således neglisjerbar variasjon i medievolumet ved analysen. - I kolonner 7 til 11, rekker B til D, fjern nok media til å forlate 50 mL bak, som beskrevet ovenfor, og legger til 50 mL av reagenser i en 1:01 fortynning.
- I kolonnene 7 til og med 11, p E til G, la-celler i 100 pl av mediet og tilsett 100 ul av reagenser, på nytt i en 1:01 fortynning. Selskapet anbefaler at 100 pl av reagens bør fortynnes 1:01 i 100 pl av mediet.
Merk: Forå spare på kostnader, er det mulig å kutte disse anbefalingene både i volum og i fortynning. Imidlertid, før å gjøre dette, å sikre at det ikke reduserer linearitet og følsomhet til analysen. - Når en bestemt mengde og fortynningsfaktoren av reagensene er funnet å være tilfredsstillende feste med dem i alle etterfølgende eksperimenter. Kriteriene for tilfredsstillende data er beskrevet i Resultater delen.
- Ubrukte rekonstituerte reagenser kan fryses på nytt og brukes på et senere tidspunkt for å spare på kostnadene. Ifølge produsenten, kan rekonstituert reagenser oppbevares ved -20 ° C i 21 uker med ~ 3% tap av aktivitet.
- Fjern 50 eller 150 pl medier fra 100 eller 200 pl av Plating medier, henholdsvis. Litt mindre enn 50 mL vil forbli bak i brønnen. Tilsett 25 pl av de anvendte reagenser (substrat pluss buffer) til kolonnene 2-6 (fig. 2A) i en 1:02 fortynning.
- Sett platen på en orbital-ryster i 2 minutter, eller en vippende rister i 10 min. Hvis en del av den plate som blir analysert for en annen måling, og det kan ikke rokkes, omrøre mediet med enkel opp-og-ned pipettering bare i brønnene av interesse. Imidlertid vil store bobler som genereres i løpet av dette trinnet forstyrre luminescent utgang.
- 10 min etter tilsetning av reagensene, overføre 60 ul av brønninnholdet til hvite 96-brønners plater. Luminescens verdier er høyere i hvite plater enn i klare eller sorte plater fordi de reflekterer lyset oppad mot detektoren.
Merk: I vår erfaring, celler overlever bedre på lav fordampning, klare Costar plater enn andre plater. Disse spesifikke plater selges ikke med hvite vegger. For det andre, de ugjennomsiktige vegger og klare bunn platene er dyrere enn helt klare plater. Hvis man overfører lysende væske til hvite plater, kan de hvite platene vaskes og brukes om igjen, noe som sparer på kostnadene ved bruk av nye hvite plater for hvert eksperiment. Overføre væske er dermed billigere alternativ i det lange løp. - Pop eventuelle luftbobler før lesing plate med en nål eller fortrinnsvis med tvungen luft fra et plast overføringspipetten pære. Les platen på en luminometer med en 1 sek integrasjon tid (selskapet å anbefalNDS 0.25-1 sek som tilstrekkelig integrering tid). Les platen 10 til 12 minutter etter tilsetting av ATP analysereagensene. Tidspunktet er kritisk for sammenligning på tvers av forskjellige plater, fordi den luminescerende signalet er forbigående med en fast dempefaktor, som vist ved Gilbert og medarbeidere 26.
- 10 min etter tilsetning av reagensene, overføre 60 ul av brønninnholdet til hvite 96-brønners plater. Luminescens verdier er høyere i hvite plater enn i klare eller sorte plater fordi de reflekterer lyset oppad mot detektoren.
- Gjennomsnittlig de luminescerende verdier fra tre eller seks brønner i hver gruppe, og plottet som en funksjon av celleantallet i et spredningsplott (se figur 3). Først trekker gjennomsnittsbakgrunns luminescens verdier av de aktuelle tomme brønner (brønner 2B - 2G, brønner 11B - 11D og brønner 11E - 11g) fra hvert tilsvarende datapunkt. Det vil være tre forskjellige grupper for hver pletteringstetthet i denne første eksperiment (figur 2A). ATP-nivåer kan være lineært korrelert med celletetthet i en eller alle av disse gruppene. Fortsett med den høyeste fortynning av reagenser som fortsatt gir tilfredsstillende resultater for å spare på kostnadene. Kriterier for tilfredsstillende resultater, er beskrevet in resultatene delen.
Merk: Med medier som brukes i denne studien, bakgrunnsverdier med denne analysen er ikke høy, og det er mulig å hoppe over de tomme brønner. Imidlertid rapporteres produsenten Promega forskjeller i luminescens med annen kultur media. Denne studien bruker Hyclone Fetal Clone III, en syntetisk versjon av fetal bovine serum for N2a celler og storfe kalveserum for primære hjernebark kulturer. Ifølge produsenten, kalveserum avtar luminescens-verdier, men ikke redusere følsomheten til analysen. Ikke desto mindre, hvis dette er av stor betydning, fortynnes ATP analysereagensene i PBS i stedet for mediet ved analysen.- Hvis cellene ser ut til å vokse ujevnt gjennom kolonner over natten, kan du prøve å analysere dem innen seks timer av platekledning. Men, husk at tettheten til vanlig tid av analysen (for eksempel 24 timer etter behandling) er tettheten på som linearitet må oppnås.
Tre. Infrared Analyser
- Morgenen etter plating, fikser cellene i den andre platen ved romtemperatur i en avtrekkshette. Pass på å bruke hansker for dette trinnet og kast fiksativ som kjemisk avfall fordi formaldehyd er kreftfremkallende. Tilsett 4% formaldehyd og 4% sukrose i 0,1 M fosfatbuffer til den eksisterende mediet i en 1:1 fortynning. Mediene kan også vaskes av med PBS før du fester i full styrke fiksativ. Enten teknikken fungerer godt.
- Inkuber i fiksativ for 20 minutter og fjern deretter fiksativ og vaske 3x i 200 mL PBS.
- Lagre platen i PBS med 0,2% natriumazid ved 4 ° C dersom analysen ikke vil finne sted på den samme dag. Hvis ikke, fortsett med analysen og plassere cellene i blokkeringsløsning for å minimalisere ikke-spesifikk binding av antistoffer.
- Spe fisken serum Odyssey blokk 01:01 i PBS og legge 0,3% Triton-X 100 som en celle permeabilizer. Gjør nok blokkering løsning samt primær og sekundær Antibody-løsninger, slik at 35 pl kan bli pipettert i hver brønn. Men hvis en masse bobler er observert under pipettering, gjør> 50 mL for hver brønn, ellers boblene kommer ned i cellene og blokk antistoffer fra bindende. Dreven såpevann bobler vil vises som en uplettet sirkulær flekk i midten av brønnen. Prøv å justere pipettering hvis dette skjer.
- Inkuber i denne blokkerende oppløsning i 30-60 min ved værelsetemperatur.
Merk: 5% bovint serum-albumin eller normale sera fra samme art som det sekundære antistoff kan også bli brukt som blokkerende løsninger for å spare på bekostning av fisken serum blokken. Blokkering av løsninger kan påvirke ytelsen av antistoffet. Således er den optimale blokk for hvert antistoff best bestemmes empirisk.
Merk: Noen etterforskere plassere In-Cell vestlige plater på shakers under inkubasjoner. Men dette er ikke nødvendig.
- Gjør de primære antistoffer: 1:10.000 fortynning for anti-α-tubulin(Mus monoklonalt, tabell 1), og 1:2,000 fortynning for anti-MAP2 (mus monoklonalt, tabell 1). Disse antistoffene er spesifikke proteiner av interesse i disse cellulære modeller; spesifisitet er viktig for ethvert immunocytochemical flekken.
Merk: MAP2 er en markør for nevroner og er hensiktsmessig for blandede nevronale / glial kulturer. De postnatal kulturer vist her inneholder også noen gliaceller (~ 25%) fordi astrocytter vises først på embryonale dag 18, med sine tall topp i tidlig nyfødtperioden 27,28. Man kan ikke skille mellom astrocytter og nevroner i ATP og DRAQ5 + Sapphire analyser. For å måle nevroner og astrocytter separat, bruker samtidig MAP2 og GFAP flekker i 800 og 700 nm kanaler, som beskrevet av Mullett og kolleger 4,29, drar ut DRAQ5 + Sapphire. Men hvis alle cellene i kultur ønsker å bli vurdert, må du bruke en pan-cellular markør som α-tubulin, β-actin, eller GAPDH.
Merk: Disse fortynninger har blitt optimalisert for N2a og primære kortikale celler og kan ikke generalisere til hver modell. Derfor prøver minst to primære antistoff fortynninger, en på venstre halvdel av platen og en på høyre halvdel (se figur 2B). Alternativt kan du prøve 3-4 fortynninger av primære antistoffer på tre brønner hver. For eksempel kan den anbefalte fortynning av antistoffet innleggsark bli flankert med to-fold endringer. Med andre ord, hvis anbefalt fortynning for immunocytochemistry er 1:500, også prøve 1:250 og 1:1.000 fortynningsfaktorer.- Spe antistoffer i 01:01 Odyssey blokk: PBS og legge 0,3% Triton-X. For å spare kostnader, prøve å lage antistoffene i den blokkerende løsning som ble påført til cellene i trinn 3.2.1 ved å fjerne denne oppløsning ved slutten av inkuberingen. Hold cellene i PBS mens du gjør dette, de må ikke tørke ut.
- Inkuber i primære antistoffer enten på 1-2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C. For svakt binding antistoffer og proteiner som ikke er rikelig, kan over natten inkubering bidra til å øke signal.
Merk: La det være minst tre brønner i blokkeringsløsning for bakgrunns subtraksjon ved hver sekundær antistoffkonsentrasjon (brønner 2B-2D og 2E brønnene-2G i figur 2 B). Ikke utsett disse brønnene til enhver primære antistoff overhodet. De viser omfanget av ikke-spesifikk binding av det sekundære antistoff, og er nyttige for beregninger av signal-til-støy-forhold. Hvis det er et problem at de sekundære antistoffene vil føre til høye nivåer av ikke-spesifikk binding, også inneholde kontrollbrønner som ikke er eksponert til enten primær-eller sekundær-antistoff, men mottar samme antall vaskinger. Forskjellen mellom disse brønnene og "sekundær bare" brønner vil avsløre graden av ikke-spesifikk binding som skyldes det sekundære antistoff alene. I vår test på mus N2a celler, signalintensitet med anti-mus sekundært antistoff alene var 0,557 ± 0,032, signal med anti-kaninsekundært antistoff alene var 0,533 ± 0,041, signal uten sekundær antistoff ble 0.357 ± 0.003, og signal med primære og sekundære antistoffer var 11,867 ± 0,911. Vi har derfor ikke observert høye nivåer av ikke-spesifikk binding, selv ved bruk av anti-mus sekundære antistoffer på museceller. Det er flere produsentens for infrarøde sekundære antistoffer, vi anbefaler bare å kjøpe de mange kryss adsorberte seg. Legg merke til at konsentrasjonen av sekundære IgG-antistoffer, kan variere avhengig av kilden.
- Vask av primære antistoffer med tre vasker av 200 mL PBS per brønn, 10 min hver. Primære antistoffer kan lagres ved 4 ° C for et par uker i 0,2% natriumazid og gjenbrukes til små flekker etter rester bli klart når løsningene er holdt opp mot lyset. Dette gjøres kun for å spare på kostnadene. Hvis kostnaden er ikke et problem, gjør ferske antistoffer for hver bruk.
- Spe den sekundære antistoff ved 1:1.000 eller 1:2,000 i 01:01 Odyssey blokk: PBS med 0,3% Triton-X (figur 2B). Tilsett 1:1.000 fortynning til den øvre halvdel av platen, og 1:2,000 til den nedre halvdel av platen. Disse konsentrasjonene kan reduseres ytterligere for å spare på kostnadene, men sjekk for linearitet før du forplikter deg til dette.
Merk: Sørg for å legge den aktuelle sekundære antistoff løsning til bakgrunns subtraksjon brønner (kolonne 2 i figur 2B).- Dersom et andre protein vil bli analysert i stedet for DRAQ5 + safir, etikett celler for α-tubulin eller MAP2 med 700 nm geite-anti-mus-IgG og det andre protein i 800 nm-kanal med primære antistoffer fra en annen enn musearter. De 800 nm kanalen har lavere bakgrunn enn 700 nm kanalen, og bør være reservert for den mest kritiske proteinet av interesse.
- Inkuber i sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur i en skuff for seg lys.
- Vask av sekundære antistoffer med tre vasker av 200 mL PBS per brønn, 10 min hver.
- Gjør DRAQ5 + Sapphire løsninger. For den venstre halvdelen av platen, fortynn DRAQ5 1:10.000 (0,5 pM sluttkonsentrasjon) og safir 1:1000 i PBS med 0,3% Triton-X (kolonnene 3-6, figur 2B). For den høyre halvdelen av platen, fortynn DRAQ5 1:20,000 (0,25 uM), og safir 1:2000 (kolonnene 7-10, figur 2B).
Merk: DRAQ5 brukes til å bli solgt til en 1 mM stock i stedet for en 5 mM stam. Noen tidligere publiserte rapporter brukes derfor 1:4,000 eller 1:2,000 fortynninger av DRAQ5 åtte.- For å spare på kostnadene, hvis to plater blir analysert samtidig, kan det samme DRAQ5 + Sapphire løsninger brukes på to plater i sekvens, pipettering den av den første platen og legge den til andre. Dersom de samme løsningene vil bli brukt to ganger på denne måte, bruk dem opp innen en dag. Utvannet DRAQ5 + Sapphire løsninger kan ikke lagres ved 4 ° C eller fryses for senere bruk.
- Inkuber i disse oppløsningene i 30 minutter ved romtemperatur bort fROM lys. Hvis tid er kort og de DRAQ5 + Sapphire løsninger vil ikke bli gjenbrukt på andre plater med ulike second, legge disse flekkene til de sekundære antistoff løsninger i trinn 3,5 og inkuber i 1 time.
Merk: Ikke legg DRAQ5 + Sapphire løsning til bakgrunns subtraksjon brønner (kolonne 2 i figur 2B) som disse brønnene ikke skal være farget i 700 nm kanal.
- Vask platen 3x med 200 mL PBS per brønn for 10 min hver. Sett 0,2% natriumazid i den endelige PBS vaske hvis platen skal være farget med andre synlige gående sekundære antistoffer etter infrarød avbildning er fullført.
- Skann platen på en Odyssey Imager. Begynn ved å skanne platene på intensitet 5 og 169 mm oppløsning. Enten "middels kvalitet" eller "lav kvalitet" innstillinger er tilstrekkelig. Selskapet fritar ikke detaljert eksitasjon / utslipp filter informasjon. Men utslipps filtre er ca 20 nm bred og er sentrert rundt 720 og 820 nm, ifølge produsenten.
Merk: Det er mulig å skanne plater mens de fortsatt våt som etterforskere ønske å fortsette å farge dem med andre markører. Imidlertid tyder selskapet i sin online protokoll som tørre plater resultere i mindre velstående godt signal spredning. Hvis du skanne dem både våt og deretter tørre å sammenligne data, sørg for å fjerne all PBS fra brønnen fordi gjenværende salter etter fordampning kan føre til høy bakgrunn fluorescens langs kantene.- Odysseen Imager skanner opp og gjennom undersiden av platen. Plater fra forskjellige produsenter, kan kreve ulike fokus forskyvninger fordi bunnen av brønnene kan variere i deres tykkelse og dybde i platen. Prøv å skanne på ulike fokus forskyvninger og se hvor den høyeste signal-til-støy-forhold og skarpeste (mest i fokus) signal oppnås: 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 mm. Se også for å måle dybden av brønnen fra undersiden av en plate med en linjal for å bekrefte findings på Odyssey. Husk at plasten i bunnen av brønnen kan legge til ekstra høyde for å linjal målinger. De Costar platene som brukes i den foreliggende studie kreve et fokus forskyvning på 4,0 mm.
- Bruk I-Cell Western funksjon i programvaren for å plassere den riktig størrelse rutenett på bildet av platen og eksportere dataene til Microsoft Excel. Undersøk de "integrerte intensitet" verdier av de samme brønnene på tvers av ulike fokus forskyvninger å finne de høyeste fluorescens verdier. Fokuset forskyvning som gir den høyeste signal-til-støy forholdet (signal i immunfargete brønner versus "ingen primære negative kontrollbrønner") er den ene for å velge i det følgende.
- Når man fokus offset er vedtatt, skanne igjen i mindre trinn. For eksempel, hvis den lyseste signalet var på 3,5 og 4,0 mm, prøv å skanne på 3,6, 3,7, 3,8, og 3,9 mm og se om det er noen ytterligere forbedring i signalstyrke. Hvis fokuset forskjell er feil, signalintensitet på tvers av de 12 kolonner på en tom plspiste (når alle kolonner skal ha lik signal) vil fremstå som en U-formet kurve i stedet for en flat linje. Hvis dette fortsetter å være et problem med plast plater, prøv med glassbunn plater.
- Trekk fra gjennomsnittet av de integrerte intensiteter i bakgrunnen subtraksjon brønner (figur 2B; brønner 2B - 2D eller brønner 2E - 2G) fra hvert tilsvarende datapunkt i de 700 og 800 nm kanaler. Deretter gjennomsnittet de integrerte signalintensitetene for hver gruppe av brønner. Plotte dataene som et spredningsplott mot celletetthet (se figur 3).
- Sammenligne resultatene fra de to forskjellige fortynninger av primære og sekundære antistoffer og resultatene av de to forskjellige fortynninger av DRAQ5 + safir for å avgjøre om en fortynning hver for etterfølgende forsøk. Hvis linearitet ikke oppnås, kan du prøve å skanne på en annen intensitet. Rescan med intensiteter 3 og 7 i stedet for 5, og Analyser på nytt data. Hvis dataene bedre på en av disse intensiteter mener fortsatt ikke tilfredsstillende, skanne i intervaller rundt den intensitet.
- Vær forsiktig med å analysere bilder hvor programvaren viser hvite flekker i brønnene, disse plassene betegne mettet signal ut av rekkevidden av imager. Scan ved en lavere intensitet hvis dette skjer.
- Hvis linearitet ikke oppnås, prøver også å fikse cellene innen seks timer av plating fordi de kan vokse eller dø ujevnt i ulike kolonner over natten. Også prøve forskjellige plating tettheter, forskjellige skanneintensitet, ytterligere optimaliseringer av Reagens fortynningsfaktorer, glassbunn plater, DRAQ5 av seg selv som en kjerne-bare flekken, eller andre enn anti-α-tubulin eller anti-MAP2 forskjellige antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den hastighetsbegrensende faktor i disse eksperimenter er det infrarøde flekker, som ATP-analysen er relativt korte i varighet. For de infrarøde analyser, forventer vi at åtte 96-brønners plater kan være farget og skannet i løpet av én dag etter svimlende to grupper av fire plater hver (se figur 1). Denne beregningen forutsetter 20 min for fiksering, 30 min for vasking, 30 min for å blokkere, 2 timers primært antistoff, etterfulgt av inkubering i 30 min med vaskinger 1 time sekundært antistoff, etterfulgt av inkubering i 30 min med vaskinger 30 min DRAQ5 + Sapphire etterfulgt av 30 min av vasker, og 34 min av skanning tid for fire tallerkener. Ytterligere femten minutter er priset inn figur 1 for vasker for å redegjøre for forskjøvet pipettering av fire individuelle plater. Tid for dataanalyser er ikke inkludert i dette anslaget. Dersom ATP-assay målinger vil forekomme i parallell for hver infrarød-plate, kan tolv plater analyseres på en dag - seks for den infrarøde flekkens og seks for ATP nivåer.
Kriterier for tilfredsstillende data i regresjonsanalyser (figur 3), som nevnt i protokollen delen, inkluderer en signifikant korrelasjon mellom plating tetthet og signalstyrke (to tailed p ≤ 0,05). Størrelsen av endringer i luminescens-eller infrarødt signal bør også være i forhold til endringene i antall celler. Ideelt sett bør 5k celler har omtrent halvparten av luminescens eller ATP nivåer av 10k celler, og 15k celler bør ha ca 50% høyere verdier enn 10k celler, osv.. Denne proporsjonalitet reflekterer sensitiviteten til analysen, og er forskjellig fra R-2 verdi eller koeffisienten. R 2 bare måler hvor godt regresjonslinjen er tilnærmet lik den sanne datapunkter. Selv om dataene er lineære, kan de relative endringer i signalstyrken ikke stå i forhold til størrelsen av forandringene i celletallet. Dette kan skje whøne regresjonslinjen har en høy R 2, men en lav helling, noe som tyder på at analysen ikke er veldig følsom. Således bør kriteriene for vesentlig korrelasjon og proporsjonalitet av dataene begge tilfredsstilles. Endelig bør endringer i signalstyrken rundt den optimale pletteringstettheten faller innenfor det dynamiske området av instrumentet og analysen. Det dynamiske område er forholdet mellom de største og minste mulige verdier. The Odyssey imager har en 4,5 log dynamisk område og mettet signal viser seg som en skinnende hvit farge i stedet for den vanlige røde eller grønne image for å varsle forskeren at resultatene er ikke lenger kvantifiserbare. Det dynamiske området under analysen selv er smalere på grunn av problemer som maksimal-og minimal pletteringstettheten for en gitt celletype. Hvis man plater ved å øke celle-tettheter, vil metningskurve for disse analysene avslører pletteringstettheter over hvilken ingen ytterligere forskjeller kan løses, enten fordi de er ute avspekter av imager eller fordi cellene ikke overlever trengsel over natten. Tilsvarende, hvis en plater avtagende celletetthet, kan man måle minimum celletetthet under som det ikke er noen flere endringer i signal. Det dynamiske området av analysen omfatter bare pletteringstettheter mellom minimum og maksimum antall celler / brønn som kan løses. Vi har ikke målt hele det dynamiske området for disse spesielle analyser fordi cellene våre ikke overlever godt i tettheter utover de som er rapportert.
Etter optimalisering, vi nå flekke N2a muse neuroblastom celler med anti-α-tubulin på et 1:10.000 fortynning, med anti-mus IgG på en 1:2000 fortynning, og med DRAQ5 + Sapphire løsninger på 1:20,000 og 1:2,000, respektivt. Vi kan også bruke 25 ul av ATP analysereagensene i 50 ul medium. Resultatene under disse betingelser er vist i figurene 3A, B og C, og har blitt publisert before 8. Signalstyrke I alle tre analysene ble signifikant korrelert med antallet celler per brønn. Selv om alle tre analysene var svært lineær, de var ikke tilsvarende i følsomhet. For eksempel visste 5k celler per brønn ikke har nøyaktig halvparten av infrarød flekker som 10k celler per brønn. I motsetning til de infrarøde analyser, ATP-analysen var mer følsom overfor endringer i pletteringstetthet. Med andre ord, falt luminescens med rundt halvparten fra 10k til 5k og fra 5k til 2.5k celler per brønn. Til tross for disse funn på det høyeste følsomhet for ATP-analysen, er det best å utføre alle tre analyser for levedyktigheten for å få et bredere bilde av cellulær helse.
Vi har nå flekke rotte primære nevrale kulturer med anti-MAP2 på en 1:2,000 fortynning, med anti-mus IgG på en 1:1.000 fortynning, og med DRAQ5 + Sapphire løsninger på 1:10.000 og 1:1.000, henholdsvis, og bruke 25 mL av ATP analysereagensene i 50 ul media (figur3D, E og F). Signalstyrken i DRAQ5 + Sapphire analysen var den minste lineære av alle tre analysene fordi det var liten forskjell mellom 100k og 200k celler per brønn i 700 nm kanal. Men signalstyrke på 700 nm var bra i forhold til celle nummer under 100k celler per brønn og vi alltid plate nevrale kulturer på 100k celler per brønn likevel. Likevel har vi også observert at DRAQ5 + Sapphire assay er ikke like følsom for toksin behandlinger som de to andre analyser (se nedenfor). I motsetning til DRAQ5 + Sapphire, signalstyrke var i bedre forhold med plating tetthet for både MAP2 og ATP-analyser. Det bør bemerkes at et større volum av ATP analysereagensene kan forbedre resultatene ved 200k celler per brønn. Med andre ord, kan heves lysende effekt til nøyaktig 200% av verdiene ved 100 k-celler per brønn, fordi det er mer reagens. Men vi aldri plate kortikale kulturer på at høy en plating tetthet for experimeNTS. Vi har også funnet at MAP2 og ATP-nivåer er følsomme for 20% endring i neokortikale neuronal pletteringstetthet, fra 20k celler per brønn til 120k celler per brønn 22.. Ikke desto mindre skal andre forskere teste disse assays i sitt eget laboratorium i stedet for å bruke de optimale betingelser fra våre eksperimenter på grunn av inter-lab variasjon i vev og celle håndtering.
For å illustrere nytten av slike analyser følgende behandlinger med giftstoffer, vi viser dose-responskurvene av N2A-celler behandlet med MG132, en proteasominhibitor (figur 4). MG132 ble anvendt i nærvær eller fravær av glutation-forløperen N-acetylcystein. Disse dataene kan også bli funnet i vår siste utgivelse på den beskyttende effekten av N-acetyl cystein 30. Celler ble analysert 48 hr følgende MG132 behandlinger. MG132 doseavhengig redusert DRAQ5 + Sapphire signal (Fig. 4A, D) og α-tubulin signal (
Ifølge Cell Titer Glo analyse ble ATP-nivåer hevet ved lave konsentrasjoner av MG132 (fig. 4C), som viser at ATP-nivåer er ikke nødvendigvis i forhold til celle-titer etter behandling. ATP data er likevel nyttig ved at de viser at N-acetyl cystein også beskytter metabolsk funksjon når N2A-celler er behandlet med MG132. Dette er dokumentert i tHan skifter i IC-50-verdi på MG132 med N-acetylcystein. IC 50 verdi for ATP var 3,05 mikrometer MG132 (Logic 50 = 0,48 ± 0,07, R 2 = 0,8616, Hill skråningen = -1,0) med kjøretøy og 9,12 mikrometer MG132 med N-acetylcystein (Logic 50 = 0,96 ± 0,04, R 2 = 0,9261, Hill skråningen = -1,0). Legg merke til at konsentrasjonene som førte til økning i ATP ble ekskludert i denne analysen. Inkludert alle verdier i analysen senket determinantkoeffisienten og økt IC 50 verdier til 4,03 mikrometer MG132 (Logic 50 = 0,61 ± 0,09, R 2 = 0,7224, Hill Slope = -1,4) i nærvær av kjøretøyet og til 9,24 mikrometer MG132 (logikken 50 = 0,96 ± 0,07, R2 = 0,6607, Hill Slope = -2,1) i nærvær av N-acetyl-cystein (kontrast med figur 4C).
Et annet eksempel på disse tre analysene er illustrert for primærkulturer i Figure fem. Vev ble microdissected fra rotte neocortex og allocortex, distanserte, belagt på 100k celler per brønn, og behandlet parallelt med H 2 O 2. Vi testet hypotesen om at disse to områder av hjernen vil variere i sin håndtering av oksidativt stress som de er ulikt sårbare for nevrodegenerative sykdommer 34-39. Noen av disse data er publisert før, og resultatene er nærmere omtalt i den studien 22.. De IC 50-verdiene for DRAQ5 + Sapphire var 22.84 mikrometer H 2 O 2 i neocortex (Logic 50 = 1.36 ± 0.07, R 2 = 0,7552, Hill skråningen = -0,95) og 24.63 mikrometer H 2 O 2 i allocortex (Logic 50 = 1,39 ± 0,03, R 2 = 0,9379, Hill skråningen = -1,74). De IC 50-verdiene for MAP2 var 11.66 mikrometer H 2 O 2 i neocortex (Logic 50 = 1,07 ± 0,04, R 2 = 0,9332, Hill skråningen = -2,13) og 29,76 mikrometer H 2 O 2 i allocortex (Logic 50 = 1.47 ± 0.04, R 2 = 0,8934, Hill skråningen = -4,45). De IC 50-verdiene for ATP var 23.82 mikrometer H 2 O 2 i neocortex (Logic 50 = 1.38 ± 0.03, R 2 = 0,8907, Hill skråningen = -2,56) og 44,5 mikrometer H 2 O 2 i allocortex (Logic 50 = 1.65 ± 0.03 , R 2 = 0,9204, Hill skråningen = -2,71). Allocortex var betydelig mer motstandsdyktig mot oksidativt stress enn neocortex ved konsentrasjoner av H 2 O 2 under 50 mikrometer, men DRAQ5 + Sapphire analysen var den minst sensitive i illustrerer denne forskjellen. Dette kan gjenspeile at den sistnevnte analysen ikke kan skille gliaceller fra nerveceller, i motsetning MAP2. Som nevnt tidligere, våre kulturer inneholde noen gliaceller, som de er høstet fra postnatal hjernen 22. Overraskende, ved høye konsentrasjoner av H 2 O 2 (75 mikrometer og ovenfor), når alle MAP2
Til slutt, for å illustrere den intraplate variabilitet med alle tre analysene, plottet vi den andre og tredje brønn 'rå-datapunkter fra de ovennevnte doseresponskurvene i figurene 6A-C-6G-I >. På samme måte, for å illustrere den Interplate variabilitet ble staket gjennomsnittet av rå-datapunkter (gjennomsnittet av tredoble brønner) fra to plater i figurene 6D-F og 6J-L. Signalstyrken i replikere brønner og på tvers av uavhengige eksperimenter viste signifikante korrelasjoner for alle tiltak. Det var litt variasjon i rå verdier på tvers av uavhengige eksperimenter i grunnskolen nevrale kulturer, kanskje fordi vi gjenbruke gamle antistoff og DRAQ5 + Sapphire løsninger og fryses på nytt ubrukt ATP analysereagensene et par ganger. En annen årsak til høyere Interplate variasjon i primærkulturer kan være kvaliteten av kulturen selv. Varierende postmortem intervaller og vev håndtering på tvers av ulike eksperimentelle dager kan bidra til variasjon.
jpg "/>
Figur 1. Skjematisk illustrasjon av alle tre levedyktighet analyser (A) og tidslinje for infrarøde analyser (B). Vist er de anbefalte prosedyrer for N2a celler. Hvis DRAQ5 + Sapphire løsninger ikke skal brukes om igjen på andre plater som er farget med forskjellige sekundære antistoffer, kan de bli kombinert med anti-mus sekundært antistoff til endelig 1 time inkubering, noe som reduserer fremgangsmåten med ett trinn. klikk her å se større bilde.
Figur 2. Plate formatet av ATP assay (A), og de infrarøde analyser (B) som er beskrevet i fremgangsmåtene delen. Selv om en96-brønns plate er illustrert, er disse assays kan tilpasses til andre formater, for eksempel 384 brønners plater, for å spare på reagenser og celler. for å vise større bilde.
Figur 3. Lineær regresjon for alle tre levedyktighet analyser i N2a muse neuroblastom celler (A, B, C) eller primære postnatal rotte neokortikale nevroner (D, E, F). Signalstyrken for hver analyse er plottet som en funksjon av pletteringstetthet. Innfellinger viser representative infrarøde bilder av DRAQ5 + Sapphire (A, D), α-tubulin (B), eller MAP2 (E) flekken. Rå intensitetsverdier er listet opp under hvert bilde. Merk at rå verdier ien enkelt brønn kan være forskjellig fra gjennomsnittet av tre brønner for at eksperimentet og fra et gjennomsnitt av 3-4 uavhengige eksperimenter. De opprinnelige infrarøde bilder ble pseudocolored rød (700 nm) eller grønn (800 nm). Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer brønner og gjentatt 3x for DRAQ5 + Sapphire i både N2a celler og primære nevroner, 3x for α-tubulin, 4x for MAP2, 3x for ATP i N2a celler, og 4x for ATP i nevroner. Dataene fra den tredoble brønner ble tatt i gjennomsnitt for en sluttverdi for hver av 3-4 forsøk. Middelverdien og SEM av 3-4 disse endelige verdier er vist i diagrammet. Merk at DRAQ5 + Sapphire verdier vise lave standardavvik, slik at SEM barer er ikke synlig. R 2 determinantkoeffisient og to tailed p-verdi å vurdere betydningen av sammenhengen blir også illustrert for hvert tiltak. Data ble analysert i GraphPad Prism (Versjon 5.0). Gjengitt fra Nevro International, 61, etter Unnithen et al: "Rescue fra en to traff høy gjennomstrømming modell av nevrodegenerasjon med N-acetyl cystein," s. 356-368, med tillatelse fra Elsevier. Klikk her for å se større bilde.
Figur 4. Beskyttelse av N2a celler mot MG132 toksisitet. N2A-celler ble behandlet med indikerte konsentrasjoner av proteasominhibitor MG132 i nærvær eller fravær av antioksidanten N-acetylcystein (NAC, 3 mM). Alle tre levedyktighet analysene ble utført 48 timer senere. Legg merke til økningen i ATP-nivåer ved lave konsentrasjoner av MG132 (C). Ingen parallell økning i DRAQ5 + Sapphire farging (A) or α-tubulin (B) var tydelig. Representative infrarøde bilder av DRAQ5 + Sapphire og α-tubulin flekker ble pseudocolored rødt og grønt i D og E, henholdsvis. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer brønner og gjentatt 4x for DRAQ5 + Sapphire, 4x for α-tubulin, og 3x for ATP. Dataene fra den tredoble brønner ble tatt i gjennomsnitt for en sluttverdi for hver av 3-4 forsøk. Middelverdien og SEM av 3-4 disse endelige verdier er vist. * P ≤ 0,05 for sammenligning av N-acetyl cystein versus vann, Bonferronikorreksjon følgende to-veis ANOVA. Data ble analysert i GraphPad Prism (Versjon 5.0). Gjengitt fra Neuroscience, 255, etter Jiang et al: "N-acetyl cystein blunts proteotoxicity i et heat shock protein avhengig måte», s. 19-32, med tillatelse fra Elsevier. Cslikke her for å se større bilde.
Figur 5. Differential sårbarhet neokortikale og allocortical kulturer til hydrogen peroxide toksisitet. Microdissections av postnatal primær motorisk og sensorisk neocortex og av entorhinal og piriform allocortex ble skilt og belagt på 100k celler per brønn. På dag 2 in vitro ble cellene behandlet med de angitte konsentrasjoner av H 2 O 2. Platene ble analysert 48 hr senere. Merk at allocortex overlever disse dyrkningsforholdene bedre enn neocortex og har høyere celletall ved baseline. Hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer brønner og gjentatt 4x for DRAQ5 + Sapphire, 3x for MAP2, og 6x for ATP. Dataene fra den tredoble brønner ble midlettil en sluttverdi for hver av 3-6 forsøk. Middelverdien og SEM av 3-6 disse endelige verdier er vist. * P ≤ 0,05 for sammenligning av neo-versus allocortex, Bonferronikorreksjon følgende to-veis ANOVA. Data ble analysert i GraphPad Prism (Versjon 5.0). Klikk her for å se større bilde.
Figur 6. Intraplate og Interplate korrelasjoner for MG132 og H 2 O 2 dose-responskurver i N2a celler og kortikale nevroner. Alle individuelle eksperimenter ble kjørt i triplikat brønner. Rådata fra de andre to brønnene i hver gruppe ble plottet som replikerer 1 og 2 for å måle reproduserbarhet i platene (A,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har funnet at signalstyrken i alle tre levedyktighet assays er lineær og korrelert med pletteringstetthet. Men ikke alle analysene er like følsom for to-ganger eller 1,5 ganger endringer i pletteringstetthet. For N2A-celler, de infrarøde analyser er mindre følsom enn den ATP-analysen, spesielt ved lavere densiteter plating. Selv om de infrarøde analyser er mindre følsom enn ATP, den DRAQ5 + Sapphire assays og α-tubulin assays er i god overensstemmelse ved at de avslører meget beskyttende virkning av N-acetyl-cystein. Det var doseresponsiv tap av infrarødt signal med begge analysene, og alle tre levedyktighet kurver ble forskjøvet til høyre med N-acetylcystein. Denne overlapping er ikke alltid observeres for alle typer av behandlinger av N2A-celler, som α-tubulin-og ATP-tester synes å være mer følsomme for forbindelser slik som ammonium-klorid enn DRAQ5 + safir-analysen (se figur 4 i Unnithan et al. Åtte ). Dermed levedyktighet phenotypes er ikke alltid likt representert ved alle tre analysene. Selv om ATP-analysen var i bedre forhold til antall N2a celler belagt enn α-tubulin og DRAQ5 + Sapphire analyser, under forutsetning av at signalstyrken reflekterer celle tall ble ikke alltid oppfylt etter toxin behandling. ATP-nivåer økte med giftkonsentrasjoner som ikke frembringer en tilsvarende økning i signalet i de infrarøde analyser. Disse data indikerer kompenserende metabolske forandringer i N2A-celler i respons til proteasomhemmingen og er nyttige i seg selv. Den U-formede ATP dose-respons-kurve er karakteristisk for det fenomen som kalles hormesis. Hormesis defineres som gunstige biologiske reaksjoner på lavt nivå eksponeringer mot giftstoffer og andre stressfaktorer 40-42.
For nevroner, den DRAQ5 + Sapphire flekken var mindre følsom enn den MAP2 og ATP-analyser ved høye plating tettheter. Men DRAQ5 + Sapphire, MAP2, og ATP-analyser var godt i forhold til cell nummer i primær kortikale nevroner ved eller under 100k celler per brønn. Vi plate nevroner på 100k celler per brønn. Nerveceller fra cortex er ikke kjent for å gjenskape, og derfor var vi mer opptatt av linearitet på 100k eller lavere plating tettheter. Den DRAQ5 + Sapphire analysen var mindre følsom for forskjeller mellom neocortex og allocortex enn enten MAP2 eller ATP ved konsentrasjoner under 50 mikrometer H 2 O 2. Videre gjorde ATP nivåer ikke faller så dramatisk på H 2 O 2 behandling som infrarødt signal i de to andre analysene, kanskje igjen tyder kompenserende økninger i ATP-utgang. Avvikene mellom de tre analysene i N2a celler og primære nevroner kan gjenspeile at cellulære funksjoner kan endres før brutto anatomiske strukturer er berørt, og at cellestrukturer, inkludert cytoskeletal proteiner, kan bli påvirket lenge før cellene er selv tapt. Nyere data om multiplekse levedyktighet analysene med Gilbert og kolleger bevisendeillustrere at ulike levedyktighet tiltak som Hoechst nukleær farging og ATP målinger gi informasjon om spesifikke cellulære egenskaper som bare delvis og indirekte reflekterer levedyktighet som helhet 26. Vi anbefaler derfor å utføre alle tre analysene samtidig, og ikke stole på en enkelt test for metabolsk levedyktighet så mange publikasjoner gjør. For ytterligere informasjon om noen av disse tiltakene, anbefaler vi å telle individuelle celler og deretter vurdere cytoskeletal protein uttrykk og ATP-nivåer som en funksjon av celle nummer.
Selv om det finnes andre analyser for metabolsk levedyktighet, slik som MTT, den fordel av ATP assay ligger i dens følsomhet og dynamisk område. Det MTT-analysen kan overvurdere antallet levedyktige celler sammenlignet med ATP målinger, og oppviser en IC50 som er to ganger høyere 43. Videre Petty og medarbeidere rapporterte at ATP-analysen kunnedetektere den nedre grense på 1563 celler per brønn mens MTT analysen ikke kunne påvise mindre enn 25 k celler / brønn 12. Signal-til-støy forholdet (signal fra brønner med levende celler versus brønner uten celler) er bare 7 for MTT-men 230 for ATP 44.. En annen fordel med luminescerende ATP assays enn MTT er at inkubasjonstiden er mye kortere. I tillegg er det MTT-analysen fra Promega koster 0,28 ¢ per brønn mens Cell Titer Glo assay fra samme produsent koster 0,09 ¢ per brønn ved de anbefalte fortynninger. Det er imidlertid begrensninger i alle metabolske analyser, metabolsk aktivitet kan være frikoblet fra overlevelse, spesielt under nekrose. Hvis dette er et problem, kan analysene i denne rapporten kombineres med målinger av laktat dehydrogenase utgivelsen å fastslå tap av membranintegritet. Dette vil ikke medføre noen ytterligere plater, som Laktatdehydrogenasemålinger ganske enkelt laget i det ekstracellulære medium.
Selv om vi presentere disse analysene som alternativer til manuelle tellinger på mikroskop, kan sistnevnte være en svært følsom og nøyaktig hjelp av sampling celle nummer hvis utført riktig. Faktisk forventer vi at tellinger av Hoechst-farget kjerner ville være mer følsomme for små endringer i N2a celle nummer enn DRAQ5 + Sapphire analysen. Når alle assays mislykkes linearitet test, manuelle tellinger er avgjørende. Et godt eksempel på dette er vår kultivert primære astrocyte modell, som utfører vi den mer arbeidskrevende manuell teller 45. Imidlertid må de iboende skjevheter av manuelle tellinger tas i betraktning ved tolkning celle count data, akkurat som de iboende feil av datastyrte analyser ikke må feies til side. En rekke styrker og svakheter ved levedyktighet analyser er derfor beskrevet nedenfor.
Først, hvis DAPI eller Hoechst flekker er ansatt, krympet og kondensert kjerner blir ofte betegnet somapoptotiske en. Men cellestørrelse og kondensering av kjerner ligge langs en glatt kontinuum. I kontrast, liv og død er gjensidig utelukkende, binære fenomener. Med mindre to svært distinkte grupper av levende eller døende celler er observert, synes det best å telle alle celler under en terskel atom diameter som apoptotisk med bildebehandlingsprogrammer som MetaMorph eller ImageJ snarere enn ved øyet. Selvfølgelig, er valget for en terskel diameter vilkårlig fordi vi ikke vet på hvilket tidspunkt en irreversibel apoptotisk kaskade initieres. Videre, ved definisjon, til og med celler med aktivert kaspase 3 ikke nødvendigvis er underveis til død og bør kanskje bli regnet som fremdeles er i live ved fiksering 46.. Våre infrarøde analyser unngå slike problemer ved å behandle alle celler som er festet til platen ved fiksering som fremdeles bor. Bare celler som har fløt bort regnes som død. Dette plasserer celler i en av to forskjellige kategorier og unngår fallgruvene ved å bruke en complex, kontinuerlig funksjon som atom diameter.
For det andre manuelle tellinger typisk prøve en liten brøkdel av hele brønnen. Dette kan føre til prøvetaking skjevhet og, til tider, høye standardfeil til gjennomsnittet. Med våre levedyktighet assays, er hele godt samplet for ATP og tilnærmet hele brønnen er samplet med de infrarøde analyser. Denne prøvetakingsmønster øker utvalgsstørrelsen og unngår noen ganger vilkårlig avgjørelse av hvor i brønnen for å knipse et bilde for manuelle tellinger. Hvis bildene er tatt av sentrum av brønnen, må man huske på at denne regionen er der de mest vaske-off av celler oppstår, fører til potensielle overvurderinger av toksisitet. I kontrast til de infrarøde analyser kaste et rutenett på bildet av den 96-brønns plate som bare utelukker de ekstreme kantene av brønnene. Hvis så ønskes, kan hjørnene av brønnene være inkludert ved å øke diameteren av kretsene i gitteret.
Tredje, bør fotografen og celleteller både bli blendet under manuelle tellinger. Men når cellene behandles med giftstoffer, de antar ofte morfologiske endringer som er ganske åpenbart selv for et utrent øye. Dette gjør det mye mer utfordrende å forbli upartisk. Blindhet er ikke et krav for våre analyser.
Fjerde, manuelle tellinger er tidkrevende og koster rektor etterforsker mer i lønn. Lønn er en av de høyeste kostnadene for å drive forskning. Skannetiden for en plate på Odyssey er bare åtte minutter lang på "middels kvalitet"-innstilling og kan senkes ytterligere på "lav kvalitet"-innstillingen. Det bør bemerkes at Odyssey Imager er dyrt, selv når man kjøper en brukt demo-versjon, men det er en engangs faste kostnader. På den annen side har man også til å investere i relativt kost epifluorescence mikroskop for manuell legemer på DAPI-eller Hoechst-farget atomkjerner. Til tross for den første prisen, er Odyssey Imager en flerbruksmaskin som også måler vestlige immunoblots på en kvantitativ måte 47,48. Vi har tilpasset bruk av Odyssey for kvantifisering av farging i makroskopiske strukturer i hjernen som rotte eller mus striatum eller telencephalic cortex. Denne tilnærmingen har også blitt brukt av andre 49. En svakhet ved Odyssey Imager for vev avbildning er at den høyeste oppløsningen er bare 21 mikrometer. Det kan derfor ikke telle de enkelte celler, og er ikke ment å visualisere finere anatomiske detaljer.
Endelig kan de infrarøde analyser ikke være så følsom for små endringer i cellenummer som manuelle tellinger. De IC50-verdier kan derfor ikke betraktes som viser konsentrasjonen som utløser nøyaktig 50% tap av celleantall, men bare som den konsentrasjon som frembringer 50% tap av infrarødt signal. Dette forbeholdet gjelder trolig tilalle levedyktighet analyser som omgår individuelle celletall ved mikroskopi og smake hele godt på en gang. Den unøyaktighet ved slike analyser kan være en funksjon av hypertrofi, atrofi, eller andre endringer i utseende som påvirker signalstyrke. For eksempel, med noen toksiner, α-tubulin immunoreaktivitet i hver celle kan øke som en funksjon av toksisitet. Vi har observert dette fenomenet i N2a celler behandlet med svært høye konsentrasjoner av MG132 åtte. Hvis dette er av interesse, kan andre cytoskeletal markørproteiner, slik som β-aktin eller GAPDH benyttes. Videre understreket N2a celler har en tendens til å danne bipolare prosesser 8,50,51. Med endringer i cellestørrelse, vil fluorescerende signal utgang per celle også forskjellig på tvers av behandlingsgruppene. Vi anbefaler at gift behandlet celler bli undersøkt av standard høy oppløsning mikros følgende immunocytochemistry for de samme markørene som brukes i I-Cell Western. Hvis cytoplasma endres betraktelig i størrelse på behandling, men detnucleus ikke, vi anbefaler å bruke DRAQ5 flekken uten Sapphire å bare kvantifisere atomkjerner. Fremtidige studier med ulike fargestoffer og med andre cytoskeletal eller andre rike proteiner er garantert å overvinne disse hindringene.
Vi konkluderer med at alle analyser lider av begrensninger og har reist bekymringer om følsomhet, linearitet, sampling error, signal-til-støy-forhold, menneskelig bias eller subjektivitet, tid og kostnader. Videre alle analyser stole på forutsetninger som ikke alltid oppfylt. Derfor anbefaler vi at minst to analysene brukes til å beskrive effekten av behandling på cellekulturer, en som måler metabolsk helse og en som er avhengig av anatomiske levedyktighet. På denne måten kan en mer effektiv måte fastslå hvorvidt terapeutiske forbindelser beskytte både struktur og funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av forfatterne har noen konflikter å avsløre.
Acknowledgments
Vi erkjenner Juliann Jaumotte for ideen om å spare på volumene av reagenser i ATP-analysen. Vi er dypt takknemlige for den flotte administrativ støtte av Maria Caruso, Deb Willson, og Jackie Farrer og til Mylan School of Pharmacy for å gi økonomisk støtte til disse studiene. En takk også til de Hunkele fryktede sykdommer Foundation og Parkinsons og bevegelsesforstyrrelser Foundation for sin økonomiske støtte til de primære nevrale studier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Titer Glo | Promega | G7572 | Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks |
| 18% Formalin | Thermo-Shandon | 9990244 | Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells |
| Odyssey Block | LI-COR | 927-40003 | This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | 21568 | We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher | S468 | One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher | S373 | See above |
| Sodium Azide (250x) | Ricca Chemical Company | 7144.8-16 | Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris |
| Mouse anti-α-tubulin | Sigma-Aldrich | T5168 | This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific |
| Mouse anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M9942 | This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns) |
| 800 nm Goat anti-mouse IgG | LI-COR | 926-32210 | Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source |
| DRAQ5 | Biostatus | DR50200 | This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM |
| Sapphire | LI-COR | 928-40022 | |
| Luminometer | PerkinElmer | VICTOR3 1420 multilabel counter | |
| Odyssey Imager | LI-COR | 9201-01 | |
| Shaker/Mixer | Research Products International | 248555 |
References
- Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
- Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G. Effects of GDNF on 6-OHDA-induced death in a dopaminergic cell line: modulation by inhibitors of PI3 kinase. J. Neurosci. 73, 105-112 (2003).
- Patonay, G., Antoine, M. Near-infrared fluorogenic labels: new approach to an old problem. Anal. Chem. 63, (1991).
- Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 deficiency in astrocytes selectively enhances mitochondrial Complex I inhibitor-induced neurotoxicity. J. Neurochem. 117, 375-387 (2011).
- Egorina, E. M., Sovershaev, M. A., Osterud, B. In-cell Western assay: a new approach to visualize tissue factor in human monocytes. J. Thromb. Haemost. 4, 614-620 (2006).
- Aguilar, H. N., Zielnik, B., Tracey, C. N., Mitchell, B. F. Quantification of rapid Myosin regulatory light chain phosphorylation using high-throughput in-cell Western assays: comparison to Western immunoblots. PLoS One. 5, (2010).
- Jinwal, U. K., Dickey, C. A. Cell-based assays for regulators of tau biology. Methods Mol. Biol. 670, 93-108 (2011).
- Unnithan, A. S., Choi, H. J., Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Rescue from a two hit, high-throughput model of neurodegeneration with N-acetyl cysteine. Neurochem. Int. 61, 356-368 (2012).
- Hoskins, C., Wang, L., Cheng, W. P., Cuschieri, A. Dilemmas in the reliable estimation of the in-vitro cell viability in magnetic nanoparticle engineering: which tests and what protocols? Nanoscale Res. Lett.. 7, 10-1186 (2012).
- Essner, M. D., Javed, A., Eleazer, P. D. Effect of sodium hypochlorite on human pulp cells: an in vitro study. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 112, 662-666 (2011).
- Sims, J. T., Plattner, R. MTT assays cannot be utilized to study the effects of STI571/Gleevec on the viability of solid tumor cell lines. Cancer Chemother. Pharmacol. 64, 629-633 (2009).
- Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
- Womac, A. D., Burkeen, J. F., Neuendorff, N., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Circadian rhythms of extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus cells and cultured astrocytes. Eur. J. Neurosci. 30, 869-876 (2009).
- Ataullakhanov, F. I., Vitvitsky, V. M. What determines the intracellular ATP concentration. Biosci. Rep. 22, 501-511 (2002).
- Iglehart, J. D., Silver, D. P. Synthetic lethality--a new direction in cancer-drug development. New Engl. J. Med. 361, 189-191 (2009).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Methods. 160, 81-88 (1993).
- Kangas, L., Gronroos, M., Nieminen, A. L. Bioluminescence of cellular ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. Med. Biol. 62, 338-343 (1984).
- Lundin, A., Hasenson, M., Persson, J., Pousette, A. Estimation of biomass in growing cell lines by adenosine triphosphate assay. Methods Enzymol. 133, 27-42 (1986).
- Sevin, B. U., et al. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol. Oncol. 31, 191-204 (1988).
- Maehara, Y., Anai, H., Tamada, R., Sugimachi, K. The ATP assay is more sensitive than the succinate dehydrogenase inhibition test for predicting cell viability. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 23, 273-276 (1987).
- Andreotti, P. E., et al. Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Res. 55, 5276-5282 (1995).
- Posimo, J. M., Titler, A. M., Choi, H. J., Unnithan, A. S., Leak, R. K. Neocortex and allocortex respond differentially to cellular stress in vitro and aging in vivo. PLoS One. 8, (2013).
- Carralot, J. P., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28, 261-268 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Oliver, D. G., Sanders, A. H., Hogg, R. D., Hellman, J. W. Thermal gradients in microtitration plates. Effects on enzyme-linked immunoassay. J. Immunol. Methods. 42, 195-201 (1981).
- Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS One. 6, (2011).
- Bayer, S. A., Altman, J. Neocortical Development. , Raven Press. (1991).
- Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54, 357-369 (2007).
- Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 knock-down in astrocytes impairs astrocyte-mediated neuroprotection against rotenone. Neurobiol. Dis. 33, 28-36 (2009).
- Jiang, Y., et al. N-Acetyl cysteine blunts proteotoxicity in a heat shock protein-dependent manner. Neuroscience. 255, 19-32 (1016).
- Madeira, A., et al. Caveolin-1 interacts with alpha-synuclein and mediates toxic actions of cellular alpha-synuclein overexpression. Neurochem. Int. 59, 280-289 (2011).
- Fioriti, L., et al. Cytosolic prion protein (PrP) is not toxic in N2a cells and primary neurons expressing pathogenic PrP mutations. J. Biol. Chem. 280, 11320-11328 (2005).
- Zhang, L., et al. Proteasome inhibition modulates kinase activation in neural cells: relevance to ubiquitination, ribosomes, and survival. J. Neurosci. Res. 87, 3231-3238 (2009).
- Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 24, 197-211 (2003).
- Stranahan, A. M., Mattson, M. P. Selective Vulnerability of Neurons in Layer II of the Entorhinal Cortex during Aging and Alzheimer's Disease. Neural Plast. 2010, (2010).
- Duyckaerts, C., Delatour, B., Potier, M. C. Classification and basic pathology of Alzheimer disease. Acta Neuropathol. 118, 5-36 (2009).
- Chu, C. C., Tranel, D., Damasio, A. R., Van Hoesen, G. W. The autonomic-related cortex: pathology in Alzheimer's disease. Cereb. Cortex. 7, 86-95 (1997).
- Braak, H., Del Tredici, K., Bohl, J., Bratzke, H., Braak, E. Pathological changes in the parahippocampal region in select non-Alzheimer's dementias. Ann. N.Y. Acad. Sci. 911, 221-239 (2000).
- Braak, H., Rub, U., Schultz, C., Del Tredici, K. Vulnerability of cortical neurons to Alzheimer's and Parkinson's diseases. J. Alzheimers Dis. 9, 35-44 (2006).
- Calabrese, E. J. Hormesis is central to toxicology, pharmacology and risk assessment. Hum. Exp. Toxicol. 29, 249-261 (2010).
- Giordano, J., Ives, J. A., Jonas, W. B. Hormetic responses in neural systems: consideration, contexts, and caveats. Crit. Rev. Toxicol. 38, 623-627 (2008).
- Mattson, M. P. Hormesis defined. Ageing Res. Rev.. 7, 1-7 (2008).
- Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, (2010).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Astrocyte plasticity revealed by adaptations to severe proteotoxic stress. Cell Tissue Res. , (2013).
- McLaughlin, B., et al. Caspase 3 activation is essential for neuroprotection in preconditioning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 715-720 (2003).
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol. Biol. 536, 499-513 (2009).
- Picariello, L., et al. A comparison of methods for the analysis of low abundance proteins in desmoid tumor cells. Anal. Biochem. 354, 205-212 (2006).
- Tapias, V., Cannon, J. R., Greenamyre, J. T. Melatonin treatment potentiates neurodegeneration in a rat rotenone Parkinson's disease model. J. Neurosci. Res. 88, 420-427 (2010).
- Fenteany, G., Schreiber, S. L. Specific inhibition of the chymotrypsin-like activity of the proteasome induces a bipolar morphology in neuroblastoma cells. Chem. Biol. 3, 905-912 (1996).
- Omura, S., et al. Lactacystin, a novel microbial metabolite, induces neuritogenesis of neuroblastoma cells. J. Antibiot. 44, 113-116 (1991).
