Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Жизнеспособность Анализы на клетки в культуре

Published: January 20, 2014 doi: 10.3791/50645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Pharmaceutical Sciences, Mylan School of Pharmacy, Duquesne University

Summary

Терапевтические соединения часто впервые рассмотрен в пробирке с жизнеспособностью анализов. Слепые количество клеток по человека-наблюдателя может быть очень чувствительны к небольшим изменениям количества клеток, но не оценить функцию. Компьютеризированная жизнеспособности анализы, как описано здесь, может оценить как структуру и функцию на объективной основе.

Abstract

Руководство количества клеток на микроскоп являются чувствительными средством оценки жизнеспособности клеток, но требуют больших затрат времени и, следовательно, дорогой. Компьютеризированная жизнеспособности анализы стоят дорого с точки зрения оборудования, но может быть быстрее и объективнее, чем рассчитывает ручных клеток. В настоящем докладе описывается использование трех таких жизнеспособности анализов. Два из этих анализов инфракрасные и один люминесцентный. Оба инфракрасных анализы полагаться на 16 бит Odyssey Imager. Один инфракрасный анализ использует DRAQ5 пятно для ядер в сочетании с Sapphire пятно для цитозоле и визуализируется в 700 нм канала. Другой инфракрасный анализ, В-Cell Западная, использует антитела против белков цитоскелета (α-тубулина или микротрубочек связаны белка 2) и помечает их в 800 нм канала. Третий жизнеспособность анализ является широко используемым люминесцентные тест для АТФ, но мы используем четверть рекомендованной объема, чтобы сэкономить на стоимости. Эти измерения всех линейных и коррелирует с количеством сеLLS покрытием, но различаются по чувствительности. Все три анализы обойти много времени микроскопии и попробовать весь колодец, тем самым снижая ошибки выборки. Наконец, все анализы легко может быть завершена в течение одного дня в конце эксперимента, что большее количество экспериментов, чтобы быть произведены в короткие сроки. Однако все они опираются на предположение, что число клеток остаются пропорционально уровень сигнала после лечения, в предположении, что иногда не встречал, особенно для сотовой АТФ. Кроме того, если клетки увеличиваются или уменьшаются в размерах после лечения, это может повлиять на уровень сигнала, не влияя количества клеток. Мы пришли к выводу, что все жизнеспособности анализы, в том числе ручных подсчетов, страдают от ряда оговорок, но что компьютеризированные жизнеспособности анализы хорошо стоят первоначальные инвестиции. Используя все три анализы вместе дает полное представление о клеточной структуры и функции.

Introduction

Наиболее распространенным жизнеспособность анализа в области биологических наук включает количество клеток. Об этом свидетельствует анализ лучших (самых последних) 200 публикаций, появившихся в PubMed с любым из ключевых слов "в пробирке" или "культура" на 4/29/2013 и 4/30/2013. Из этих публикаций, 23,5% использовали кол клеток анализы, в том числе ручных подсчетов количества клеток, автоматизированная количество клеток рассчитывает с ПО для обработки изображений, и трипанового синего. Live / Dead анализ использовали в размере 1% от этих публикаций. Число публикаций с использованием МТТ (3 - (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид) Анализ метаболического жизнеспособности составил 11%. Этот обзор литературы показывает также, что число публикаций с использованием анализов, таких как МТТ в сочетании с подсчета клеток анализов было только 3,5%. Несмотря тенденция использовать один жизнеспособность анализа само по себе, оценки клеточной функции в сочетании с числа клеток кажется самый лучший выбор для оценки клеточного Integrity. Количество клеток сами по себе не являются достаточными, поскольку остальные клетки не могут быть функциональными или здоровыми, даже если они присутствуют в скважине 1,2. С другой стороны, функциональные меры, такие как АТФ может увеличиваться или уменьшаться в отсутствие параллельных изменений в количестве клеток. Разобщение метаболических показаний от числа клеток показывает, что АТФ и MTT анализы никогда не должны использоваться в качестве единственного жизнеспособности анализа. В настоящем докладе, три жизнеспособности анализы, что опрос как клеточные структуры и функции обмена веществ описаны, более полное представление о сотовой целостности, чем любой одном анализе сам по себе может позволить.

Двое из наших анализов требуют тепловизорный который измеряет флуоресценцию в нм каналов 700 и 800. Шум является низким в инфракрасном диапазоне, что приводит к более высоким коэффициентом 3 сигнал-шум. Одиссея тепловизор, который мы используем имеет 4,5 журнала динамический диапазон и битовую глубину от 16 translatinг до 2 16 или 65536 оттенков ИК-порт. Это можно сравнить с 8-битного цвета изображений, которые только получают 2 8 или 256 оттенков цвета для каждой длины волны. Таким образом, 16-битный изображений имеет более высокое разрешение. Следует отметить, что исходные инфракрасных изображений, часто псевдоцветной зеленый (800 нм) и красный (700 нм) в опубликованных отчетах для представления. Odyssey тепловизоры обычно используются как для вестерн-блоттинга и В-клеточной вестернов 4-7. В Cell вестерны на формальдегида фиксированной клеток использовать первичных антител против любого интересующего белка и маркировать их, в свою очередь с помощью инфракрасных флуоресцентных вторичными антителами. Этот метод известен быть особенно полезно для фосфорилирования конечными точками 6. В нашем В-клеточной вестернах, мы пятно фиксированных клеток для белков цитоскелета α-тубулина или нейронов микротрубочек связанных белков 2 (MAP2) в 800 нм канала. Эти белки являются достаточно обильные, получая высокие отношения сигнал-шум. Мы также окрасить наши тарелки в 700нм канал для ядер с DRAQ5 пятно и для цитоплазмы с Sapphire пятно. Оба белков цитоскелета и DRAQ5 + Sapphire пятна, таким образом, отражают клеточные структуры.

Третий жизнеспособность анализе измеряют функцию обмена веществ и называется "Сотовый Титр Glo.« В этом люциферазы основе анализа, значения люминесценции находятся в прямой пропорции к уровня АТФ. ATP анализы обычно используются для количественной оценки жизнеспособных клеток 8-12. Тем не менее, в том числе слово "титр" во имя анализа является чем-то неправильным, потому что выход АТФ на клетку можете изменить в зависимости от токсина лечения и, следовательно, не всегда пропорционально клеток номер 8. Уровни АТФ также может зависеть от циркадных ритмов 13 и клеточного деления 14 и дифференцировки клеток 15. Тем не менее, анализ ATP, показанный здесь, прост в исполнении и полезно, потому что АТФ является надежной мерой метаболическойЖизнеспособность 16-21, если не сотового телефона по себе. Использование этого теста в дополнение к ИК в ячейке вестерны поэтому дает более полную картину клеточной целостности, чем только какой-либо одной анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Схема протоколов проиллюстрировано на Рисунке 1.

1. Сотовый Покрытие

Пластина клеток в 96-луночных планшетах при различных плотностях гальванических (рис. 2). Для проверки линейности на N2A клеточной линии нейробластомы, плиты 2.5K, 5к, 10к, и 15k клеток на лунку в 3 или 6 скважин / группы. Для проверки линейности в крысиных первичных корковых нейронов, листовым 25k, 50k, 100k, и 200k клеток на лунку в 3 или 6 скважин / группы. Если клеточные линии или первичные элементы интересных выглядят здоровыми при различных плотностях покрытия, плиты на и вокруг оптимальной плотности клеток для этого типа клеток.

Примечание: В настоящем исследовании, N2A клетки высевают в 100 мкл СМИ и первичных корковых нейронов в 200 мкл среды на пластинах, которые предназначены для нижней испарения. Для получения подробной информации об обработке клеток, СМИ, сывороток, антибиотиков, и токсинного лечения см. Unnithan соавт. для N2A челLs 8 и Posimo др.. для первичных культур коры 22.

    1. Повторите покрытие на второй 96-луночного планшета. Одна пластина будет анализировали на АТФ (фиг.2А), а другой с ИК анализами (фиг. 2B). Никто не может использовать ту же самую тарелку для АТФ и инфракрасных анализов, потому что клетки должны быть лизируют открыта для внутриклеточных АТФ измерений.
    2. Будьте уверены, к пластине, по крайней мере 3 дополнительных скважин для вычитания фона в инфракрасных анализов на оптимальной плотности покрытия (колонка 2; Рисунок 2B).
  2. Добавить средствах массовой информации без клеток или, более недорого стерильную воду к наружным скважин в строках А и Н и в колонках 1 и 12. Избегайте опираясь на данные из скважин по краям, как жизнеспособность зачастую ниже, здесь от последствий СМИ испарения и температурных градиентов. Такие проблемы с микропланшетов обычно называют краевые эффекты 23,24. Не держите эти скважины пустпотому что тогда ряды B и G и столбцы 2 и 11 страдают от краевого эффекта.
    Краевые эффекты могут быть уменьшены путем инкубации с недавно посеянных пластины при комнатной температуре в условиях окружающей среды до переноса в CO 2-инкубаторе 24. Кроме того, недавнее исследование Carralot описывает математический метод коррекции для микротитрационных планшетах с использованием одного столбца 23 управления. Оливер и его коллеги использовали специально разработанный принудительного воздушного микропланшет инкубатор для снижения температурных градиентов 25. Если край эффект вызывают серьезную озабоченность, камеры стабильность микропланшет (например BT & C Объединенные) можно приобрести, чтобы создать однородную микросреду с высокой влажностью и даже температурных градиентов.
  3. Если больше скважин, чем показано на рисунке 1 необходимы, потому что дополнительные разведения реагентов или больше плотности обшивки будут проверены, использовать краевые скважин для вычитания фона.
  4. Подождите одну ночь для прикрепленияклеток и анализа на следующее утро, как описано ниже.

2. Люминесцентные АТФ Анализ

  1. Следуйте рекомендациям сотового Титр Glo производителя по восстановления подложки с буфером и для времени инкубации.
    1. Удалить 50 или 150 мкл носители из 100 или 200 мкл обшивки СМИ, соответственно. Чуть менее 50 мкл останется позади в скважине. Добавить 25 мкл реагентов (субстратов плюс буфер) в столбцы 2-6 (рис. 2А) в разведении 1:02.
      Примечание: Различные объемы средств массовой информации, оставленных после удаления может разбавить или сконцентрировать АТФ реагентов для анализа дифференциально через скважин. Следите за тем, что уровень жидкости во всех многоканальных пипеток эквивалентно. Измерьте оставшуюся жидкость выберите скважин по всей пластине с помощью пипетки непосредственно перед добавлением АТФ реагентов для анализа, чтобы обеспечить точность. Если высокая изменчивость существует с дифференциальных ставок СМИ evaporAtion по всей поверхности пластины, удалить все старые носители и добавить такой же объем свежей средой или забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) в каждую лунку непосредственно перед добавлением АТФ анализа реагентов. Если пластины страдают от переменных уровней испарения, попробуйте переключиться на низких испарения плит из Costar Corning. В последних пластинок, 60-интерьера скважины показано на рисунке 2 страдают только от среднего 0,995% ± 0,41 медиа испарения в течение ночи. Существует, таким образом, вариабельность незначительным объемом средств массовой информации во время анализа.
    2. В колонках с 7 по 11, строки B через D, удалить достаточно средств массовой информации, чтобы покинуть 50 мкл позади, как описано выше, и добавить 50 мкл реагентов в разведении 1:1.
    3. В колонках с 7 по 11, строки E через G, оставьте клетки в 100 мкл среды и добавить 100 мкл реагентов, опять же в разведении 1:1. Компания рекомендует 100 мкл реагентов должны быть разбавлены 1:01 в 100 мкл среды.
      Примечание: Для того,сэкономить на стоимости, можно сократить эти рекомендации как по объему и в разведении. Тем не менее, прежде чем делать это, убедитесь, что он не уменьшает линейность и чувствительность анализа.
    4. После того, как один конкретный объем и коэффициент разбавления из реагентов признано удовлетворительным, придерживаться их во всех последующих экспериментах. Критерии удовлетворительных данных описаны в разделе результатов.
    5. Неиспользованные восстановленные реагенты могут быть замораживать и использовать на более поздний срок, чтобы сэкономить на стоимости. По заявлению производителя, восстановленные реагенты могут храниться при температуре -20 ° С в течение 21 недель с ~ 3% потери активности.
  2. Место пластины на орбитальном шейкере в течение 2 мин или нутационное шейкере в течение 10 мин. Если часть пластины в настоящее время анализируют на другом измерении, и это не может быть поколеблено, агитировать СМИ с простой до-и-вниз пипетки только в лунки интерес. Однако чрезмерное пузырьки, генерируемые во время этого этапа будет мешать люминесценцииВыход nescent.
    1. 10 мин после добавления реагентов, передача 60 мкл содержимого также в белые 96-луночные планшеты. Значения люминесценции выше в белых пластин, чем в ясных или черных пластин, потому что они отражают свет вверх по направлению к детектору.
      Примечание: По нашему опыту, клетки выживают лучше на низкой испаряемости, четкие CoStar пластины по сравнению с другими пластинами. Эти конкретные пластины не продаются с белыми стенами. Во-вторых, непрозрачные стенки и ясные дном тарелки стоят дороже, чем полностью прозрачных пластин. Если передает люминесцентный жидкости в белых пластин, белые тарелки можно мыть и повторно использовать, экономя на стоимости с использованием новых белых пластин для каждого эксперимента. Передача жидкости, таким образом, более дешевый вариант в долгосрочной перспективе.
    2. Поп пузырьки воздуха до чтения пластину с иглой или, предпочтительно, с принудительным воздушным из пластиковой пипетки передачи лампочки. Читайте пластину на люминометре с 1 сек времени в интеграции (компания recommeNDS 0,25-1 сек время как достаточно интеграция). Читайте пластины 10-12 мин после добавления АТФ реагентов для анализа. Ремень имеет решающее значение для сравнения через различные тарелки, потому что сигнал люминесцентный является временным с высокой скоростью распада, как показано на Гилберта и коллегами 26.
  3. Среднее значение на основании значения люминесцентные из 3 или 6 скважин в каждой группе и участка в зависимости от числа клеток в диаграмме рассеяния (см. Рисунок 3). Впервые вычесть средние фонового свечения значения соответствующих пустых скважин (колодцев 2B - 2G, колодцы 11B - 11D и скважин 11E - 11G) от каждой соответствующей точки данных. Там будет три разные группы для каждой плотности покрытия в этот начальный эксперимент (рис. 2А). Уровни АТФ может быть линейно коррелирует с плотностью клеток в одной или всех этих групп. Продолжайте наибольшего разведения реагентов, которые до сих пор дает удовлетворительные результаты, чтобы сэкономить на стоимости. Критерии удовлетворительные результаты описаны ян секция Результаты.
    Примечание: С массовой информации, используемых в настоящем исследовании, фоновые значения с данного анализа не являются высокими, и это можно пропустить пустые скважины. Однако производитель сообщает Promega различий в люминесценции с различной культуральной среде. Настоящее исследование использует Hyclone плода Clone III, синтетический вариант эмбриональной телячьей сыворотки для N2A клеток и телячьей сыворотки для первичных корковых культур. По заявлению производителя, телячьей сыворотки уменьшается значения люминесценции, но не уменьшается чувствительность анализа. Тем не менее, если это серьезное беспокойство, разбавленные АТФ реагентов для анализа в PBS вместо массовой информации во время анализа.
    1. Если клетки появляются расти неравномерно по столбцам ночь, попробуйте анализируя их в 6 часов посева. Тем не менее, иметь в виду, что плотность в обычное время анализа (например, 24 ч после обработки) является плотность, при которой линейность должна быть достигнута.

3. Infrareг Анализы

  1. На следующее утро после обшивки, фиксации клеток в второй пластины при комнатной температуре в вытяжном шкафу. Обязательно носите перчатки для этого шага и распоряжаться фиксатора как химические отходы, потому что формальдегид является канцерогеном. Добавить 4% формальдегида и 4% сахарозы в 0,1 М фосфатном буфере с существующей информации в разведении 1:1. Средства массовой информации также могут быть смыты с PBS до фиксации в полной силы фиксатором. Либо техника хорошо работает.
    1. Выдержите в фиксатора в течение 20 мин, затем снимите фиксатор и промыть 3 раза в 200 мкл PBS.
  2. Хранить пластину в PBS с 0,2% азида натрия при 4 ° С, если анализ не будет иметь место в тот же день. В противном случае, приступить к анализа и поместить клетки в блокировании решения, чтобы минимизировать неспецифическое связывание антител.
    1. Развести рыбы сыворотки Odyssey блок 1:01 в PBS и добавить 0,3% Triton-X 100 как сотовый permeabilizer. Оставьте достаточно блокирующего раствора, а также начального и среднего Antiboду так, что решения 35 мкл может быть пипеткой в ​​каждую лунку. Тем не менее, если много пузырьков наблюдаются при пипетировании, сделать> 50 мкл для каждой лунки, в противном случае пузырьки доходят в клетки и блок антител из переплета. Чрезмерное мыльные пузыри появится как незапятнанной круглого пятна в середине колодца. Попробуйте настроить пипетирование если это произойдет.
    2. Инкубировать в этом блокирующем растворе в течение 30-60 мин при комнатной температуре.
      Примечание: 5% бычий сывороточный альбумин или нормальный сыворотки из того же вида, что и вторичного антитела также могут быть использованы как блокирование решения, чтобы сэкономить на стоимости блока рыбы в сыворотке крови. Блокирование решения может повлиять на производительность антитела. Таким образом, оптимальный блок для каждого антитела лучше определить эмпирически.
      Примечание: Некоторые исследователи разместить в ячейке западных пластинок на шейкеры во инкубации. Тем не менее, это не является необходимым.
  3. Сделать первичные антитела: 1:10000 разбавления для анти-α-тубулина(Мышиное моноклональное, таблица 1) и 1:2000 разбавление для анти-map2 (мышиного моноклонального, таблица 1). Эти антитела специфичны к белкам, представляющих интерес в этих клеточных моделей; специфичность имеет важное значение для любого иммуноцитохимического пятна.
    Примечание: MAP2 является маркером нейронов и подходит для смешанных нейронных / глиальных культур. Послеродовом культуры, показанные здесь, также содержат некоторые глии (~ 25%), потому что астроциты появится сначала на эмбриональный день 18, с их число пика в раннем неонатальном периоде 27,28. Один не может отличить астроцитов и нейронов в АТФ и DRAQ5 + Sapphire анализов. Для того чтобы измерить нейроны и астроциты отдельно, использовать одновременно MAP2 и окрашивание GFAP в нм каналов 800 и 700, как описано Mullett и коллегами 4,29, оставляя DRAQ5 + Sapphire. Однако, если все клетки в культуре хотите быть оценены, использовать пан-клеточный маркер, такой как α-тубулина, β-актина, или GAPDH.
    Примечание: Эти разведения были оптимизированы для N2A и первичных корковых клеток и, возможно, не обобщаются на каждой модели. Поэтому постарайтесь по крайней мере два разведения первичных антител, один на левой половине пластины и один на правой половине (см. рисунок 2b). Кроме того, попробуйте 3-4 разведения первичных антител на 3 лунок каждый. Например, рекомендуемые концентрации на вкладыше антитело листа может быть замкнут с двукратных изменений. Другими словами, если рекомендуемые концентрации для иммуноцитохимии 1:500, также пытаются 1:250 и 1:1000 факторы разбавления.
    1. Развести антител в 1:01 Odyssey блока: PBS и добавить 0,3% Triton-X. Чтобы сэкономить на стоимости, попытайтесь получения антител в блокирующем растворе, который был применен к клеткам в шаге 3.2.1 удалением это решение в конце инкубации. Держите клеток в PBS, делая это, они не должны высыхать.
    2. Инкубировать в первичных антител или 1-2 часов при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С. Для слабо бinding антител и белков, которые не в изобилии, овернайт инкубации может помочь увеличить сигнал.
      Примечание: Оставьте не менее 3 скважин в блокировании решения для вычитания фона при каждой концентрации вторичного антитела (скважины 2B-2D и скважин 2E-2G на рисунке 2B). Не подвергайте эти скважины к любому первичного антитела бы то ни было. Они показывают степень неспецифического связывания по вторичным антителом и полезны для расчетов сигнал-шум. Если есть опасения, что вторичные антитела приведет к высоким уровням неспецифическое связывание, также включают в себя контрольные лунки, которые не подвергаются либо первичной или вторичной антитела, но получают одинаковое количество стирок. Разница между этими скважин и "вторичный" скважин только покажет степень неспецифического связывания, вызванного вторичного антитела в покое. В нашем тесте на мыши N2A клеток, интенсивность с антимышиным вторичным антителом сигнализировать один был 0,557 ± 0,032, сигнал с антикроличьеодин вторичное антитело было 0,533 ± 0,041, сигнал без вторичного антитела 0,357 ± 0,003, а сигнал с первичными и вторичными антителами был 11,867 ± 0,911. Таким образом, мы не наблюдали высокий уровень неспецифического связывания даже при использовании анти-мышиные вторичные антитела на клетках мыши. Есть несколько производителя инфракрасных вторичными антителами, мы рекомендуем только покупать высоко перекрестно-адсорбированные из них. Следует отметить, что концентрация вторичных антител IgG может варьироваться в зависимости от источника.
  4. Смыть первичных антител с 3 стирок 200 мкл PBS на лунку, 10 минут каждый. Первичные антитела могут быть сохранены при 4 ° С в течение нескольких недель в 0,2% азида натрия и повторно до тех пор, крошечные пятнышки мусора не становятся очевидными, когда решения проходят вверх к свету. Это делается только, чтобы сэкономить на стоимости. Если стоимость не является проблемой, что приготовить антител для каждого использования.
  5. Развести вторичного антитела с 1:1000 или 1:2000 в 1:01 Odyssey блока: PBS с 0,3% Triт-X (рис. 2В). Добавить разбавление 1:1000 в верхней половине пластины и 1:2000 в нижней части пластины. Эти концентрации могут быть дополнительно снижены, чтобы сэкономить на стоимости, но проверить на линейность до совершения этого.
    Примечание: Не забудьте добавить соответствующее решение вторичного антитела к вычитание фона скважин (столбец 2 на рисунке 2B).
    1. Если второй белок будет анализировали на месте DRAQ5 + сапфир, этикетка клеток для α-тубулина или МАР2 с 700 нм козы против мышиного IgG и второго белка в 800 нм канала с первичными антителами от других, чем мыши видов. Нм канал 800 имеет меньше фона, чем 700 нм канала и должны быть зарезервированы для наиболее важных белка.
    2. Инкубировать в вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре в ящике от света.
  6. Смыть вторичные антитела с 3 стирок 200 мкл PBS на лунку, 10 минут каждый.
  7. Сделать решения DRAQ5 + Sapphire. Для левой половине пластинки, разбавленные DRAQ5 1:10000 (0,5 мкМ конечная концентрация) и Sapphire 1:1000 в PBS с 0,3% Triton-X (столбцы 3 - 6; фиг.2В). Для правой половине пластинки, разбавленные DRAQ5 1:20000 (0,25 мкм) и Sapphire 1:2000 (колонки 7 - 10; фиг.2В).
    Примечание: DRAQ5 используется для продажи на складе 1 мм вместо запаса 5 мм. Некоторые ранее опубликованные отчеты поэтому используется 1:4000 или 1:2000 разведения DRAQ5 8.
    1. Чтобы сэкономить на стоимости, если две пластины, подвергаемые исследованию, одновременно, то же самое DRAQ5 + Sapphire растворы могут быть использованы на двух пластинах в последовательности, пипетки это от первой пластины и добавлением его в секунду. Если же растворы будут использоваться дважды таким образом, использовать их в течение одного дня. Решения Разводненная DRAQ5 + Sapphire не могут быть сохранены при 4 ° С или замороженными для последующего использования.
    2. Выдержите в этих растворах в течение 30 мин при комнатной температуре вдали ером свет. Если времени мало, и DRAQ5 + решения Sapphire не будет повторно использовать на других плит с различными вторичными, добавить эти пятна к решениям вторичных антител в шаге 3.5 и инкубировать в течение 1 часа.
      Примечание: Не добавляйте DRAQ5 + решение Sapphire на вычитание фона скважин (столбец 2 на рисунке 2B), как эти скважины не должны быть окрашены в 700 нм канала.
  8. Промыть пластины 3 раза с 200 мкл PBS на лунку в течение 10 мин каждый. Поместите 0,2% азида натрия в конечной промывки PBS, если пластина будет окрашивали с другими видимого диапазона вторичных антител после инфракрасной техники будет завершена.
  9. Сканирование пластину на Odyssey Imager. Начните с просмотре пластинок при интенсивности 5 и разрешением 169 мм. Либо "среднего качества" или настройки "низкого качества" являются достаточными. Компания не выпускает подробную информацию фильтра возбуждения / эмиссии. Тем не менее, фильтры выбросов примерно на 20 нм в ширину и сосредоточены вокруг 720 и 820 нм, по данным производителя.
    Примечание: Можно сканировать листы в то время как все еще влажный, как следователи возможно, пожелает продолжить, чтобы окрасить их с другими маркерами. Тем не менее, компания предлагает в своем онлайн-протокола, что сухие пластины привести к менее хорошо к-а распространения сигнала. При сканировании их обоих мокрой, а затем сухой, чтобы сравнить данные, не забудьте удалить все PBS из колодца, потому что остальные соли после испарения может привести к высокому фоновой флуоресценции по краям.
    1. Odyssey Imager сканирует до и через нижнюю часть пластины. Плиты из разных производителей может потребовать различных фокус-смещение, потому что дно лунки может варьироваться в их толщины и глубины в пластине. Попытка сканирования на различных смещений фокусировки и посмотреть, где самая высокая отношение сигнал-шум и Самое четкое (наиболее в фокусе) сигнал достигается: 2,5 мм, 3,0 мм, 3,5 мм, 4,0 мм. Попытка также для измерения глубины скважины от нижней части пластины с линейкой, чтобы подтвердить FindinГЦБ на Одиссее. Следует помнить, что пластик в нижней части скважины может добавить дополнительную высоту измерения линейки. В Costar плиты, используемые в данном исследовании, требуют фокус смещение 4,0 мм.
    2. Используйте Western функцию В-клеток в программном обеспечении, чтобы поместить правую размера сетки на изображение пластинки и экспортировать данные в Microsoft Excel. Изучите "интегральной интенсивности" значения одних и тех же скважин в различных фокус-зачетов найти самые высокие значения флуоресценции. В центре внимания смещение, которое дает самый высокий сигнал-шум (сигнал в иммуноокрашиванию скважин против "не первичных негативных управления" скважин) является то, чтобы выбрать в дальнейшем.
    3. После того, как одного из основных направлений смещение принято решение, повторите сканирование с меньшим шагом. Например, если самая яркая сигнал был на уровне 3,5 и 4,0 мм, попробуйте сканировать в 3,6, 3,7, 3,8, и 3,9 мм и посмотреть, есть ли дальнейшее улучшение уровня сигнала. Если фокус смещение не так, интенсивности сигналов через 12 колоннами на пустой плели (когда все столбцы должны иметь равный сигнал) появится в виде U-образной кривой, а не прямой линией. Если так будет продолжаться, чтобы быть проблемы с пластмассовыми пластинами, попробуйте стеклянным дном тарелки.
  10. Вычтите среднем интегральных интенсивностей в фоновом режиме вычитания скважин (рис. 2В; скважин 2B - 2D или скважин 2E - 2G) от каждого соответствующего точке данных в нм каналов 700 и 800. Затем в среднем интегральных интенсивностей сигналов для каждой группы скважин. Участок данные в виде диаграммы рассеяния против плотности клеток (см. рисунок 3).
    1. Сравните результаты двух различных разведений первичных и вторичных антител и результаты двух различных разведений DRAQ5 + Sapphire по урегулированию на одном разбавления каждого для последующих экспериментов. Если линейность не достигается, попробуйте сканировать в другом интенсивности. Повторное сканирование с интенсивностью 3 и 7, а не 5 и повторно проанализировать данные. Если данные улучшения в одном из этих интенсивностей, новсе еще не является удовлетворительным, повторное сканирование с шагом вокруг той интенсивности.
    2. Будьте осторожны, не анализировать изображения, где программное обеспечение показывает белые пятна в лунках; эти пятна означают насыщенный сигнал из диапазона тепловизора. Сканирование по более низкой интенсивности, если это произойдет.
    3. Если линейность не достигается, попробуйте также для фиксации клеток в 6 часов посева, потому что они могли бы расти или умереть неравномерно в разных колонках на ночь. Кроме того, попробуйте разные плотности покрытия, различную интенсивность сканирования, дальнейшие оптимизации реагента факторов разбавления, прозрачным дном тарелки, DRAQ5 сам по себе как ядро ​​только пятно, или других, чем анти-α-тубулина или анти-МАР2 различных антител.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Скорость-ограничивающим фактором в этих экспериментах инфракрасный окрашивание, как анализ АТФ является относительно коротким по продолжительности. Для инфракрасных анализов, мы ожидаем, что восемь 96-луночные планшеты могут быть окрашены и сканируется в течение одного дня по ошеломляющие двух партий четырех пластин каждый (см. рисунок 1). Эта оценка предполагает 20 мин фиксации, 30 мин стирки, 30 мин блокировки, 2 ч инкубации первичного антитела с последующим 30 мин промывок, 1 час инкубации вторичное антитело затем 30 мин промывок, 30 мин DRAQ5 + Sapphire затем 30 мин промываний и 34 мин времени сканирования для 4 пластин. Пятнадцать дополнительных минут учитываются в рисунке 1 для промываний, чтобы объяснить шахматном пипетки из четырех отдельных пластин. Время для анализа данные не включены в эту оценку. Если измерения анализов АТФ будет происходить параллельно для каждого инфракрасного пластины, двенадцать пластины могут быть проанализированы в один день - шесть для инфракрасного пятнас и шесть для уровня АТФ.

Критерии удовлетворительных данных в регрессионного анализа (рис. 3), как уже упоминалось в разделе протокола, включают значительную корреляцию между плотностью покрытия и силы сигнала (двухсторонний р ≤ 0,05). Размер изменений в люминесценции или инфракрасного сигнала также должны быть в пропорции к изменениям в ряде клеток. В идеале, 5k клетки должны иметь приблизительно половину свечение или уровень АТФ из 10k клеток, и 15k клетки должны иметь приблизительно 50% больше значения, чем 10k клеток и т.д.. Это пропорциональности отражает чувствительность анализа и отличается от R 2 значения или коэффициента детерминации. R 2 только показывает, насколько хорошо линия регрессии которых приблизительно равна истинные точки данных. Даже если данные являются линейными, относительные изменения в силе сигнала не может быть в пропорции к размеру изменений в числе клеток. Это может произойти шкурица линия регрессии имеет высокую R 2, но низкий наклон, предполагая, что анализ не очень чувствительна. Таким образом, критерии значимой корреляции и соразмерности данных должны как быть удовлетворены. И, наконец, изменения в силе сигнала вокруг оптимальной плотности нанесения покрытия должны находиться в пределах динамического диапазона прибора и анализа. Динамический диапазон представляет собой соотношение между наибольшим и наименьшим возможных значений. Одиссея тепловизор имеет динамический диапазон 4,5 журнала и насыщенным сигнал появляется как яркий белый цвета вместо обычного красного или зеленого изображения в целях предупреждения исследователю, что результаты более не поддаются количественной оценке. Динамический диапазон в ходе самого анализа является уже из-за таких вопросов, как максимальной и минимальной плотности покрытия для любого данного типа клеток. Если один планшеты при увеличении плотности клеток, кривая насыщения этих анализов раскроет плотности обшивки выше которой никакие дальнейшие различия не могут быть решены, либо потому, что они находятся внедиапазон тепловизор или потому, что клетки не пережить давку на ночь. Аналогичным образом, если один пластины уменьшения плотности клеток, можно измерить плотности минимальные клеток, ниже которого нет никаких дальнейшие изменения в сигнале. Динамический диапазон анализа включает в себя только плотности обшивки между минимальным и максимальным количеством клеток / лунку, которые могут быть решены. Мы не измеряется полный динамический диапазон для этих конкретных анализов, потому что наши клетки не выживают хорошо при плотностях, помимо тех, которые сообщили.

После оптимизации, мы теперь пятно N2A мыши клеток нейробластомы с анти-α-тубулина в разведении 1:10000, с анти-мыши IgG при разведении 1:2000, и с решениями DRAQ5 + Sapphire на 1:20,000 и 1:2000, соответственно. Мы также используем 25 мкл реагентов для анализа АТФ в 50 мкл СМИ. Результаты в этих условиях показаны на фигурах 3А, В и С и были опубликованы ДОе 8. Мощность сигнала во всех трех тестах достоверно коррелировал с количеством клеток на лунку. Хотя все три анализы были очень линейная, они не были эквивалентны по чувствительности. Например, 5k клеток на лунку не было точно половина количества инфракрасного окрашивания как 10k клеток на лунку. В отличие от инфракрасных анализов, анализ АТФ был более чувствителен к изменениям плотности металлизации. Другими словами, люминесценция упал примерно на половине от 10k до 5K и от 5к до 2.5K клеток на лунку. Несмотря на эти выводы на самом высоком чувствительность анализа АТФ, то лучше, чтобы выполнить все три анализы для жизнеспособности, чтобы получить более широкую картину клеточного здоровья.

Теперь мы пятно крысы первичных нейронов культур с анти-МАР2 в разведении 1:2000, с анти-мыши IgG при разведении 1:1000, и с решениями DRAQ5 + Sapphire на 1:10000 и 1:1000 соответственно, и использовать 25 мкл из реагентов для анализа АТФ в 50 мкл среды (рис.3D, Е и F). Уровень сигнала в DRAQ5 + Sapphire анализа был наименее линейная всех трех анализах, потому что было мало разницы между 100k и 200k клеток на лунку в 700 нм канала. Тем не менее, уровень сигнала на длине волны 700 нм была хорошо пропорционально числу клеток ниже 100k клеток на лунку, и мы всегда пластины нейронных культур в 100k клеток на лунку в любом случае. Тем не менее, мы также отмечено, что DRAQ5 + Sapphire анализ не столь чувствительны к токсина обработок по двух других анализов (см. ниже). В отличие от DRAQ5 + Sapphire, сила сигнала была в лучшей пропорции с плотностью гальванических как для МАР2 и АТФ анализов. Следует отметить, что больший объем реагентов для анализа АТФ может улучшить результаты при 200k клеток на лунку. Другими словами, люминесцентные выход может быть увеличена до точно 200% от стоимости на 100к клеток на лунку, потому что есть более реагент. Тем не менее, мы никогда не пластины корковых культур в то высокой плотностью покрытия для experimeНТС. Мы также обнаружили, что уровни MAP2 и ATP чувствительны к 20% изменений в неокортекса нейронов плотности покрытия, начиная от 20k клеток на лунку в 120 тыс. клеток на лунку 22. Тем не менее, другие исследователи должны проверить эти анализы в собственной лаборатории, а не использовать оптимальные условия от наших экспериментах из-за изменчивости между лаборатории в ткани и обработки клеток.

Для того чтобы проиллюстрировать полезность этих анализов следующих лечения с токсинами, мы покажем кривые доза-ответ N2A клеток, обработанных MG132, ингибитор протеасом (рис. 4). MG132 был применен в присутствии или в отсутствие глутатион-предшественника N-ацетилцистеин. Эти данные также можно найти в нашей недавней публикации на защитных эффектов N-ацетил цистеин 30. Клетки анализировали 48 часов следующих MG132 лечения. MG132 в зависимости от дозы снизилась DRAQ5 + Sapphire сигнал (рис. 4А, D) и α-тубулина сигнала ( IC50 в отсутствии или в присутствии N-ацетил цистеин. Уравнение использовали Y = 100 / (1 ​​+ 10 ^ ((логика 50-X) * HillSlope))). Значение ИК 50 для DRAQ5 + Sapphire был 1,64 мкМ MG132 (логические 50 = 0,22 ± 0,03, R2 = 0,9477, Хилл наклон = -1,26) и α-тубулина уровнях 1,96 мкМ MG132 (логические 50 = 0,29 ± 0,04, R 2 = 0,9296, Хилл наклон = -1,349). N-ацетилцистеин кривые сдвинуты вправо, предполагая, что более MG132 требовалось, чтобы убить клетки в присутствии этого защитного соединения. В присутствии N-ацетил цистеин, значение IC 50 для DRAQ5 + Sapphire был 4,64 мкМ MG132 (логические 50 = 0,67 ± 0,05, R2 = 0,8732, Хилл наклон = -1,06) и α-тубулина был 6.35 мкмоль MG132 ( Logic 50 = 0,80 ± 0,04, R2 = 0,8802, Хилл склон = -10,382). Одно исследование N2A клеток Мадейра и коллегами сообщили около 50% потери жизнеспособности в 10 мкМ MG132, если судить по МТТ 31. Фиорити сообщили 60% потери жизнеспособности 4 ч после обработки 50 мкм MG132, опять же с МТТ 32. Наконец, Чжан и его коллеги сообщили 60% потери жизнеспособности в 10 мкМ MG132, используя подсчеты Хехст окрашенных ядер 33. Эти значения ИК 50 выше, чем у нас. Тем не менее, мы анализа на жизнеспособность 48 ч после начала лечения, в отличие от этих предыдущих исследований.

В соответствии с сотового Титр Glo анализа, уровни ATP были подняты при низких концентрациях MG132 (Рисунок 4C), демонстрируя, что уровни АТФ не обязательно пропорционально клеток титра после обработки. Данные АТФ, тем не менее полезны тем, что они показывают, что N-ацетилцистеин также защищает функцию метаболизма при n2a клетки обрабатывают MG132. Об этом свидетельствует в тон переложить в стоимости MG132 IC 50 с N-ацетил цистеин. Значение ИК 50 для АТФ 3,05 мкМ MG132 (логические 50 = 0,48 ± 0,07, R2 = 0,8616, Хилл наклон = -1.0) с транспортного средства и 9,12 мкМ MG132 с N-ацетил цистеин (логика 50 = 0,96 ± 0,04, R 2 = 0,9261, Хилл наклон = -1.0). Обратите внимание, что концентрации, которые привели к росту в АТР, были исключены в этом анализе. В том числе всех значений в анализе снизил коэффициент детерминации и увеличили значения IC50 до 4,03 мкМ MG132 (логические 50 = 0,61 ± 0,09, R2 = 0,7224, Хилл Наклон = -1,4) в присутствии транспортного средства и 9,24 мкМ MG132 (логика 50 = 0,96 ± 0,07, R2 = 0,6607, Хилл Наклон = -2,1) в присутствии N-ацетил цистеин (контрастного с фиг.4С).

Второй пример этих трех анализов показано на первичных культурах в Figurе 5. Ткань микродиссекции от неокортекса крыс и allocortex, в отрыве, высевали при 100к клеток на лунку и обрабатывают параллельно с H 2 O 2. Мы проверили гипотезу, что эти два региона мозга будет отличаться в их обращении с окислительным стрессом, поскольку они по-разному уязвимы для нейродегенеративных заболеваний 34-39. Некоторые из этих данных были опубликованы до и результаты обсуждаются далее в этом исследовании 22. IC 50 значения для DRAQ5 + Sapphire были 22.84 мкМ Н 2 О 2 в коре головного мозга (логика 50 = 1,36 ± 0,07, R2 = 0,7552, Хилл наклон = -0,95) и 24.63 мкМ Н 2 О 2 в allocortex (логика 50 = 1,39 ± 0,03, R2 = 0,9379, Хилл наклон = -1.74). IC 50 значения для МАР2 были 11.66 мкМ Н 2 О 2 в коре головного мозга (логика 50 = 1,07 ± 0,04, R2 = 0,9332, Хилл наклон = -2,13) ​​и 29,76 мкМ Н 2 О 2 в allocortex (логика 50 = 1,47 ± 0,04, R2 = 0,8934, Хилл наклон = -4,45). IC 50 значения для АТФ были 23.82 мкМ Н 2 О 2 в коре головного мозга (логика 50 = 1,38 ± 0,03, R2 = 0,8907, Хилл наклон = -2,56) и 44,5 мкМ Н 2 О 2 в allocortex (логика 50 = 1,65 ± 0,03 , R 2 = 0,9204, Хилл наклон = -2.71). Allocortex была значительно более устойчивы к окислительному стрессу, чем неокортекс в концентрациях Н 2 О 2 ниже 50 мкМ, но DRAQ5 + Сапфир анализ был наименее чувствительны в иллюстрировании эту разницу. Это может отражать, что последний анализ не может отличить глии из нейронов, в отличие от МАР2. Как упоминалось ранее, наши культуры содержат некоторое глии, так как они собирают из постнатального мозга 22. Удивительно, но при высоких концентрациях Н 2 О 2 (75 мкМ и выше), когда все MAP2 + астроциты в этих культур более устойчивы к Н 2 О 2, чем МАР2 + нейронов (не показан), мы предполагаем, что неокортикальные астроциты менее уязвимы к окислительному повреждению, чем allocortical астроцитов. Эта модель может быть отражено в DRAQ5 + Sapphire анализа, но не анализа АТФ, так как окислительно поврежденные астроциты не метаболически жизнеспособным. Какой бы ни была причина этих поразительных картин, эти первичные данные культуры проиллюстрированы здесь только чтобы показать, что анализы не всегда в согласии.

Наконец, для того, чтобы проиллюстрировать внутриплитных изменчивость со всеми тремя анализов, мы построили сырые точек данных второго и третьего Уэллса из вышеуказанных кривых доза-ответ на рисунках 6A-C и 6G-I >. Аналогичным образом, с тем чтобы проиллюстрировать изменчивость Interplate, были построены среднее сырья точек данных (среднее значение трех лунок) с двумя пластинами на рисунках 6D-F и 6J-L. Уровень сигнала в повторных скважин и через независимых экспериментов выставлены значимые корреляции для каждой меры. Был некоторый изменчивость сырьевых значений по независимых экспериментов в первичных нейронов культур, возможно, потому, что мы повторно старый антитела и решения DRAQ5 + Sapphire и заморозить неиспользованный АТФ анализа реагенты пару раз. Другой причиной более высокой изменчивости межплитного в первичных культурах может быть качество самой культуры. Различные интервалы посмертные и обработка ткани через различных экспериментальных дней может способствовать дисперсии.

JPG "/>
Рисунок 1. Схематическое изображение всех трех жизнеспособности анализов (А) и сроки для инфракрасных анализов (B). Указаны рекомендуемые процедуры для N2A клеток. Если растворы DRAQ5 + сапфир не будет повторно использовать на других пластин, которые окрашивали с различными вторичными антителами, они могут быть объединены с анти-мыши раствора вторичного антитела для окончательного 1 ч инкубации, уменьшая процедуру на один шаг. Нажмите здесь чтобы просмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2
Рисунок 2. Формат Тарелка анализа АТФ (А) и инфракрасных анализов (B), которые описаны в разделе процедур. Хотя96-луночный планшет иллюстрируется, эти анализы могут быть адаптированы для других форматов, таких как 384-луночных планшетах, чтобы сэкономить на реагентов и клеток. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 3
Рисунок 3. Линейные регрессии для всех трех жизнеспособности анализов в N2A мыши клетках нейробластомы (A, B, C) ​​или первичные послеродовые неокортекса крысы нейроны (D, E, F). Мощность сигнала для каждого анализа на графике как функция плотности покрытия. На врезках представительства инфракрасные образы DRAQ5 + Sapphire (A, D), α-тубулина (B), или MAP2 (Е) пятно. Значения Сырье интенсивности перечислены ниже каждого изображения. Обратите внимание, что сырые значения виндивидуальный хорошо, может отличаться от среднего 3 скважин для этого эксперимента и от среднего 3-4 независимых экспериментов. Оригинальные инфракрасные изображения были псевдоцветной красный (700 нм) или зеленый (800 нм). Каждый эксперимент проводили в трех лунок и повторяется 3 раза для DRAQ5 + Sapphire в обоих n2a клеток и первичных нейронов, 3x для α-тубулина, 4x для МАР2, 3x АТФ в клетках N2A, и 4x для АТФ в нейронах. Данные из трех лунок были усреднены для одного конечного значения для каждого из 3-4 экспериментов. Среднее значение и SEM из этих конечных значений 3-4 показана на графике. Следует отметить, что DRAQ5 + сапфира значения демонстрируют низкие стандартные отклонения, так что SEM полосы не видны. Коэффициент R 2 решимости и два вероятность значений оценки значимости корреляции также показаны для каждой меры. Данные были проанализированы в GraphPad Prism (версия 5.0). Печатается по Нейрохимия International, 61, по Unnithи др.: "Спасение из двух хит высокой пропускной модели нейродегенерации с N-ацетил цистеин," р 356-368, с разрешения Elsevier. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 4
Рисунок 4. Защита N2A клеток от MG132 токсичности. N2a клетки обрабатывали указанными концентраци ми ингибитора протеасом MG132 в присутствии или в отсутствии антиоксиданта N-ацетилцистеин (NAC, 3 мМ). Все три жизнеспособности анализы проводили при 48-часовом позже. Обратите внимание на повышение уровня АТФ при низких концентрациях MG132 (С). Нет параллельно увеличение DRAQ5 + Sapphire окрашивания (A) оR α-тубулина (B) была очевидной. Представительства инфракрасные образы DRAQ5 + Sapphire и α-тубулина пятен были псевдоцветной красного и зеленого в D и Е соответственно. Каждый эксперимент проводили в трех лунок и повторил 4x для DRAQ5 + Sapphire, 4x для α-тубулина и 3x для АТФ. Данные из трех лунок были усреднены для одного конечного значения для каждого из 3-4 экспериментов. Среднее значение и SEM из этих конечных значений 3-4 показана. * Р ≤ 0,05 для сравнения N-ацетил цистеин против воды, Бонферрони коррекции следующие двусторонней ANOVA. Данные были проанализированы в GraphPad Prism (версия 5.0). Печатается по неврологии, 255, Цзян и др.: "N-ацетил цистеин притупляет proteotoxicity в ударной белка-зависимым способом тепла", стр. 19-32, с разрешения Elsevier. Cлизать здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 5
Рисунок 5. Дифференциальная уязвимость неокортекса и allocortical культур к перекиси водорода токсичности. Microdissections послеродовой первичной моторной и сенсорной коры головного мозга и из энторинальной и грушевидной allocortex диссоциировали и высевали на 100к клеток на лунку. В день в пробирке 2, клетки обрабатывали указанными концентрациями H 2 O 2. Планшеты анализировали при 48-часовом позже. Обратите внимание, что allocortex выживает эти условия культивирования лучше, чем неокортекс и имеет более высокие числа клеток в начале исследования. Каждый эксперимент проводили в трех лунок и повторил 4x для DRAQ5 + Sapphire, 3x для МАР2, и 6x для АТФ. Были усреднены Данные из трех лунокдля одного конечного значения для каждого из 3-6 экспериментов. Среднее значение и SEM из этих конечных значений 3-6 показана. * Р ≤ 0,05 для сравнения нео-против allocortex, Бонферрони коррекции следующей двусторонний ANOVA. Данные были проанализированы в GraphPad Prism (версия 5.0). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 6
Рисунок 6. Внутриплитная и Interplate корреляции для MG132 и H 2 O кривые отклика 2 дозы в N2A клеток и нейронов коры. Все индивидуальные эксперименты проводили в трех лунок. Необработанные данные из вторых двух скважин в каждой группе были нанесены в виде воспроизводит 1 и 2 для измерения воспроизводимости в пластинах (А, С для N2A клеток и G, H, и я для мозга). Данные из одних и тех же групп в двух независимых экспериментах (среднее значение трех лунок) откладывают в виде пластины 1 и пластины 2 для измерения воспроизводимости через пластин (D, E, и F для N2A клеток и J, K, L для мозга). Коэффициент R 2 решимости и два вероятность значений оценки значимости корреляции также показаны для каждой меры. Данные были проанализированы в GraphPad Prism (версия 5.0). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы обнаружили, что уровень сигнала во всех трех анализов жизнеспособности является линейной и коррелирует с плотностью нанесения покрытия. Тем не менее, не все анализы одинаково чувствительны к 2 раза или в 1,5 раза изменений плотности покрытия. Для n2a клеток, инфракрасные анализы менее чувствительны, чем анализа АТФ, особенно при более низких плотностей покрытия. Хотя инфракрасные анализы менее чувствительны, чем АТФ, то DRAQ5 + Sapphire анализы и α-тубулина анализы находятся в хорошем согласии в том, что они раскрывают весьма защитный влияние N-ацетил цистеин. Был от дозы потеря инфракрасного сигнала с обоих анализах и все три кривые жизнеспособности были сдвинуты вправо с N-ацетилцистеин. Это перекрытие не всегда соблюдается для всех типов обработок n2a клеток, так как α-тубулина и АТФ анализы кажутся более чувствительны к соединений, таких как хлорид аммония, чем DRAQ5 + Sapphire анализа (см. фиг.4 в Unnithan соавт. 8 ). Таким образом, жизнеспособность phenotypэс не всегда в равной степени представлены все три анализов. Хотя анализ АТФ был в лучшей пропорции к количеству N2A посеянных клеток, чем α-тубулина и DRAQ5 + Sapphire анализов, в предположении, что уровень сигнала отражает число клеток не всегда встречали после лечения токсина. Уровни ATP поднялся в концентрациях токсина, которые не вызывают аналогичное повышение сигнала в инфракрасном анализов. Эти данные свидетельствуют о компенсационных метаболические изменения в N2A клеток в ответ на ингибирование протеасом и полезны сами по себе. П-образные АТФ кривую доза-реакция характерна для феномена, называемого гормезис. Гормезис определяется как благоприятных биологических реакций на воздействия низких уровней радиации в токсинов и других факторов стресса 40-42.

Для нейронов, DRAQ5 + Сапфир пятно было менее чувствительны, чем МАР2 и АТФ анализов при высоких плотностях покрытия. Тем не менее, DRAQ5 + Сапфир, MAP2 и ATP анализы были хорошо пропорционально сеLL число в первичных корковых нейронов на уровне или ниже 100к клеток на лунку. Мы пластины нейроны в 100к клеток на лунку. Нейроны из коры не известны повторить, поэтому мы были больше озабочены линейности на 100к или более низких плотностях покрытия. DRAQ5 + Сапфир анализ был менее чувствителен к различиям между неокортекса и allocortex или чем МАР2 или АТФ в концентрациях ниже 50 мкмоль H 2 O 2. Кроме того, уровни АТФ не упал так резко, на H 2 O 2 лечение в виде инфракрасного сигнала в двух других анализов, возможно, снова предлагая компенсационные увеличение производства АТФ. Расхождения между тремя анализов в N2A клеток и первичных нейронов может отражать, что клеточные функции могут измениться до валовые анатомические структуры страдают, и что клеточные структуры, в том числе белков цитоскелета, могут быть затронуты задолго до того, клетки сами потеряли. Последние данные о мультиплекс жизнеспособности анализов Гилберт и коллег убедительнопоказывают, что различные меры жизнеспособности, такие как Hoechst ядерного окрашивания и измерений АТФ получить информацию о специфических клеточных характеристик, которые лишь частично и косвенно отражают жизнеспособность в целом 26. Поэтому мы рекомендуем выполнять все три анализов одновременно, а не полагаться на единственный тест для метаболического жизнеспособности как многие издания делают. Для получения дополнительной информации о любом из этих мер, мы рекомендуем считая отдельных клеток, а затем оценки цитоскелета экспрессию белка и уровень АТФ в зависимости от количества клеток.

Хотя существуют и другие анализы для метаболического жизнеспособности, такие как МТТ, преимущество анализа АТФ заключается в его чувствительности и динамического диапазона. МТТ-анализ переоценить количество жизнеспособных клеток в сравнении с измерениями АТФ и проявляет IC 50, которая выше, в два раза 43. Кроме того, Петти и его коллеги сообщили, что анализ АТФ могобнаружить нижний предел 1563 клеток на лунку в то время как МТТ-анализ не может обнаружить менее 25К клеток / лунку 12. Отношение сигнал-шум (сигнал от скважин с живых клеток по сравнению с скважин без каких-либо клеток) составляет всего 7 для МТТ но 230 для АТФ 44. Еще одно преимущество люминесцентных АТФ анализов более МТТ является то, что время инкубации намного короче. Кроме того, МТТ от Promega стоит 0,28 центов в скважине, тогда как сотовый Титр Glo анализ от того же производителя стоит 0,09 центов за хорошо в рекомендованных нами разведения. Тем не менее, существуют ограничения на всех метаболических анализов; метаболическая активность может быть отсоединен от выживания, особенно во время некроза. Если это имеет значение, анализы в настоящем докладе могут быть объединены с измерениями лактата выпуска дегидрогеназы констатировать потерю целостности мембраны. Это не предполагает никаких дополнительных пластин, а измерения лактатдегидрогеназы просто сделаны во внеклеточной среде.

Хотя мы представляем этих анализов в качестве альтернативы ручной рассчитывает на микроскопом, последний может быть высокочувствительным и точным средством числа выборки клеток при правильном проводится. В самом деле, мы ожидаем, что подсчет Хехст окрашенных ядер бы быть более чувствительны к небольшим изменениям в N2A числа клеток, чем DRAQ5 + Sapphire анализа. Когда все анализы неудачу проверить линейность, ручного учета имеют важное значение. Хорошим примером этого является наш культурный основной моделью астроцитов, на котором мы проводим более трудоемкий ручной насчитывает 45. Тем не менее, присущие предубеждения ручных подсчетов следует иметь в виду, при интерпретации данных подсчета клеток, так же, как неотъемлемые недостатки компьютерных анализов не должна отмахнуться. Ряд сильных и слабых сторон жизнеспособности анализов поэтому описываются ниже.

Во-первых, если используются DAPI или Hoechst пятна, усохшие и сокращенная ядра часто обозначается какапоптоза 1. Тем не менее, размер ячейки и конденсация ядер лежат вдоль гладкой континуума. Напротив, жизнь и смерть являются взаимоисключающими, бинарные явления. Если не наблюдаются две очень разные группы живых или умирающих клеток, кажется, все возможное, чтобы посчитать все клетки ниже порогового ядерного диаметра как апоптоза с ПО для обработки изображений, такие как Метаморф или ImageJ, а не на глаз. Конечно, выбор для порогового диаметром является произвольным, поскольку мы не знаем, в какой момент начинается необратимый апоптоза каскад. Кроме того, по определению, даже клетки с активированным каспазы 3 не обязательно на пути к смерти и, возможно, следует считаться еще жив в момент фиксации 46. Наши инфракрасные анализы избежать таких проблем от лечения все клетки, которые прикреплены к пластине в момент фиксации, как до сих пор живут. Только клетки, которые уплыли считаются как мертв. Это ставит клетки в одном из двух различных категорий и избегает ловушек, используя сотрудничествоmplex, непрерывная функция, как ядерного диаметра.

Во-вторых, ручного учета обычно отведать малую часть всей скважины. Это может привести к предвзятости отбора проб и, при случае, высокие стандартные ошибки среднего значения. С нашими жизнеспособности анализов, вся скважина пробы для АТФ и близко ко всей скважины пробы с инфракрасными анализов. Эта модель выборки увеличивает размер выборки и избегает иногда произвольный решение о том, где в колодце, чтобы хватать фотографию для ручных подсчетов. Если фотографии взяты из центра колодца, надо иметь в виду, что это область, в которой от стиральной большинство клеток происходит, что приводит к завышению потенциальных токсичности. В отличие от этого, инфракрасные анализы бросить сетку на образе 96-луночный планшет, что только исключает крайние уголки скважин. При желании, углы скважин могут быть включены путем увеличения диаметра окружностей в сетке.

В-третьих, фотограф и клетка счетчик должен как быть ослеплены во время ручного подсчета. Однако, как только клетки обрабатывают токсинов, они часто думают, морфологические изменения, которые довольно очевидно даже для неопытного глаза. Это делает его гораздо более сложной задачей, чтобы оставаться беспристрастным. Слепота не является обязательным требованием для наших анализов.

В-четвертых, ручного учета отнимают много времени и стоить главного исследователя более в зарплате. Заработная плата является одним из самых высоких затрат на проведение исследований. Время сканирования для одной пластины на Odyssey находится всего в 8 мин долго на "среднего качества" настройки и может быть снижена дополнительно от настройки "низкого качества". Следует отметить, что Odyssey Imager стоит дорого, даже когда один покупает используемый демонстрационной версии, но это одноразовый фиксированной стоимости. С другой стороны, надо еще вкладывать деньги в относительно дорогих эпифлуоресцентной микроскопы для ручных мобильных пунктам DAPI-или Нoechst окрашенных ядер. Несмотря на первоначальную стоимость, Одиссея Imager является многоцелевой машины, что также измеряет западные иммуноблотах в количественном выражении 47,48. Мы адаптировали использование Одиссеи для количественными иммуноокрашивания в макроскопических структур мозга, таких как крысы или мыши стриатуме или конечного мозга коры. Этот подход был также использован другими 49. Одной из слабых сторон Odyssey Imager для работы с изображениями ткани является то, что высокое разрешение только 21 мкм. Поэтому она не может рассчитывать отдельные клетки и не предназначен для визуализации тоньше анатомические детали.

Наконец, инфракрасные анализы могут быть не столь чувствительны к небольшим изменениям количества клеток как ручных подсчетов. IC 50 величины, следовательно, не может рассматриваться как показывающий концентрацию, которое вызывает именно 50% потери количества клеток, но только в виде концентрации, которая вызывает 50%-ную потерю инфракрасного сигнала. Это предостережение, вероятно, относится квсе жизнеспособности анализы, что обойти отдельные количество клеток с помощью микроскопа и образцом весь колодец сразу. Неточность, связанная с таких анализов может быть функцией гипертрофии, атрофии или других изменений внешнего вида, которые влияют на силу сигнала. Например, при некоторых токсинов, α-тубулина иммунореактивность в каждой ячейке может возрасти в зависимости от токсичности. Мы наблюдали это явление в N2A клеток, обработанных с очень высокими концентрациями MG132 8. Если это вызывает беспокойство, другие цитоскелета маркерные белки, такие как β-актина или GAPDH может быть использован. Кроме того, подчеркнул N2A клетки имеют тенденцию к образованию биполярные процессы 8,50,51. С изменениями в размерах клеток, флуоресцентный выходной сигнал на ячейку будет также отличаться в разных группах. Мы рекомендуем токсина обработанных клеток рассматривается стандартной микроскопии высокого разрешения следующих иммуноцитохимии для тех же маркеров, которые использовались в В-клеточной западной. Если в цитоплазме значительно изменяется по размеру после обработки, ноядро не, мы рекомендуем использовать DRAQ5 пятно без Sapphire только количественно ядра. Будущие исследования с различными красителями и с другими цитоскелета или других богатых белками имеют гарантию для преодоления этих препятствий.

Мы пришли к выводу, что все анализы страдают от оговорками и выразили обеспокоенность по поводу чувствительности, линейности ошибки выборки, сигнал-шум, человеческий предвзятость или субъективность, время и стоимость. Кроме того, все анализы полагаться на предположениях, которые не всегда встречал. Таким образом, мы рекомендуем, чтобы по крайней мере два анализы быть использован для описания эффекты лечения на клеточных культурах, тот, который измеряет здоровье метаболизма и тот, который опирается на анатомической жизнеспособности. Таким образом, можно более эффективно установить, является ли терапевтические соединения защиты как структуры и функции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ни один из авторов не имеют никаких конфликтов раскрывать.

Acknowledgments

Мы признаем Juliann Жомотт за идею экономии на объемах реагентов в анализе АТФ. Мы глубоко признательны за превосходным административной поддержки Марии Карузо, Деб Вилсона, и Джеки Фаррер и к Mylan Школа фармации для оказания финансовой поддержки для этих исследований. Мы также выражаем благодарность к Hunkele страшных заболеваний Foundation и Паркинсона и двигательных расстройств Фонд за их финансовую поддержку из первичных нейронов исследований.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Titer Glo Promega G7572 Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin Thermo-Shandon 9990244 Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block LI-COR 927-40003 This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100 Sigma-Aldrich 21568 We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic Fisher S468 One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic Fisher S373 See above
Sodium Azide (250x) Ricca Chemical Company 7144.8-16 Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin Sigma-Aldrich T5168 This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2 Sigma-Aldrich M9942 This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG LI-COR 926-32210 Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5 Biostatus DR50200 This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire LI-COR 928-40022
Luminometer PerkinElmer VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager LI-COR 9201-01
Shaker/Mixer Research Products International 248555

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
  2. Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G. Effects of GDNF on 6-OHDA-induced death in a dopaminergic cell line: modulation by inhibitors of PI3 kinase. J. Neurosci. 73, 105-112 (2003).
  3. Patonay, G., Antoine, M. Near-infrared fluorogenic labels: new approach to an old problem. Anal. Chem. 63, (1991).
  4. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 deficiency in astrocytes selectively enhances mitochondrial Complex I inhibitor-induced neurotoxicity. J. Neurochem. 117, 375-387 (2011).
  5. Egorina, E. M., Sovershaev, M. A., Osterud, B. In-cell Western assay: a new approach to visualize tissue factor in human monocytes. J. Thromb. Haemost. 4, 614-620 (2006).
  6. Aguilar, H. N., Zielnik, B., Tracey, C. N., Mitchell, B. F. Quantification of rapid Myosin regulatory light chain phosphorylation using high-throughput in-cell Western assays: comparison to Western immunoblots. PLoS One. 5, (2010).
  7. Jinwal, U. K., Dickey, C. A. Cell-based assays for regulators of tau biology. Methods Mol. Biol. 670, 93-108 (2011).
  8. Unnithan, A. S., Choi, H. J., Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Rescue from a two hit, high-throughput model of neurodegeneration with N-acetyl cysteine. Neurochem. Int. 61, 356-368 (2012).
  9. Hoskins, C., Wang, L., Cheng, W. P., Cuschieri, A. Dilemmas in the reliable estimation of the in-vitro cell viability in magnetic nanoparticle engineering: which tests and what protocols? Nanoscale Res. Lett.. 7, 10-1186 (2012).
  10. Essner, M. D., Javed, A., Eleazer, P. D. Effect of sodium hypochlorite on human pulp cells: an in vitro study. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 112, 662-666 (2011).
  11. Sims, J. T., Plattner, R. MTT assays cannot be utilized to study the effects of STI571/Gleevec on the viability of solid tumor cell lines. Cancer Chemother. Pharmacol. 64, 629-633 (2009).
  12. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  13. Womac, A. D., Burkeen, J. F., Neuendorff, N., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Circadian rhythms of extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus cells and cultured astrocytes. Eur. J. Neurosci. 30, 869-876 (2009).
  14. Ataullakhanov, F. I., Vitvitsky, V. M. What determines the intracellular ATP concentration. Biosci. Rep. 22, 501-511 (2002).
  15. Iglehart, J. D., Silver, D. P. Synthetic lethality--a new direction in cancer-drug development. New Engl. J. Med. 361, 189-191 (2009).
  16. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Methods. 160, 81-88 (1993).
  17. Kangas, L., Gronroos, M., Nieminen, A. L. Bioluminescence of cellular ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. Med. Biol. 62, 338-343 (1984).
  18. Lundin, A., Hasenson, M., Persson, J., Pousette, A. Estimation of biomass in growing cell lines by adenosine triphosphate assay. Methods Enzymol. 133, 27-42 (1986).
  19. Sevin, B. U., et al. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol. Oncol. 31, 191-204 (1988).
  20. Maehara, Y., Anai, H., Tamada, R., Sugimachi, K. The ATP assay is more sensitive than the succinate dehydrogenase inhibition test for predicting cell viability. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 23, 273-276 (1987).
  21. Andreotti, P. E., et al. Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Res. 55, 5276-5282 (1995).
  22. Posimo, J. M., Titler, A. M., Choi, H. J., Unnithan, A. S., Leak, R. K. Neocortex and allocortex respond differentially to cellular stress in vitro and aging in vivo. PLoS One. 8, (2013).
  23. Carralot, J. P., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28, 261-268 (2012).
  24. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
  25. Oliver, D. G., Sanders, A. H., Hogg, R. D., Hellman, J. W. Thermal gradients in microtitration plates. Effects on enzyme-linked immunoassay. J. Immunol. Methods. 42, 195-201 (1981).
  26. Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS One. 6, (2011).
  27. Bayer, S. A., Altman, J. Neocortical Development. , Raven Press. (1991).
  28. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54, 357-369 (2007).
  29. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 knock-down in astrocytes impairs astrocyte-mediated neuroprotection against rotenone. Neurobiol. Dis. 33, 28-36 (2009).
  30. Jiang, Y., et al. N-Acetyl cysteine blunts proteotoxicity in a heat shock protein-dependent manner. Neuroscience. 255, 19-32 (1016).
  31. Madeira, A., et al. Caveolin-1 interacts with alpha-synuclein and mediates toxic actions of cellular alpha-synuclein overexpression. Neurochem. Int. 59, 280-289 (2011).
  32. Fioriti, L., et al. Cytosolic prion protein (PrP) is not toxic in N2a cells and primary neurons expressing pathogenic PrP mutations. J. Biol. Chem. 280, 11320-11328 (2005).
  33. Zhang, L., et al. Proteasome inhibition modulates kinase activation in neural cells: relevance to ubiquitination, ribosomes, and survival. J. Neurosci. Res. 87, 3231-3238 (2009).
  34. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 24, 197-211 (2003).
  35. Stranahan, A. M., Mattson, M. P. Selective Vulnerability of Neurons in Layer II of the Entorhinal Cortex during Aging and Alzheimer's Disease. Neural Plast. 2010, (2010).
  36. Duyckaerts, C., Delatour, B., Potier, M. C. Classification and basic pathology of Alzheimer disease. Acta Neuropathol. 118, 5-36 (2009).
  37. Chu, C. C., Tranel, D., Damasio, A. R., Van Hoesen, G. W. The autonomic-related cortex: pathology in Alzheimer's disease. Cereb. Cortex. 7, 86-95 (1997).
  38. Braak, H., Del Tredici, K., Bohl, J., Bratzke, H., Braak, E. Pathological changes in the parahippocampal region in select non-Alzheimer's dementias. Ann. N.Y. Acad. Sci. 911, 221-239 (2000).
  39. Braak, H., Rub, U., Schultz, C., Del Tredici, K. Vulnerability of cortical neurons to Alzheimer's and Parkinson's diseases. J. Alzheimers Dis. 9, 35-44 (2006).
  40. Calabrese, E. J. Hormesis is central to toxicology, pharmacology and risk assessment. Hum. Exp. Toxicol. 29, 249-261 (2010).
  41. Giordano, J., Ives, J. A., Jonas, W. B. Hormetic responses in neural systems: consideration, contexts, and caveats. Crit. Rev. Toxicol. 38, 623-627 (2008).
  42. Mattson, M. P. Hormesis defined. Ageing Res. Rev.. 7, 1-7 (2008).
  43. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, (2010).
  44. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  45. Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Astrocyte plasticity revealed by adaptations to severe proteotoxic stress. Cell Tissue Res. , (2013).
  46. McLaughlin, B., et al. Caspase 3 activation is essential for neuroprotection in preconditioning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 715-720 (2003).
  47. Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol. Biol. 536, 499-513 (2009).
  48. Picariello, L., et al. A comparison of methods for the analysis of low abundance proteins in desmoid tumor cells. Anal. Biochem. 354, 205-212 (2006).
  49. Tapias, V., Cannon, J. R., Greenamyre, J. T. Melatonin treatment potentiates neurodegeneration in a rat rotenone Parkinson's disease model. J. Neurosci. Res. 88, 420-427 (2010).
  50. Fenteany, G., Schreiber, S. L. Specific inhibition of the chymotrypsin-like activity of the proteasome induces a bipolar morphology in neuroblastoma cells. Chem. Biol. 3, 905-912 (1996).
  51. Omura, S., et al. Lactacystin, a novel microbial metabolite, induces neuritogenesis of neuroblastoma cells. J. Antibiot. 44, 113-116 (1991).

Tags

Клеточная биология выпуск 83 В-клетки Западная DRAQ5 Сапфир сотовый Титр Glo АТФ первичные нейроны коры токсичность защита N-ацетил цистеин гормезис
Жизнеспособность Анализы на клетки в культуре
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Posimo, J. M., Unnithan, A. S.,… More

Posimo, J. M., Unnithan, A. S., Gleixner, A. M., Choi, H. J., Jiang, Y., Pulugulla, S. H., Leak, R. K. Viability Assays for Cells in Culture. J. Vis. Exp. (83), e50645, doi:10.3791/50645 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter