Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bärkraft: Analyser för celler i odling

Published: January 20, 2014 doi: 10.3791/50645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Pharmaceutical Sciences, Mylan School of Pharmacy, Duquesne University

Summary

Terapeutiska föreningar är ofta först undersökas in vitro med lönsamhetsanalyser. Blind celltal av en mänsklig observatör kan vara mycket känsliga för små förändringar i antalet celler men inte bedöma funktion. Datorise viabilitet analyser, som beskrivs här, kan bedöma både struktur och funktion på ett objektivt sätt.

Abstract

Manuella kroppar på ett mikroskop är ett känsligt sätt att bedöma cellulär viabilitet, men är tidskrävande och därför dyra. Datoriselönsamhetsanalyser är dyrt i form av utrustning, men kan vara snabbare och mer objektiv än manuella kroppar. Den här rapporten beskriver användningen av tre sådana lönsamhetsanalyser. Två av dessa analyser är infrarött och en är luminiscerande. Båda IR-analyser är beroende av en 16 bitars Odyssey Imager. En infraröd analys använder DRAQ5 fläcken för kärnor kombinerat med Sapphire fläcken för cytosolen och visualiseras i 700 nm-kanalen. Den andra IR-analysen, en in-Cell Västra använder antikroppar mot cytoskelettproteiner (α-tubulin eller mikrotubuli associerat protein 2) och märker dem i 800 nm-kanalen. Den tredje analys livskraft är en vanligt förekommande självlysande analys för ATP, men vi använder en fjärdedel av den rekommenderade volymen för att spara på kostnader. Dessa mätningar är alla linjära och korrelerar med antalet cells klädd, men varierar i känslighet. Alla tre analyser kringgå tidskrävande mikroskopi och prova hela väl och därmed minska urvalsfel. Slutligen kan alla analyserna lätt vara slutförd inom en dag i slutet av försöket, vilket gör att ett större antal experiment som ska utföras inom korta tidsramar. Men de har alla förlitar sig på antagandet att antalet celler förblir i proportion till signalstyrka efter behandlingar, ett antagande som ibland inte är uppfyllt, i synnerhet för cellulär ATP. Vidare, om celler ökar eller minskar i storlek efter behandling, kan detta påverka signalstyrkan utan att påverka cellantal. Vi drar slutsatsen att alla lönsamhetsanalyser, inklusive manuella räkningar, lider av ett antal förbehåll, men att datoriserade lönsamhetsanalyser är väl värda den ursprungliga investeringen. Använda alla tre analyser tillsammans ger en heltäckande bild av cellstruktur och funktion.

Introduction

Den vanligaste viabilitetsanalys i de biologiska vetenskaperna innebär kroppar. Detta framgår av en analys av de bästa (senaste) 200 publikationer som dök upp i PubMed med något av sökorden "in vitro" eller "kultur" på 2013/04/29 och 2013/04/30. Av dessa publikationer, 23,5% används analyser celltals, inklusive manuella cellnummer räknas, automatiserad cellnummer räknar med bildbehandlingsprogram, och trypanblåttuteslutning. Live / Dead analys användes i en% av dessa publikationer. Det antal publikationer med hjälp av MTT-(3 - (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid)-analysen för metabolisk livsduglighet var 11%. Denna genomgång av litteraturen visar också att antalet publikationer med hjälp analyser såsom MTT tillsammans med celltalsanalyser var endast 3,5%. Trots trenden att använda en livskraft analys av sig själv, bedöma cellulär funktion i kombination med cellnummer verkar det bästa valet för att bedöma cellulära integrity. Celltal i sig själva inte är tillräckliga, eftersom de återstående cellerna inte kan vara funktionell eller friska trots att de är närvarande i väl 1,2. Omvänt kan funktionella åtgärder såsom ATP ökar eller minskar i avsaknad av parallella förändringar i antalet celler. Den frikoppling av metabola avläsning från antalet celler tyder på att ATP-och MTT-analyser bör aldrig användas som enda livskraft analysen. I denna rapport är tre lönsamhetsanalyser som kart både cellulära strukturer och metabolisk funktion beskrivs, för en mer heltäckande bild av cellulära integritet än någon analys i sig har råd med.

Två av våra analyser kräver en infraröd kameran som mäter fluorescens i de 700 och 800 nm kanaler. Buller är låg i de infraröda våglängder, vilket leder till högre signal-till-brus-förhållanden 3. Odyssey Imager som vi använder har en 4,5 log dynamiskt omfång och lite djup av 16, translating till 2 16 eller 65.536 nyanser av infrarött. Detta kan ställas i kontrast till 8-bitars färgavbildning, vilket bara ger 2 8 eller 256 färgnyanser för varje våglängd. Därmed har 16-bitars bildbehandling bättre upplösning. Det bör noteras att de ursprungliga värmebilder är ofta pseudocolored grön (800 nm) och röda (700 nm) i publicerade rapporter för presentation. Odyssey kameror används ofta både för Western blotting och I-Cell Westerns 4-7. I-cell Westerns på formaldehydfixerade celler använder primära antikroppar mot något protein av intresse och märka dem i tur och ordning med infraröd fluorescerande sekundära antikroppar. Denna teknik är känd för att vara särskilt användbart för fosforylering endpoints 6. I vår I-Cell Westerns, vi färga fixerade celler för cytoskelettproteiner α-tubulin eller neuronala mikrotubuli associerat protein 2 (MAP2) i 800 nm-kanalen. Dessa proteiner är tillräckligt omfattande för att ge en hög signal-till-brus-förhållanden. Vi fläckar också våra tallrikar i 700nm-kanal för kärnor med DRAQ5 fläcken och för cytoplasman med Sapphire fläcken. Både cytoskelettproteiner och DRAQ5 + Sapphire fläckar speglar alltså cellstrukturer.

Den tredje analys livskraft mäter metabolisk funktion och kallas "Cell Titer Glo." I denna luciferas-baserad analys, luminiscens värden är i direkt proportion till ATP-nivåer. ATP-analyser används allmänt för att kvantifiera livskraftiga celler 8-12. Men även ordet "titer" i namn av analysen är något av en missvisande eftersom ATP produktionen per cell kan förändras som en funktion av toxinbehandlingar och är därför inte alltid i proportion till cell nummer 8. ATP-nivåer kan också påverkas av dygnsrytmen 13 och genom celldelning 14 och celldifferentiering 15. Ändå är den ATP-analys visas här enkelt att utföra och användbara eftersom ATP är en robust mått på metabolisklivskraft 16-21, om inte antalet celler i sig. Med hjälp av denna analys för att komplettera den infraröda I-Cell Westerns ger därför en mer heltäckande bild av cellulära integritet än någon analys ensam.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ett schema över de protokoll som illustreras i figur 1.

1. Cell Plating

Plate celler i 96-brunnsplattor vid olika pläterings densiteter (figur 2). För linjäritet kontroller av N2a neuroblastomcellinje, tallrik 2.5k, 5k, 10k och 15k celler per brunn i 3 eller 6 brunnar / grupp. För linjäritet kontroller i råtta primära kortikala neuroner, platta 25k, 50k, 100k och 200k celler per brunn i 3 eller 6 brunnar / grupp. Om de cellinjer eller primära celler av intresse se friska vid olika pläterings densiteter, platta vid och i närheten av den optimala celldensiteten för denna celltyp.

OBS: I den aktuella studien, var N2A celler pläterade i 100 pl medier och primära kortikala neuroner i 200 l media på plåtar som är utformade för lägre avdunstning. För detaljerad information om cellhantering, media, sera, antibiotika, och toxinbehandlingar, se Unnithan et al. för N2a cells 8 och Posimo et al. för primära cortex kulturer 22.

    1. Upprepa plätering på en andra 96-brunnars platta. En platta kommer att analyseras med avseende på ATP (Figur 2A) och den andra med de infraröda analyser (Figur 2B). Man kan inte använda samma plattan för ATP-och IR-analyser eftersom cellerna måste lyseras öppen för intracellulära ATP-mätningar.
    2. Se till att plattan minst 3 extra brunnar för bakgrundssubtraktion i de infraröda analyser vid den optimala plätering densitet (kolumn 2, Figur 2B).
  2. Lägg till media utan celler eller, mer billigt, sterilt vatten till de yttre brunnar i raderna A och H och i kolumnerna 1 och 12. Undvik att förlita sig på data från brunnar längs kanterna, eftersom lönsamheten är ofta lägre här från effekterna av media avdunstning och temperaturgradienter. Sådana problem med mikroplattor kallas ofta kanteffekter 23,24. Förvara inte dessa brunnar tomför då raderna B och G och kolumnerna 2 och 11 lider av kanteffekten.
    Kanteffekter kan minskas genom att inkubera en nyligen seedade plattan vid rumstemperatur i omgivningsförhållanden innan överföring till CO2 inkubator 24. Dessutom en färsk undersökning från Carralot beskriver en matematisk korrigeringsmetod för mikrotiterplattor med en enda styrkolonn 23. Oliver och kollegor använde en specialdesignad varmluft mikrotitreringsplatta inkubator för att minska termiska gradienter 25. Om kanteffekten är av betydande oro, kan mikro stabilitet kammare (t.ex. BT & C Incorporated) köpas för att skapa en homogen mikromiljö med hög luftfuktighet och även temperaturgradienter.
  3. Om det behövs fler brunnar än vad som visas i figur 1 eftersom ytterligare reagensspädningar eller fler plätering densiteter kommer att testas, använd kant brunnar för bakgrunds subtraktion.
  4. Vänta över natten för fastsättningav celler och analys nästa morgon som beskrivs nedan.

2. Självlysande ATP-analys

  1. Följ Cell Titer Glo tillverkarens rekommendationer för beredning av substratet med buffert och för inkubationstider.
    1. Ta bort 50 eller 150 l media från de 100 eller 200 l av plätering media, respektive. Något mindre än 50 ^ kommer att stanna kvar i brunnen. Tillsätt 25 l av reagenserna (substrat plus buffert) till kolumnerna 2-6 (Figur 2A) i en spädning 1:2.
      OBS: Varierande volymer av media kvar efter borttagning kan späda ut eller koncentrera ATP analysreagensen differentiellt över brunnar. Var noga med att säkerställa att vätskenivån i alla de flerkana pipettspetsar är likvärdig. Mät den återstående vätskan i utvalda brunnar över hela plattan med en pipett omedelbart innan du lägger till ATP-analysreagens för att säkerställa noggrannheten. Om hög variabilitet finns från differentierade medie Förångartemperaturation över ytan av plattan, och ta bort alla gamla medier och tillsätt samma volym av färskt medium eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till alla brunnar omedelbart före tillsats av ATP-analysreagens. Om plattorna lider variabla nivåer av avdunstning, prova att byta till de låga avdunstnings plattor från Costar Corning. I de senare plattorna, de 60 invändiga brunnar som visas i figur 2 bara lider från ett genomsnitt på 0,995% ± 0,41 medier indunstning över natten. Det finns således försumbar variation i medievolymen vid tidpunkten för analysen.
    2. I kolumnerna 7 till 11, raderna B till D, ta bort tillräckligt med media för att lämna 50 l bakom, enligt ovan, och tillsätt 50 l av reagens i en 1:1 spädning.
    3. I kolumnerna 7 genom 11, raderna E till G, lämna cellerna i 100 | il medium och tillsätt 100 | il av reagens, återigen i en 1:01 spädning. Företaget rekommenderar att 100 | il av reagens bör spädas 1:01 i 100 | il medium.
      OBS: Förför att spara på kostnader, är det möjligt att skära dessa rekommendationer, både i volym och i utspädning. Men innan du gör detta, se till att den inte minskar linjäritet och analysens känslighet.
    4. När en specifik volym och utspädningsfaktor av reagensen har befunnits vara tillfredsställande, hålla fast dem i alla efterföljande experiment. Kriterierna för tillfredsställande information finns i avsnittet Resultat.
    5. Oanvända rekonstituerade reagenser kan frysas och användas vid ett senare tillfälle för att spara på kostnader. Enligt tillverkaren kan rekonstituerade reagenserna lagras vid -20 ° C under 21 veckor med ~ 3% förlust av aktivitet.
  2. Placera plattan på en orbital shaker i 2 min eller en nuterande skakanordning under 10 min. Om en del av plattan som analyseras för en annan mätning och det kan inte skakas, agitera media med enkla upp-och-ner pipettering endast i brunnarna av intresse. Dock kommer alltför stora bubblor som genereras under detta steg störa luminescent utgång.
    1. 10 min efter tillsatsen av reagensen, överför 60 | il av de väl innehållet i vita 96-brunnars plattor. Luminiscens värden är högre i vita plattor än i klara eller svarta plattor eftersom de reflekterar ljus uppåt mot detektorn.
      Anmärkning: Enligt vår erfarenhet celler överlever bättre på låg avdunstning, tydliga Costar-plattor än andra plattor. Dessa speciella plattor säljs inte med vita väggar. För det andra, de ogenomskinliga väggar och tydliga bottnade plattor är dyrare än fullständigt tydliga skyltar. Om man överför självlysande vätska till vita plattor, kan de vita plattorna tvättas och återanvändas, vilket sparar på kostnaden för att använda nya vita plattor för varje experiment. Överföra vätskan är sålunda billigare alternativ i det långa loppet.
    2. Pop eventuella luftbubblor före avläsning av plattan med en nål eller företrädesvis med varmluft från en plast överföringspipett glödlampa. Läs plattan på en luminometer med 1 sek integrationstid (företaget recommends 0.25-1 sek som tillräcklig integration tid). Läs plattan 10 till 12 min efter tillsats av ATP-analysreagens. Timing är kritisk för jämförelse mellan olika plåtar, eftersom luminescerande signalen är övergående med en snabb dämpfaktorn, såsom visas av Gilbert och kollegor 26.
  3. Medelvärdes de luminiscerande värden från tre eller sex brunnar i varje grupp och tomt som en funktion av antalet celler i ett spridningsdiagram (se figur 3). Först subtrahera de genomsnittliga bakgrunds luminiscens värdena för de lämpliga tomma brunnar (brunnar 2B - 2G, brunnar 11B - 11D, och brunnar 11E - 11G) från varje motsvarande datapunkt. Det kommer att finnas tre olika grupper för varje plätering densitet i detta initiala experiment (Figur 2A). ATP-nivåer kan vara linjärt korrelerad med celldensiteter i en eller alla av dessa grupper. Fortsätt med den högsta utspädningen av reagens som fortfarande ger tillfredsställande resultat för att spara in på kostnader. Kriterier för tillfredsställande resultat finns beskrivna in sektionen Resultat.
    Notera: Med de medier som används i den aktuella studien, bakgrundsvärden med denna analys är inte hög och det är möjligt att hoppa över de tomma brunnarna. Men tillverkaren Promega redovisar skillnader i luminiscens med olika odlingsmedier. Föreliggande studie använder Hyclone Fetal Clone III, en syntetisk version av fetalt bovint serum för N2A-celler och bovint kalvserum för primära kortikala kulturer. Enligt tillverkaren, kalvserum minskar luminiscens värden men inte minskar känsligheten hos analysen. Men om detta är av stort intresse, späd ATP-analysreagens i PBS i stället för medierna vid tidpunkten för analysen.
    1. Om cellerna tycks växa ojämnt över kolumner natten, försöka analysera dem inom 6 timmar av bordläggningen. Men ha i åtanke att densiteten vid den vanliga tiden för analys (t.ex. 24 timmar efter behandlingen) är densiteten vid vilken linjäritet måste uppnås.

3. Infrared Analyser

  1. Morgonen efter plätering, fixera cellerna i den andra plattan vid rumstemperatur i ett dragskåp. Var noga med att använda handskar för detta steg och göra sig av med fixativ som kemiskt avfall eftersom formaldehyd är cancerframkallande. Lägg 4% formaldehyd och 4% sackaros i 0,1 M fosfatbuffert till den befintliga medier i en 1:01 spädning. Medierna kan också tvättas bort med PBS innan det fastställs i full styrka fixativ. Antingen tekniken fungerar bra.
    1. Inkubera i fixativ i 20 minuter och ta sedan bort fixativ och tvätta 3x i 200 l PBS.
  2. Förvara plattan i PBS med 0,2% natriumazid vid 4 ° C om analysen inte kommer att ske på samma dag. I annat fall gå vidare med analysen och placera cellerna i blockerande lösningen för att minimera icke-specifik bindning av antikroppar.
    1. Späd fisken serum Odyssey blockera 1:01 i PBS och tillsätt 0,3% Triton-X 100 som en cell permeabiliseraren. Gör nog blockerande lösningen samt primär och sekundär Antibody lösningar, så att 35 pl kan pipetterades i varje brunn. Om emellertid en massa bubblor observeras under pipettering, göra> 50 ul för varje brunn, i annat fall bubblorna når ner i cellerna och blockera antikroppar från bindning. Överdriven soapy bubblor kommer att visas som en ofärgade cirkulär fläck i mitten av brunnen. Försök att justera pipettering om detta inträffar.
    2. Inkubera i denna blockeringslösning under 30-60 min vid rumstemperatur.
      OBS: 5% bovint serumalbumin eller normal serum från samma art som den sekundära antikroppen kan också användas som blockerar lösningar för att spara på kostnaderna för fiskserumblocket. Blockering lösningar kan påverka prestandan av antikroppen. Sålunda är den optimala blocket för varje antikropp bestämmes bäst empiriskt.
      Obs: Vissa utredare placera I-Cell västerländska plattor på shakers under inkubation. Detta är dock inte nödvändigt.
  3. Gör de primära antikroppar: 1:10.000 utspädning av anti-α-tubulin(Monoklonal, tabell 1) och 1:2000 utspädning för anti-MAP2 (musmonoklonal, Tabell 1). Dessa antikroppar är specifika för proteinerna av intresse i dessa cellulära modeller; specificitet är viktigt för alla immunocytokemisk färgning.
    OBS: MAP2 är en markör för neuroner och är lämplig för blandade neuronala / gliaceller kulturer. De postnatal kulturer som visas här innehåller också några glia (~ 25%) eftersom astrocyter visas först på embryonala dag 18, med sina siffror topp i den tidiga neonatala perioden 27,28. Man kan inte skilja mellan astrocyter och nervceller i ATP och DRAQ5 + Sapphire analyser. För att mäta neuroner och astrocyter separat, använda samtidig MAP2 och GFAP-färgning i 800 och 700 nm-kanaler, såsom beskrivits av Mullett och kollegor 4,29 och utelämna DRAQ5 + Sapphire. Men om alla celler i kulturen vill bedömas, använd en pan-cellulär markör såsom α-tubulin, β-aktin eller GAPDH.
    Anm: Dessa späd har optimerats för N2a och primära kortikala celler och kan inte generalisera till varje modell. Försök därför minst två primära antikroppsspädningar, en på den vänstra halvan av plattan och en på den högra halvan (se Figur 2B). Alternativt prova 3-4 utspädningar av primära antikroppar på 3 brunnar vardera. Till exempel kan den rekommenderade utspädning på antikroppen insatsarket vara flankerad med två-faldiga förändringar. Med andra ord, om den rekommenderade utspädning för immuncytokemi är 1:500, också prova 1:250 och 1:1000 utspädningsfaktorer.
    1. Späd antikroppar i 1:1 Odyssey block: PBS och tillsätt 0,3% Triton-X. För att spara på kostnader, prova att göra antikropparna i den blockerande lösning som applicerades till cellerna i steg 3.2.1 genom att ta bort denna lösning i slutet av inkubationstiden. Förvara cellerna i PBS medan du gör detta, de får inte torka ut.
    2. Inkubera i primära antikroppar antingen 1-2 timmar i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C. För svagt bINDANDE antikroppar och proteiner som inte är riklig, kan natten inkubationer bidra till att öka signal.
      OBS: Lämna minst 3 brunnar i blockerande lösningen för bakgrundssubtraktion vid varje sekundär antikroppskoncentration (brunnar 2B-2D och brunnar 2E-2G i Figur 2B). Utsätt inte dessa brunnar till någon primär antikropp som helst. De avslöjar omfattningen av icke-specifik bindning av den sekundära antikroppen och är användbara för beräkning av signal-till-brus-förhållanden. Om det finns en oro för att de sekundära antikropparna kommer att leda till höga halter av icke-specifik bindning, omfattar även kontrollbrunnar som inte utsätts för antingen primär eller sekundär antikropp, men får samma antal tvättar. Skillnaden mellan dessa brunnar och de "sekundära endast" brunnar kommer att avslöja omfattningen av icke-specifik bindning orsakad av sekundär antikropp enbart. I vårt test på mus-N2A-celler, signalintensitet med anti-mus sekundär antikropp enbart var 0,557 ± 0,032, signal med anti-kanin-sekundär antikropp var 0,533 ± 0,041, signalerar utan sekundär antikropp 0,357 ± 0,003, och signalen med primära och sekundära antikroppar var 11,867 ± 0.911. Vi har alltså inte observerat höga nivåer av icke-specifik bindning, även vid användning av anti-mus sekundära antikroppar på musceller. Det finns flera tillverkare har för infraröd sekundära antikroppar, vi rekommenderar bara köpa mycket tvär adsorberade sådana. Notera att koncentrationen av sekundära IgG-antikroppar kan variera beroende på källan.
  4. Tvätta primära antikroppar med 3 tvättar med 200 l PBS per brunn, 10 min vardera. Primära antikroppar kan sparas vid 4 ° C under några veckor i 0,2% natriumazid och återanvändas tills små smutsfläckar blir uppenbart när lösningarna hålls upp i ljuset. Detta görs endast för att spara på kostnader. Om kostnaden inte är ett problem, göra nya antikroppar för varje användning.
  5. Späd den sekundära antikroppen med 1:1000 eller 1:2000 i 1:1 Odyssey block: PBS med 0,3% Triton-X (Figur 2B). Till 1:1000 spädning till den övre halvan av plattan och 1:2000 till den nedre halvan av plattan. Dessa koncentrationer kan minskas ytterligare för att spara på kostnader, men kontrollera för linjäritet innan till detta.
    OBS: Se till att lägga till en lämplig sekundär antikropp lösning på bakgrundssubtraktion brunnar (kolumn 2 i figur 2B).
    1. Om en andra protein kommer att analyseras i stället för DRAQ5 + Sapphire, etikett celler för α-tubulin eller MAP2 med 700 nm get anti-mus IgG och den andra protein i 800 nm-kanal med primära antikroppar från en annan än mus arter. De 800 nm-kanalen har mindre bakgrund än 700 nm kanalen och bör reserveras för de mest kritiska proteinet av intresse.
    2. Inkubera i sekundära antikroppar under 1 h vid rumstemperatur i en låda borta från ljus.
  6. Tvätta sekundära antikroppar med 3 tvättar med 200 l PBS per brunn, 10 min vardera.
  7. Gör DRAQ5 + Sapphire lösningar. För den vänstra halvan av tallriken, späd DRAQ5 1:10,000 (0,5 mikroM slutlig koncentration) och Sapphire 1:1000 i PBS med 0,3% Triton-X (kolumnerna 3-6, Figur 2B). För den högra halvan av tallriken, späd DRAQ5 1:20.000 (0,25 M) och Sapphire 1:2000 (kolumnerna 7-10, Figur 2B).
    OBS: DRAQ5 brukade säljas till ett 1 mM lager i stället för en 5 mM lager. Några tidigare publicerade rapporter används därför 1:4,000 eller 1:2000 spädningar av DRAQ5 8.
    1. För att spara på kostnader, om två plattorna som analyseras samtidigt, kan samma DRAQ5 + Sapphire lösningar användas på två plattor i följd, pipettera bort den första plattan och lägga till det i det andra. Om samma lösningar kommer att användas två gånger på detta sätt använda dem inom en dag. DRAQ5 Utspädd + Sapphire-lösningar kan inte sparas vid 4 ° C eller frysas för senare användning.
    2. Inkubera i dessa lösningar i 30 minuter i rumstemperatur borta from ljus. Om tiden är knapp och DRAQ5 + Sapphire lösningar kommer inte att återanvändas på andra plattor med olika secondaries, lägga till dessa fläckar på de sekundära antikroppslösningar i steg 3,5 och inkubera i 1 timme.
      OBS: Lägg inte till DRAQ5 + Sapphire lösning på bakgrundssubtraktion brunnar (kolumn 2 i figur 2B) som dessa brunnar inte ska färgas i 700 nm-kanalen.
  8. Tvätta plattan 3 x med 200 | il PBS per brunn under 10 min vardera. Sätt 0,2% natriumazid i den slutliga PBS-tvätt om plattan kommer att färgas med andra synlig-range sekundära antikroppar efter infraröd avbildning är klar.
  9. Skanna plattan på en Odyssey Imager. Börja med att skanna plattorna vid intensitet 5 och 169 mm upplösning. Antingen "medelkvalitet" eller "låg kvalitet" inställningar är tillräckliga. Företaget befriar inte detaljerad excitation / emission filter informationen. Men utsläppsfilter är cirka 20 nm bred och är centrerade kring 720 och 820 nm, enligt tillverkaren.
    OBS: Det är möjligt att skanna plåtar samtidigt våt som utredarna kan vilja fortsätta att färga dem med andra markörer. Tyder dock bolaget i sin online-protokoll som torra plattor resulterar i mindre väl-till-bra signal sprids. Om du skannar dem både våt och torka sedan jämföra data, se till att ta bort alla PBS från brunnen eftersom kvarvarande salter efter avdunstning kan leda till hög bakgrundsfluorescens längs kanterna.
    1. The Odyssey Imager skannar upp och genom botten av plattan. Tallrikar från olika tillverkare kan kräva olika fokusförskjutningar eftersom botten av brunnarna kan variera i tjocklek och djup i plattan. Försök skanna med olika fokusförskjutningar och se var den högsta signal-till-brus-förhållande och crispest (mest i fokus) signal uppnås: 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 mm. Försök även att mäta djupet av brunnen från botten av en platta med en linjal för att bekräfta Findings på Odyssey. Kom ihåg att den plast i botten av brunnen kan lägga till ytterligare höjd till linjalmåtten. De Costar plattor som används i föreliggande studie kräver fokus förskjutning på 4,0 mm.
    2. Använd I-Cell Västra funktion i programvaran för att placera den rätt storlek rutnät på bilden av plattan och exportera data till Microsoft Excel. Undersök "integrerade intensitets" värden av samma brunnar över olika fokusförskjutningar för att hitta de högsta fluorescensvärden. Fokus offset som ger den högsta signal-till-brus-förhållande (signal i immun brunnar kontra "inga primära negativa kontroll" brunnar) är det en att välja nedan.
    3. När ett fokus offset beslutas, scanna igen i mindre steg. Till exempel, om den ljussignalen var vid 3,5 och 4,0 mm, prova avsökning vid 3,6, 3,7, 3,8 och 3,9 mm och se om det finns någon ytterligare förbättring av signalstyrkan. Om fokus skillnad är fel, signalintensiteter över de 12 kolumner på en tom plåt (när alla kolumner ska ha samma signal) visas som en U-formad kurva istället för en rak linje. Om detta fortsätter att vara ett problem med plastplattor, prova glasbottnade plattor.
  10. Subtrahera medelvärdet av de integrerade intensiteterna i bakgrunden subtraktion brunnar (Figur 2B, brunnar 2B - 2D eller brunnar 2E - 2G) från varje motsvarande datapunkt på 700 och 800 nm kanaler. Genomsnitt sedan de integrerade signalintensiteterna för varje grupp av brunnar. Plotta data som ett spridningsdiagram mot celldensitet (se figur 3).
    1. Jämför resultaten från de två olika spädningar av primära och sekundära antikroppar och resultaten från de två olika spädningar av DRAQ5 + Sapphire att bosätta sig på en utspädning vardera för efterföljande experiment. Om linjäritet inte uppnås, prova skanning med olika intensitet. Scanna med intensiteterna 3 och 7 i stället för 5 och en ny analys av data. Om data förbättras på ett av dessa intensiteter menär fortfarande inte tillfredsställande, skanna i steg runt den intensitet.
    2. Var noga med att inte analysera bilder där programvaran visar vita fläckar i brunnarna, dessa fläckar beteckna mättad signal utanför området för kameran. Scan vid en lägre intensitet om detta inträffar.
    3. Om linjäritet inte uppnås, försök även att fixera cellerna inom 6 timmar av bordläggning eftersom de kan växa eller dö ojämnt i olika kolumner natten. Prova också olika bordläggningen densiteter, olika scannings intensiteter, ytterligare optimeringar av reagensutspädningsfaktorer, glasbottnade plattor, DRAQ5 av sig själv som en kärna endast fläck eller andra än anti-α-tubulin eller anti-MAP2 olika antikroppar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den hastighetsbegränsande faktorn i dessa experiment är den infraröda färgning, såsom ATP-analysen är relativt kort varaktighet. För IR-analyser, räknar vi med att åtta 96-brunnar kan färgas och skannas inom en dag av svindlande två partier av fyra plattor vardera (se figur 1). Denna bedömning utgår från 20 min för fixering, 30 min av tvätt, 30 min av blockering, 2 tim primär antikropp inkubation följt av 30 min tvättar, 1 tim sekundär antikropp inkubation följt av 30 min tvättar, 30 min DRAQ5 + Sapphire följt av 30 min tvättar, och 34 minuter av genomsökning tid för 4 tallrikar. Femton ytterligare minuter vägs in Figur 1 för tvättar, för att redogöra för den förskjutna pipettering av fyra individuella plattor. Tid för dataanalyser ingår inte i denna beräkning. Om ATP-analysmätningar kommer att ske parallellt för varje IR-platta, kan tolv tallrikar analyseras på en dag - sex för den infraröda fläckens och sex för ATP-nivåer.

Kriterier för tillfredsställande data i regressionsanalysen (figur 3), som nämns i protokollet avsnittet inkluderar en signifikant korrelation mellan plätering densitet och signalstyrka (två tailed p ≤ 0,05). Storleken på förändringar i luminiscens eller infraröd signal bör också stå i proportion till förändringarna i antalet celler. Helst bör 5k celler har ungefär hälften av luminiscens eller ATP-nivåer i 10k celler, och 15k celler bör ha ca 50% högre värden än 10k celler osv. Denna proportionalitets återspeglar känsligheten för analysen och skiljer sig från värdet på R 2 eller koefficient för bestämning. R 2 endast mäter hur väl regressionslinjen approximerar den verkliga datapunkter. Även om de data som är linjära, kan de relativa förändringarna i signalstyrka inte stå i proportion till storleken av förändringarna i cellantal. Detta kan hända whöna regressionslinjen har en hög R2 men en låg lutning, vilket tyder på att analysen inte är mycket känslig. Därför bör båda vara nöjda kriterierna signifikant korrelation och proportionaliteten av data. Slutligen bör förändringar i signalstyrka runt den optimala plätering densitet faller inom det dynamiska området av instrumentet och analysen. Det dynamiska omfånget är förhållandet mellan de största och minsta möjliga värden. Odyssey kameran har en 4,5 log dynamiskt omfång och mättad signal visas som en ljus vit färg i stället för den vanliga röda eller gröna image för att uppmärksamma forskaren att resultaten inte längre är mätbara. Det dynamiska området under analysen i sig är smalare på grund av frågor som maximal och minimal plätering densitet för varje given celltyp. Om ett plattorna vid ökad celltäthet, kommer mättnadskurvan för dessa analyser avslöja bordläggningen tätheter över vilken inga ytterligare skillnader kan lösas, antingen för att de är avintervallet bildalstraren eller eftersom cellerna inte överlever utträngning över natten. Likaså om en plattor minskar celldensiteter, kan man mäta de minsta celldensiteter under vilken det inte finns några ytterligare förändringar i signalen. Det dynamiska området för analysen inkluderar endast pläterings densiteter mellan det lägsta och högsta antalet celler / brunn som kan lösas. Vi har inte mätt hela det dynamiska området för just dessa analyser eftersom våra celler inte överlever väl vid densiteter än de som rapporteras.

Efter optimering vi nu fläcka N2A mus neuroblastomceller med anti-α-tubulin vid en 1:10000 utspädning, med anti-mus IgG vid en 1:2000 utspädning och med DRAQ5 + Sapphire lösningar vid 1:20.000 och 1:2000, respektive. Vi använder också 25 pl av ATP-analysreagens i 50 | il medium. Resultaten under dessa förhållanden illustreras i figurerna 3A, B och C och har publicerats before 8. Signalstyrkan i samtliga tre analyser var signifikant korrelerad med antalet celler per brunn. Även om alla tre analyser var mycket linjära, inte var de motsvarande i känslighet. Till exempel gjorde 5k celler per brunn inte har exakt halva mängden infraröd färgning som 10k celler per brunn. I motsats till de infraröda analyser, ATP-analysen var mer känsliga för förändringar i plätering densitet. Med andra ord, föll luminiscens med ungefär hälften från 10k till 5k och från 5k till 2.5K celler per brunn. Trots dessa resultat på den högsta känsligheten för ATP-analysen, är det bäst att utföra alla tre analyser för lönsamheten att få en bredare bild av cellulär hälsa.

Vi har nu fläcka råtta primära neuronala kulturer med anti-MAP2 vid en 1:2000 utspädning, med anti-mus IgG vid en 1:1000 utspädning och med DRAQ5 + Sapphire lösningar vid 1:10000 och 1:1,000, respektive, och använda 25 pl av ATP-analysreagens i 50 | il medium (fig.3D, E och F). Signalstyrka i DRAQ5 + Sapphire-analys var den minsta linjära i alla tre analyser eftersom det var liten skillnad mellan 100k och 200k celler per brunn i 700 nm-kanalen. Men signalstyrkan vid 700 nm var bra i förhållande till cell nummer nedan 100k celler per brunn och vi alltid plattan neuronala kulturer på 100k celler per väl i alla fall. Trots detta har vi också observerat att DRAQ5 + Sapphire-analysen är inte lika känslig för toxinbehandlingar som de övriga två analyserna (se nedan). I motsats till DRAQ5 + Sapphire, signalstyrkan var i bättre proportion med plätering densiteter för både MAP2 och ATP-analyser. Det bör noteras att en större volym av ATP-analysreagens kan förbättra resultaten vid 200k celler per brunn. Med andra ord kan luminiscerande utgång höjas till exakt 200% av värdena vid 100k celler per brunn eftersom det finns mer reagens. Men vi aldrig platta kortikala kulturer på att hög en plätering densitet för experiments. Vi har också funnit att MAP2-och ATP-nivåer är känsliga för 20% förändringar i hjärnbarkens neuronal plätering densitet, från 20k celler per brunn till 120k celler per brunn 22. Ändå bör andra utredare testa dessa analyser i sitt eget labb istället för att använda de optimala förhållandena från våra experiment på grund av inter-lab variabilitet i vävnad och hanteringscellen.

I syfte att illustrera användbarheten av dessa analyser Följande behandlingar med toxiner, vi visar dos-responskurvorna för N2A-celler som behandlats med MG132, en proteasom-inhibitor (fig 4). MG132 applicerades i närvaro eller frånvaro av glutation prekursor N-acetyl cystein. Dessa data kan också hittas i vår senaste publikation om de skyddande effekterna av N-acetylcystein 30. Celler analyserades 48 tim efter MG132 behandlingar. MG132 minskade dosberoende DRAQ5 + Sapphire signal (Figurerna 4A, D) och α-tubulin signal ( IC50-värden i frånvaro eller närvaro av N-acetyl-cystein. Ekvationen som användes var Y = 100 / (1 ​​+ 10 ^ ((logik 50-X) * HillSlope))). IC-50 värde för DRAQ5 + Sapphire var 1,64 uM MG132 (logik 50 = 0,22 ± 0,03, R2 = 0,9477, Hill lutning = -1,26) och för α-tubulin-nivåerna var 1,96 uM MG132 (logik 50 = 0,29 ± 0,04, R 2 = 0,9296, Hill lutning = -1,349). N-acetylcystein skiftade kurvan till höger, vilket tyder på att mer MG132 krävdes för att döda celler i närvaro av denna skyddande föreningen. I närvaro av N-acetylcystein, IC-50 värde för DRAQ5 + Sapphire var 4,64 uM MG132 (logik 50 = 0,67 ± 0,05, R2 = 0,8732, Hill lutning = -1,06) och för α-tubulin var 6,35 uM MG132 ( Logik 50 = 0,80 ± 0,04, R2 = 0,8802, Hill lutning = -10,382). En studie av N2A-celler genom Madeira och kollegor rapporterade ca 50% förlust av livsduglighet vid 10 pM MG132, mätt genom MTT-analys 31. Fioriti rapporterade 60% ​​förlust av viabilitet 4 timmar efter behandling med 50 mikroM MG132, återigen med MTT-analysen 32. Slutligen, Zhang och kollegor rapporterade 60% ​​förlust av viabilitet vid 10 ^ M MG132, med hjälp av räkningar av Hoechst-färgade kärnor 33. Dessa IC 50-värden är högre än vår. Men analys vi för viabilitet 48 timmar efter påbörjad behandling, till skillnad från de tidigare studier.

Enligt Cell Titer Glo assay var ATP-nivåer höjs vid låga koncentrationer av MG132 (Figur 4C), vilket visar att ATP-nivåer är inte nödvändigtvis i proportion till cell titer efter behandling. De ATP-uppgifter är ändå användbara genom att de visar att N-acetylcystein skyddar också metabolisk funktion när N2A celler behandlas med MG132. Detta framgår i than skifta i IC 50 värdet av MG132 med N-acetylcystein. IC-50 värde för ATP var 3,05 uM MG132 (logik 50 = 0,48 ± 0,07, R2 = 0,8616, Hill lutning = -1,0) med fordonet och 9,12 | iM MG132 med N-acetylcystein (logik 50 = 0,96 ± 0,04, R 2 = 0,9261, Hill lutning = -1.0). Notera att koncentrationerna som ledde till ökningar i ATP uteslöts i denna analys. Inklusive alla värden i analysen sänkte determinationskoefficienten och ökat IC 50-värden till 4,03 mikroM MG132 (LOGIC 50 = 0,61 ± 0,09, R2 = 0,7224, Hill Slope = -1.4) i närvaro av fordonet och till 9,24 mikroM MG132 (logik 50 = 0,96 ± 0,07, R2 = 0,6607, Hill lutning = -2,1) i närvaro av N-acetylcystein (kontrast med figur 4C).

Ett andra exempel på dessa tre analyser illustreras för primära kulturer i Figure 5. Vävnad microdissected från råtta neocortex och allocortex, dissocierade, pläterades vid 100k celler per brunn, och behandlades parallellt med H 2 O 2. Vi testade hypotesen att dessa två hjärnregioner skulle skilja sig i sin hantering av oxidativ stress som de är differentiellt känsliga för neurodegenerativa sjukdomar 34-39. En del av dessa uppgifter har publicerats tidigare och resultaten diskuteras vidare i denna studie 22. IC-50-värden för DRAQ5 + Sapphire var 22,84 pM H 2 O 2 i neocortex (logik 50 = 1,36 ± 0,07, R2 = 0,7552, Hill lutning = -0,95) och 24,63 uM H 2 O 2 i allocortex (logik 50 = 1,39 ± 0,03, R2 = 0,9379, Hill lutning = -1,74). IC-50-värden för MAP2 var 11,66 pM H 2 O 2 i neocortex (logik 50 = 1,07 ± 0,04, R2 = 0,9332, Hill lutning = -2,13) ​​och 29,76 pM H 2 O 2 i allocortex (logik 50 = 1,47 ± 0,04, R2 = 0,8934, Hill lutning = -4,45). IC-50-värden för ATP var 23,82 pM H 2 O 2 i neocortex (logik 50 = 1,38 ± 0,03, R2 = 0,8907, Hill lutning = -2,56) och 44,5 pM H 2 O 2 i allocortex (logik 50 = 1,65 ± 0,03 , R2 = 0,9204, Hill lutning = -2,71). Allocortex var signifikant mer resistenta mot oxidativ stress än neocortex vid koncentrationer av H 2 O 2 nedan 50 pM, men DRAQ5 + Sapphire analysen var den minst känsliga för att illustrera denna skillnad. Detta kan återspegla att den senare analysen inte kan skilja glia från nervceller, till skillnad MAP2. Som nämnts tidigare, våra kulturer innehålla några glia, såsom de skördas från postnatal hjärn 22. Överraskande, vid höga koncentrationer av H 2 O 2 (75 ^ iM och äldre), när alla MAP2 + astrocyter i dessa kulturer är mer resistenta mot H2O 2 än MAP2 + nervceller (visas ej), antar vi att hjärnbarkens astrocyter är mindre känsliga för oxidativ skada än allocortical astrocyter. Detta mönster kan återspeglas i DRAQ5 + Sapphire analysen men inte ATP-analysen eftersom de oxidativt skadade astrocyter inte metaboliskt lönsamt. Oavsett orsaken till dessa slående mönster, är dessa primära kultur uppgifter illustreras här bara för att avslöja att analyserna är inte alltid överens.

Slutligen, för att illustrera det intraplatejordskalv variabilitet med samtliga tre analyser, vi plottas den andra och tredje brunnarnas råa datapunkter från de ovannämnda dosresponskurvor i figurerna 6A-C och 6G-I >. På samma sätt, i syfte att illustrera Interplate variabilitet plottas vi medelvärdet av rådatapunkter (medelvärdet av tredubbla brunnar) från två plattorna i figurerna 6D-F och 6J-L. Signalstyrka i replikatbrunnar och över oberoende experiment uppvisade signifikanta korrelationer för varje åtgärd. Det fanns vissa variationer i råvärden över oberoende experiment i primära neuronala kulturer, kanske för att vi återanvända gamla antikropp och DRAQ5 + Sapphire lösningar och refreeze oanvänd ATP-analys reagenser ett par gånger. En annan orsak till det högre Interplate variabilitet i primära kulturer kan vara kvaliteten på själva kulturen. Varierande obduktion intervall och vävnadshantering i olika experimentella dagar kan bidra till varians.

jpg "/>
Figur 1. Schematisk illustration av alla tre lönsamhetsanalyser (A) och tidslinje för IR-analyser (B). Visas är de rekommenderade rutiner för N2A-celler. Om DRAQ5 + Sapphire lösningar inte kommer att återanvändas på andra plattor som är färgade med olika sekundära antikroppar, kan de kombineras med den anti-mus sekundär antikropp lösning för en slutlig 1 timme inkubation, minska proceduren med ett steg. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2
Figur 2. Plate-format av ATP-analysen (A) och IR-analyser (B) som beskrivs i avsnittet Rutiner. Även om en96-brunnar är illustrerad, dessa analyser kan anpassas till andra format, till exempel 384 brunnar, för att spara på reagenser och celler. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3
Figur 3. Linjär regressionsanalys för alla tre viabilitet analyser i N2A mus-neuroblastom-celler (A, B, C) ​​eller primära postnatala råtthjärnbarkens neuroner (D, E, F). Signalstyrkan för varje analys är plottad som en funktion av beläggningsdensiteten. Infällningar visar representativa infraröda bilder av DRAQ5 + Sapphire (A, D), α-tubulin (B), eller MAP2 (E)-färgning. Raw intensitetsvärden listas under varje bild. Observera att rå värden ien individ väl kan skilja sig från ett genomsnitt av tre brunnar för att experimentet och från medelvärdet av 3-4 oberoende experiment. De ursprungliga IR-bilder var pseudocolored rött (700 nm) eller grönt (800 nm). Varje experiment utfördes i trippelbrunnar och upprepas 3x för DRAQ5 + Sapphire i båda N2A-celler och primära neuroner, 3x för α-tubulin, 4x för MAP2, 3x för ATP i N2A-celler och 4x för ATP i neuroner. Data från de tre brunnar beräknades för ett slutvärde för var och en av 3-4 experiment. Medelvärde och SEM för dessa 3-4 slutliga värdena visas i diagrammet. Observera att DRAQ5 + Sapphire värden uppvisar låga standardavvikelser så att SEM barer är inte synliga. Den R2 determinationskoefficient och två tailed p värde bedöma betydelsen av sambandet illustreras också för varje åtgärd. Data analyserades i GraphPad Prism (version 5.0). Omtryckt från neurokemi International, 61, av Unnithen et al: "Rescue från en två drabbade hög genomströmning modell av neurodegeneration med N-acetylcystein," sid 356-368, med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 4
Figur 4. Skydd av N2A celler mot MG132 toxicitet. N2A-celler behandlades med angivna koncentrationerna av proteasom-inhibitor MG132 den i närvaro eller frånvaro av antioxidanten N-acetylcystein (NAC, 3 mM). Alla tre viabilitet analyser utfördes 48 timmar senare. Notera ökningen av ATP-nivåer vid låga koncentrationer av MG132 (C). Ingen parallell ökning av DRAQ5 + Sapphire färgning (A) or α-tubulin (B) var uppenbar. Representativa infraröda bilder av DRAQ5 + Sapphire och α-tubulin fläckar var pseudocolored rött och grönt i D och E, respektive. Varje experiment utfördes i trippelbrunnar och upprepad 4x för DRAQ5 + Safir, 4x för α-tubulin, och 3x för ATP. Data från de tre brunnar beräknades för ett slutvärde för var och en av 3-4 experiment. Medelvärde och SEM av dessa 3-4 slutvärden visas. * P ≤ 0,05 jämfört med N-acetylcystein kontra vatten, Bonferroni korrektion efter tvåvägs ANOVA. Data analyserades i GraphPad Prism (version 5.0). Omtryckt från neurovetenskap, 255, av Jiang et al: "N-acetylcystein Blunts proteotoxicity i ett värmechockprotein beroende sätt" s. 19-32, med tillstånd från Elsevier. Cslicka här för att visa en större bild.

Figur 5
Figur 5. Differential sårbarhet hjärnbarkens och allocortical kulturer till väteperoxid toxicitet. Microdissections av postnatal primära motoriska och sensoriska neocortex och av entorhinal och piriform allocortex dissocierades och utströks på 100k celler per brunn. På dag in vitro 2 behandlades celler med de angivna koncentrationerna av H 2 O 2. Plattorna analyserades 48 h senare. Observera att allocortex lever dessa odlingsförhållanden bättre än neocortex och har högre cellantal vid baslinjen. Varje experiment utfördes i trippelbrunnar och upprepad 4x för DRAQ5 + Sapphire, 3x för MAP2 och 6x för ATP. Data från de tre brunnar beräknadesför en slutvärde för var och en av 3-6 experiment. Medelvärde och SEM av dessa 3-6 slutvärden visas. * P ≤ 0,05 jämfört med neo-kontra allocortex, Bonferroni korrektion efter tvåvägs ANOVA. Data analyserades i GraphPad Prism (version 5.0). Klicka här för att visa en större bild.

Figur 6
Figur 6. Intraplatejordskalv och Interplate korrelationer för MG132 och H 2 O 2 dosresponskurvor i N2A-celler och kortikala neuroner. Samtliga individuella experiment kördes i trippelbrunnar. Rådata från de andra två brunnar inom varje grupp avsattes som replikerar 1 och 2 för att mäta reproducerbarhet inom plattorna (A, C för N2A celler och G, H och I för cortex). Data från samma grupper i två oberoende försök (medelvärdet av tre brunnar) avsattes som platta 1 och platta 2 för att mäta reproducerbarhet över plattorna (D, E, och F för N2A celler och J, K, L för cortex). Den R2 determinationskoefficient och två tailed p värde bedöma betydelsen av sambandet illustreras också för varje åtgärd. Data analyserades i GraphPad Prism (version 5.0). Klicka här för att visa en större bild.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har funnit att signalstyrkan i alla tre viabilitet analyser är linjär och korreleras med plätering densitet. Men inte alla de analyser som är lika känslig för två-faldig eller 1,5-faldiga förändringar av plätering densitet. För N2A-celler, de infraröda analyser är mindre känsliga än ATP-analysen, särskilt vid lägre bordläggningen tätheter. Trots att de infraröda analyser är mindre känsliga än ATP, den DRAQ5 + Sapphire analyser och α-tubulin analyser är i god överensstämmelse i att de avslöjar mycket skyddande effekten av N-acetylcystein. Det var dos-responsiv förlust av infraröd signal med båda analyserna, och alla tre viabilitet kurvor flyttades åt höger med N-acetylcystein. Denna överlappning är inte alltid observerades för alla typer av behandlingar av N2A-celler, såsom de α-tubulin och ATP-analyser verkar vara mer känsliga för föreningar såsom ammoniumklorid än DRAQ5 + Sapphire-analysen (se figur 4 i Unnithan et al. Åtta ). Sålunda viabilitet phenotypes är inte alltid lika representerade av samtliga tre analyser. Även om ATP-analys var i bättre proportion till antalet N2A-celler utstrukna än α-tubulin och DRAQ5 + Sapphire analyser antagandet att signalstyrkan återspeglar cellantalet var inte alltid uppfyllt efter toxinbehandling. ATP-nivåer ökade vid toxinhalter som inte framkallar en liknande ökning av signal i de infraröda analyser. Dessa data visar kompenserande metabola förändringar i N2A celler som svar på proteasomhämning och är användbara i sin egen rätt. Den U-formade ATP-dos-svarskurva är karakteristisk för det fenomen som kallas hormesis. Hormesis definieras som gynnsamma biologiska reaktioner på låg nivå exponeringar mot gifter och andra stressfaktorer 40-42.

För nervceller, den DRAQ5 + Sapphire fläcken var mindre känslig än MAP2 och ATP-analyser vid höga bordläggningen tätheter. Men DRAQ5 + Sapphire, MAP2, och ATP-analyser var bra i förhållande till cell antal i primära kortikala neuroner vid eller under 100k celler per brunn. Vi tallrik nervceller på 100k celler per brunn. Nervceller från cortex är inte kända för att replikera, och därför var vi mer bekymrade linjäritet vid 100k eller lägre bordläggningen tätheter. Den DRAQ5 + Sapphire analysen var mindre känsliga för skillnader mellan neocortex och allocortex än både MAP2 eller ATP vid koncentrationer under 50 mikroM H 2 O 2. Dessutom gjorde ATP-nivåer faller inte så dramatiskt på H 2 O 2 behandling som infraröd signal i de övriga två analyserna, kanske återigen tyder på kompenserande ökning av ATP-produktion. Skillnaderna mellan de tre analyserna i N2A-celler och primära nervceller kan återspegla att cellulära funktioner kan ändras innan brutto anatomiska strukturer påverkas, och att cellstrukturer, däribland cytoskelettproteiner, kan påverkas långt innan cellerna själva är förlorade. De senaste uppgifterna om multiplex lönsamhetsanalyser av Gilbert och kollegor övertygandeillustrerar att olika lönsamhetsåtgärder såsom Hoechst nukleär färgning och ATP-mätningar ger information om specifika cellulära egenskaper som endast delvis och indirekt återspeglar lönsamheten som helhet 26. Vi rekommenderar därför utföra alla tre analyser samtidigt och inte förlita sig på en enda analys för metabolisk livskraft så många publikationer gör. För ytterligare information om någon av dessa åtgärder, rekommenderar vi att räkna enskilda celler och sedan bedöma cytoskelettprotein uttryck och ATP-nivåer som en funktion av antalet celler.

Även om det finns andra analyser för metabolisk livsduglighet, såsom MTT, fördelen av ATP-analysen ligger i dess känslighet och dynamiskt omfång. MTT-analysen kan överskatta antalet viabla celler i jämförelse med ATP-mätningar och uppvisar ett IC 50 som är två gånger högre 43. Dessutom Petty och kollegor rapporterade att ATP-analysen kundedetektera den nedre gränsen för 1563 celler per brunn medan MTT-analysen inte kunde detektera mindre än 25k celler / brunn 12. Den signal-till-brus-förhållande (signal från brunnar med levande celler kontra brunnar utan celler) är bara 7 för MTT men 230 för ATP 44. En annan fördel med självlysande ATP-analyser över MTT är att inkubationstiden är mycket kortare. Dessutom kostar det MTT-analysen från Promega 0,28 ¢ per brunn medan Cell Titer Glo-analys från samma tillverkare kostar 0,09 ¢ per brunn på våra rekommenderade spädningar. Men det finns begränsningar för alla metaboliska analyser, metabolisk aktivitet kan kopplas bort från överlevnad, särskilt under nekros. Om detta är ett problem, kan analyserna i denna rapport kan kombineras med mätningar av laktatdehydrogenas frisättning för att fastställa förlust av membranintegritet. Detta skulle inte innebära några ytterligare plattor, som laktat mätningar dehydrogenas är helt enkelt gjort i det extracellulära mediet.

Även om vi presenterar dessa analyser som alternativ till manuella räkningar på mikroskopet, kan det senare vara en mycket känslig och noggranna metoder för stickprov cell nummer om ett korrekt. Ja, räknar vi med att räkningar av Hoechst-färgade kärnor skulle vara mer känslig för små förändringar i N2a cell nummer än DRAQ5 + Sapphire-analys. När alla analyser misslyckas linearitet testet, manuella räkningar är viktiga. Ett bra exempel på detta är vår odlade primära astrocyternas modell, som vi utför det mer arbetskrävande manuella räknas 45. Dock måste de inneboende fördomar av manuella räkningar hållas i minnet när man tolkar datacell räkna, precis som de inneboende bristerna i datoriserade analyser får inte viftas bort. Ett antal styrkor och svagheter i lönsamhetsanalyser beskrivs därför nedan.

Först, om DAPI eller Hoechst fläckar är anställda, krympta och kondenserade kärnor är ofta betecknas somapoptotiska 1. Men cellstorlek och kondensation av kärnor ligger längs en jämn kontinuum. Däremot liv och död är ömsesidigt uteslutande, binära fenomen. Om inte två mycket olika grupper av levande eller döende celler observeras, verkar det bäst att räkna alla celler under en tröskel kärndiameter som apoptotiska med bildbehandlingsprogram såsom metamorfa eller ImageJ snarare än med ögat. Naturligtvis är valet för en tröskel diameter godtyckligt eftersom vi inte vet vid vilken tidpunkt en irreversibel apoptotisk kaskad initieras. Dessutom, per definition, även celler med aktivt kaspas 3 är inte nödvändigtvis på väg till döden och bör kanske räknas som fortfarande lever vid tiden för fixering 46. Våra IR-analyser undvika sådana problem genom att behandla alla celler som är anslutna till plattan vid fixering som fortfarande lever. Endast celler som har flutit bort räknas som död. Detta placerar celler i endera av två olika kategorier och undviker fallgroparna med att använda en complex, kontinuerlig funktion som kärndiameter.

För det andra, manuella räkningar sampla typiskt en liten del av hela brunnen. Detta kan leda till provtagning fördomar och, ibland höga standardfel av medelvärdet. Med våra viabilitet analyser är hela väl samplas för ATP och nära det hela väl samplas med de infraröda analyser. Denna provtagning mönster ökar urvalsstorlek och undviker ibland godtyckligt beslut om var i brunnen för att knäppa en bild för manuella räkningar. Om bilderna är tagna i mitten av väl, måste man komma ihåg att denna region är där den mest tvätt-off av celler uppstår, vilket leder till potentiella överskattningar av toxicitet. Däremot IR analyserna kasta ett rutnät på bilden av 96-brunnar som bara utesluter de extrema hörnen av brunnarna. Om så önskas kan hörnen av brunnarna inkluderas genom att öka diametern av cirklarna i gittret.

För det tredje bör både förblindas fotografen och cellräknaren vid manuella räkningar. Men när cellerna behandlas med toxiner, de ofta antar morfologiska förändringar som är ganska uppenbart även för ett otränat öga. Detta gör det mycket svårare att vara opartisk. Blindhet är inte ett krav för våra analyser.

För det fjärde, manuella räkningar är tidskrävande och kostar den ansvarige forskaren mer i lön. Lönerna är en av de högsta kostnaderna för att bedriva forskning. Skann tid för en platta på Odyssey är bara 8 min lång på "medelkvalitet" inställning och kan sänkas ytterligare om inställningen "låg kvalitet". Det bör noteras att den Odyssey Imager är dyrt, även när man köper en begagnad demoversion, men det är en en-gång fast kostnad. Å andra sidan måste man också investera i relativt dyra epifluorescence mikroskop för manuell cellräkningar av DAPI-eller Hoechst fläckade kärnor. Trots den initiala kostnaden, är Odyssey Imager en universalmaskin som även mäter västerländska immunoblots på ett kvantitativt sätt 47,48. Vi har anpassat användningen av Odyssey för kvantifieringar av immunfärgning i makroskopiska hjärnstrukturer såsom råtta eller mus striatum eller telencephalic cortex. Denna metod har också använts av andra 49. En svaghet i Odyssey Imager för vävnadsavbildning är att den högsta upplösningen är bara 21 nm. Det kan därför inte räkna enskilda celler och är inte avsedd att visualisera finare anatomiska detaljer.

Slutligen kan de infraröda analyserna inte vara så känslig för små förändringar i antalet celler som manuella räkningar. IC-50-värden kan därför inte betraktas som visar koncentrationen som framkallar exakt 50% förlust av cellantal, men bara som den koncentration som framkallar 50% förlust av infraröd signal. Denna varning gäller troligen tillalla lönsamhetsanalyser som kringgår enskilda cellräkningar genom mikroskopi och prova hela väl på en gång. Den vaghet i samband med sådana analyser kan vara en funktion av hypertrofi, atrofi, eller andra förändringar i utseende som påverkar signalstyrkan. Till exempel, med vissa toxiner, α-tubulin immunoreaktivitet i varje cell kan således öka som en funktion av toxicitet. Vi har observerat detta fenomen i N2A-celler som behandlats med mycket höga halter av MG132 8. Om detta är av intresse, kan andra cytoskeletal markörproteiner, såsom β-aktin eller GAPDH användas. Vidare betonade N2A celler tenderar att bilda bipolära processer 8,50,51. Med förändringar i cellstorlek, kommer fluorescerande signal produktion per cell skiljer sig också i alla behandlingsgrupper. Vi rekommenderar att toxinbehandlade celler undersökas med standard högupplösande mikroskopi efter immunocytokemi för samma markörer som används i I-Cell Western. Om cytoplasman ändrar mycket i storlek efter behandling menkärnan inte, vi rekommenderar att du använder DRAQ5 fläcken utan Sapphire att endast kvantifiera kärnor. Framtida studier med olika färger och med andra cytoskelettala eller andra förekommande proteiner är motiverade för att övervinna dessa hinder.

Vi drar slutsatsen att alla analyser lider av varningar och har väckt farhågor om känslighet, linjäritet, urvalsfel, signal-till-brus-förhållanden, mänsklig partiskhet eller subjektivitet, tid och kostnad. Dessutom är alla analyser förlitar sig på antaganden som inte alltid uppfylls. Därför rekommenderar vi att minst två analyser användas för att beskriva effekten av behandling på cellkulturer, en som mäter metabolic hälsa och en som förlitar sig på anatomiska livskraft. På detta sätt kan ett mer effektivt sätt fastställa huruvida terapeutiska föreningar skydda både struktur och funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen av författarna har några konflikter att lämna ut.

Acknowledgments

Vi erkänner Juliann Jaumotte för idén om att spara på de volymer av reagens i ATP-analysen. Vi är djupt tacksamma för den fantastiska administrativt stöd av Mary Caruso, Deb Willson, och Jackie Farrer och till Mylan School of Pharmacy för att ge ekonomiskt stöd till dessa studier. Tack också till Hunkele fruktade sjukdomar Foundation och Parkinsons och rörelserubbningar Foundation för deras ekonomiska stöd av de primära neuronala studierna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Titer Glo Promega G7572 Buy in 100 ml quantities and aliquot, instead of purchasing the more expensive 10 ml quantity. Reconstituted, unused reagents can be refrozen at -20 °C for at least 21 weeks
18% Formalin Thermo-Shandon 9990244 Buying this fixative avoids the weighing out of formaldehyde powders and boiling of the solution; exposure to vapors is thereby minimized
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 It is not essential to add this to formaldehyde solutions but it improves the appearance of the fixed cells
Odyssey Block LI-COR 927-40003 This fish serum can be bought in bulk and frozen at -20 °C for long term use
Triton-X 100 Sigma-Aldrich 21568 We store a stock solution of 10% Triton-X 100 in sterile water at 4 °C
Sodium Phosphate Monobasic Fisher S468 One can also buy PBS tablets or 10x PBS solutions, but they are more expensive
Sodium Phosphate Dibasic Fisher S373 See above
Sodium Azide (250x) Ricca Chemical Company 7144.8-16 Do not buy the powder because sodium azide is very toxic. We store all our used antibodies in 1x sodium azide at 4 °C until they become contaminated with debris
Mouse anti-α-tubulin Sigma-Aldrich T5168 This antibody is expensive but can be greatly diluted and is highly specific
Mouse anti-MAP2 Sigma-Aldrich M9942 This antibody is expensive but is highly specific (a prerequisite for In-Cell Westerns)
800 nm Goat anti-mouse IgG LI-COR 926-32210 Other companies also sell infrared secondary antibodies. Be sure to purchase the highly cross-adsorbed antibodies and note that concentrations of IgGs may vary with the source
DRAQ5 Biostatus DR50200 This compound used to be sold by LI-COR at 1 mM
Sapphire LI-COR 928-40022
Luminometer PerkinElmer VICTOR3 1420 multilabel counter
Odyssey Imager LI-COR 9201-01
Shaker/Mixer Research Products International 248555

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
  2. Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G. Effects of GDNF on 6-OHDA-induced death in a dopaminergic cell line: modulation by inhibitors of PI3 kinase. J. Neurosci. 73, 105-112 (2003).
  3. Patonay, G., Antoine, M. Near-infrared fluorogenic labels: new approach to an old problem. Anal. Chem. 63, (1991).
  4. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 deficiency in astrocytes selectively enhances mitochondrial Complex I inhibitor-induced neurotoxicity. J. Neurochem. 117, 375-387 (2011).
  5. Egorina, E. M., Sovershaev, M. A., Osterud, B. In-cell Western assay: a new approach to visualize tissue factor in human monocytes. J. Thromb. Haemost. 4, 614-620 (2006).
  6. Aguilar, H. N., Zielnik, B., Tracey, C. N., Mitchell, B. F. Quantification of rapid Myosin regulatory light chain phosphorylation using high-throughput in-cell Western assays: comparison to Western immunoblots. PLoS One. 5, (2010).
  7. Jinwal, U. K., Dickey, C. A. Cell-based assays for regulators of tau biology. Methods Mol. Biol. 670, 93-108 (2011).
  8. Unnithan, A. S., Choi, H. J., Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Rescue from a two hit, high-throughput model of neurodegeneration with N-acetyl cysteine. Neurochem. Int. 61, 356-368 (2012).
  9. Hoskins, C., Wang, L., Cheng, W. P., Cuschieri, A. Dilemmas in the reliable estimation of the in-vitro cell viability in magnetic nanoparticle engineering: which tests and what protocols? Nanoscale Res. Lett.. 7, 10-1186 (2012).
  10. Essner, M. D., Javed, A., Eleazer, P. D. Effect of sodium hypochlorite on human pulp cells: an in vitro study. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 112, 662-666 (2011).
  11. Sims, J. T., Plattner, R. MTT assays cannot be utilized to study the effects of STI571/Gleevec on the viability of solid tumor cell lines. Cancer Chemother. Pharmacol. 64, 629-633 (2009).
  12. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  13. Womac, A. D., Burkeen, J. F., Neuendorff, N., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Circadian rhythms of extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus cells and cultured astrocytes. Eur. J. Neurosci. 30, 869-876 (2009).
  14. Ataullakhanov, F. I., Vitvitsky, V. M. What determines the intracellular ATP concentration. Biosci. Rep. 22, 501-511 (2002).
  15. Iglehart, J. D., Silver, D. P. Synthetic lethality--a new direction in cancer-drug development. New Engl. J. Med. 361, 189-191 (2009).
  16. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Methods. 160, 81-88 (1993).
  17. Kangas, L., Gronroos, M., Nieminen, A. L. Bioluminescence of cellular ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. Med. Biol. 62, 338-343 (1984).
  18. Lundin, A., Hasenson, M., Persson, J., Pousette, A. Estimation of biomass in growing cell lines by adenosine triphosphate assay. Methods Enzymol. 133, 27-42 (1986).
  19. Sevin, B. U., et al. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol. Oncol. 31, 191-204 (1988).
  20. Maehara, Y., Anai, H., Tamada, R., Sugimachi, K. The ATP assay is more sensitive than the succinate dehydrogenase inhibition test for predicting cell viability. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 23, 273-276 (1987).
  21. Andreotti, P. E., et al. Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Res. 55, 5276-5282 (1995).
  22. Posimo, J. M., Titler, A. M., Choi, H. J., Unnithan, A. S., Leak, R. K. Neocortex and allocortex respond differentially to cellular stress in vitro and aging in vivo. PLoS One. 8, (2013).
  23. Carralot, J. P., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28, 261-268 (2012).
  24. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
  25. Oliver, D. G., Sanders, A. H., Hogg, R. D., Hellman, J. W. Thermal gradients in microtitration plates. Effects on enzyme-linked immunoassay. J. Immunol. Methods. 42, 195-201 (1981).
  26. Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS One. 6, (2011).
  27. Bayer, S. A., Altman, J. Neocortical Development. , Raven Press. (1991).
  28. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54, 357-369 (2007).
  29. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 knock-down in astrocytes impairs astrocyte-mediated neuroprotection against rotenone. Neurobiol. Dis. 33, 28-36 (2009).
  30. Jiang, Y., et al. N-Acetyl cysteine blunts proteotoxicity in a heat shock protein-dependent manner. Neuroscience. 255, 19-32 (1016).
  31. Madeira, A., et al. Caveolin-1 interacts with alpha-synuclein and mediates toxic actions of cellular alpha-synuclein overexpression. Neurochem. Int. 59, 280-289 (2011).
  32. Fioriti, L., et al. Cytosolic prion protein (PrP) is not toxic in N2a cells and primary neurons expressing pathogenic PrP mutations. J. Biol. Chem. 280, 11320-11328 (2005).
  33. Zhang, L., et al. Proteasome inhibition modulates kinase activation in neural cells: relevance to ubiquitination, ribosomes, and survival. J. Neurosci. Res. 87, 3231-3238 (2009).
  34. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 24, 197-211 (2003).
  35. Stranahan, A. M., Mattson, M. P. Selective Vulnerability of Neurons in Layer II of the Entorhinal Cortex during Aging and Alzheimer's Disease. Neural Plast. 2010, (2010).
  36. Duyckaerts, C., Delatour, B., Potier, M. C. Classification and basic pathology of Alzheimer disease. Acta Neuropathol. 118, 5-36 (2009).
  37. Chu, C. C., Tranel, D., Damasio, A. R., Van Hoesen, G. W. The autonomic-related cortex: pathology in Alzheimer's disease. Cereb. Cortex. 7, 86-95 (1997).
  38. Braak, H., Del Tredici, K., Bohl, J., Bratzke, H., Braak, E. Pathological changes in the parahippocampal region in select non-Alzheimer's dementias. Ann. N.Y. Acad. Sci. 911, 221-239 (2000).
  39. Braak, H., Rub, U., Schultz, C., Del Tredici, K. Vulnerability of cortical neurons to Alzheimer's and Parkinson's diseases. J. Alzheimers Dis. 9, 35-44 (2006).
  40. Calabrese, E. J. Hormesis is central to toxicology, pharmacology and risk assessment. Hum. Exp. Toxicol. 29, 249-261 (2010).
  41. Giordano, J., Ives, J. A., Jonas, W. B. Hormetic responses in neural systems: consideration, contexts, and caveats. Crit. Rev. Toxicol. 38, 623-627 (2008).
  42. Mattson, M. P. Hormesis defined. Ageing Res. Rev.. 7, 1-7 (2008).
  43. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, (2010).
  44. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  45. Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Astrocyte plasticity revealed by adaptations to severe proteotoxic stress. Cell Tissue Res. , (2013).
  46. McLaughlin, B., et al. Caspase 3 activation is essential for neuroprotection in preconditioning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 715-720 (2003).
  47. Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol. Biol. 536, 499-513 (2009).
  48. Picariello, L., et al. A comparison of methods for the analysis of low abundance proteins in desmoid tumor cells. Anal. Biochem. 354, 205-212 (2006).
  49. Tapias, V., Cannon, J. R., Greenamyre, J. T. Melatonin treatment potentiates neurodegeneration in a rat rotenone Parkinson's disease model. J. Neurosci. Res. 88, 420-427 (2010).
  50. Fenteany, G., Schreiber, S. L. Specific inhibition of the chymotrypsin-like activity of the proteasome induces a bipolar morphology in neuroblastoma cells. Chem. Biol. 3, 905-912 (1996).
  51. Omura, S., et al. Lactacystin, a novel microbial metabolite, induces neuritogenesis of neuroblastoma cells. J. Antibiot. 44, 113-116 (1991).

Tags

Cellular Biology I-cell västerländska DRAQ5 Sapphire Cell Titer Glo ATP primära kortikala neuroner toxicitet skydd N-acetylcystein hormesis
Bärkraft: Analyser för celler i odling
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Posimo, J. M., Unnithan, A. S.,… More

Posimo, J. M., Unnithan, A. S., Gleixner, A. M., Choi, H. J., Jiang, Y., Pulugulla, S. H., Leak, R. K. Viability Assays for Cells in Culture. J. Vis. Exp. (83), e50645, doi:10.3791/50645 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter