Summary
Nasale epitheelcellen, verkregen door middel van oppervlakkige schaaf biopsie van menselijke vrijwilligers, worden uitgebreid en overgebracht naar weefselkweek inserts. Bij het bereiken van confluentie, worden cellen gekweekt bij lucht-water grensvlak, waardoor culturen van trilharen en niet-haarcellen. Gedifferentieerde nasale epitheelcelkweken voorzien levensvatbare experimentele modellen voor het bestuderen van de respiratoire mucosa.
Abstract
In vitro-modellen met humane primaire epitheliale cellen zijn essentieel begrijpen belangrijkste functies van de respiratoire epitheel in het kader van microbiële infecties of geïnhaleerd middelen. Directe vergelijkingen van cellen verkregen van zieke populatie kunnen we verschillende fenotypes karakteriseren en ontleden de onderliggende mechanismen bemiddelen veranderingen in de epitheliale cel functie. Het kweken van epitheliale cellen van de humane tracheobronchiale gebied is goed gedocumenteerd, maar is beperkt door de beschikbaarheid van menselijk longweefsel of invasiviteit van de verkrijging van de bronchiale biopsieën borstels. Nasale epitheelcellen worden verkregen door middel van veel minder invasief oppervlakkige neus schrapen biopsieën en onderwerpen kan meerdere keren worden biopsied zonder significante bijwerkingen. Bovendien, de neus is het toegangspunt tot de luchtwegen en daarmee een van de eerste sites die worden blootgesteld aan elke vorm van lucht overgedragen stressor, zoals microbiële agentia, Verontreinigende stoffen of allergenen.
In het kort, nasale epitheelcellen verkregen uit menselijke vrijwilligers worden uitgebreid op gecoate weefselkweek platen, en vervolgens overgebracht op celkweek inserts. Bij het bereiken van confluentie, cellen verder worden gekweekt bij de lucht-vloeistof-interface (ALI), enkele weken, met meer fysiologisch relevante omstandigheden schept. De ALI kweekomstandigheid gebruikt gedefinieerde media leidt tot een gedifferentieerd epitheel dat morfologische en functionele kenmerken vergelijkbaar met de menselijke nasale epitheel, met zowel trilharen en slijm producerende cellen vertoont. Weefselkweek inserts met gedifferentieerde nasale epitheelcellen kunnen worden gemanipuleerd op verschillende manieren, afhankelijk van de onderzoeksvragen (behandeling met farmacologische agentia, transductie met lentivirale vectoren, blootstelling aan gassen of infectie met microbiële agentia) en talrijke verschillende eindpunten vinden geanalyseerd cellulaire en moleculaire pathways, functionele changes, morfologie, enz.
In vitro modellen van gedifferentieerde menselijke nasale epitheelcellen onderzoekers kunnen geven tot nieuwe en belangrijke vragen pakken met organotypische experimentele modellen die de nasale epitheel in vivo grotendeels bootsen.
Introduction
Doel van de techniek
Epitheelcellen (EC) in de luchtwegen zijn een van de eerste sites die rechtstreeks worden blootgesteld aan geïnhaleerde negatieve milieu-invloeden, zoals ziektekiemen, allergenen of luchtverontreinigende stoffen. EC meer dan een structurele belemmering: Zij fungeren als een schakelbord via de afgifte van oplosbare mediators 4-6 en de expressie van liganden / receptoren op hun surfac 7-9 initiëren en reguleren de immuunrespons respiratoire 1-3. Terwijl geïmmortaliseerde cellijnen kunnen worden gebruikt als modellen voor respiratoire EC studie in vitro, ze niet differentiëren in heterogene celpopulaties uit gepolariseerde trilharen en slijm producerende cellen, vergelijkbaar met wat wordt waargenomen in vivo. Belangrijke kenmerken van de respiratoire epitheel waargenomen in vivo Resumerend kan worden primaire luchtweg EC gebruikt. Daarom is ons doel was om onze methode waarbij nasale EC (NEM) te optimaliseren verkregen uit menselijke vrijwilligers. De NEC's worden uitgebreid en in vitro gekweekt, wat een celcultuur model van gedifferentieerde NEC's die veel van de kenmerken van de nasale epitheel gezien in vivo nabootst.
Motivering
Het gebruik van in vitro modellen met menselijke primaire EC nabootsen in vivo situatie - zoals beschreven in deze studie - geeft unieke mogelijkheden ziekte specifieke verschillen van EC, fysiologische parameters geassocieerd met het luchtwegepitheel of de interacties tussen EC en andere celtypes te bestuderen, zoals dendritische cel 10, natural killer cellen 11 of macrofagen. Verschillende bestaande methoden maken gebruik van bronchiale EC, die invasief via borstel biopten kan worden verkregen tijdens bronchoscopies, of op een andere wijze weggegooid longweefsel 12-17. Bovendien, commerciële bronnen om volledig gedifferentieerde menselijke luchtwegen epitheelcelkweken verkrijgen bestaan (EpiAirway model uit MatTek, Ashland, MA, Cloneticsvan Lonza, Bazel, Zwitserland, MucilAir van Epithelix Sars, Genève Zwitserland), waar onderzoekers kunnen kiezen uit verschillende donoren. Vanwege de beperkte pool van commercieel beschikbare epitheelcellen, beperkt of voorgeschreven set parameters, de kosten verbonden aan commercieel verkrijgen primaire menselijke luchtwegen EC en de beperkte toegang tot verwijderd longweefsel of pas verkregen humane bronchiale biopsie weefsel, verbieden vele onderzoekers van uitvoeren van onderzoek bij volledig gedifferentieerde menselijke luchtwegen EC. Daarom hebben we besloten om een techniek die 1) zal gebruik maken van niet-invasief verkregen menselijke NEM, 2) een protocol waardoor culturen van gedifferentieerde menselijke luchtwegepitheel, en 3) zijn reproduceerbaar in de meeste lab instellingen met een bestaande weefselkweek infrastructuur te ontwikkelen.
Voordelen ten opzichte van bestaande technieken / modellen
Geweest nieuw NEC in vergelijking met bronchiale of kleine luchtwegen EC, is veel minder invasief, individueles kan meerdere keren worden biopsied zonder significante bijwerkingen, en oppervlakkige nasale schrapen biopten kunnen worden uitgevoerd in de zieke bevolking die anders niet in aanmerking zouden komen voor onderzoeksgerelateerde bronchoscopies. Niet-invasieve oppervlakkige schaaf biopten naar NEC te verkrijgen, zodat de onderzoeker om donor specificatie stellen a priori, zoals leeftijd, geslacht, status van de ziekte, enz., in overeenstemming met het doel van het onderzoek te worden uitgevoerd. Dus, bij het ontwerpen van onderzoeken onderzoekers zijn niet beperkt door klinisch beschikbaar weefsels / epitheliale specimen, kopen dure gedifferentieerde celcultuur modellen van commerciële leveranciers, of ontwerp invasieve bronchoscopie studies. Bovendien, het gemak om NEM verkrijgen vergroot de mogelijkheid om experimenten in cellen van verschillende donoren, die statistische validatie van de waargenomen resultaten verbetert. Ten slotte, de neus is een van de eerste sites die worden blootgesteld aan elke vorm van stressoren lucht overgedragen. Aldus genereren in organotypischevitro kweeksystemen nabootsen het nasale epitheel zijn nuttig voor het bestuderen inhalatie van virale deeltjes, stoffen, allergenen, of gassen, die gemakkelijk kan worden bereikt door deze celcultuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereid Plastic Ware: Jas Plate
- Voeg 500 ul PureCol (1:100 verdund met steriel water) aan elk putje van een 12-wells plaat.
- Incubeer bij 37 ° C in een incubator gedurende 30 minuten, verwijder de PureCol en spoel af met HBSS vlak voor de cellen worden toegevoegd aan de plaat (zie stap 3.1 hieronder).
2. Verkrijgen en voorbehandeling van biopsie van Human NEC
- Nasale schrapen biopsie
- Verkrijgen oppervlakkige EC langs de neusschelpen onder direct zicht door een 9 mm herbruikbare polypropyleen nasale speculum (model 22009) op een operationele otoscoop met speculum (model 21700). Dit apparaat zorgt voor een optimale visualisatie van de neusschelpen en de flexibiliteit van de beweging.
- Voer de biopten met het onderwerp rechtop gezeten in een rechte stoel met hoofd iets gekanteld of liggend in een liggende positie op een onderzoekstafel.
- Plaats de otoscoop speculum in het neusgat en de inferieure turbinate gevisualiseerd met verlichting.
- Plaats een steriele thermoplastisch curette via speculum met de punt distaal uitgebreid naar de achterkant van de turbinate.
- Met behulp van zachte druk op de inferieure oppervlak van de turbinate, wordt de curette over het mucosale oppervlak 5x getrokken en teruggetrokken. Een succesvolle ophalen van slijmvliescellen gehouden door capillaire werking zal duidelijk zijn in de beker van de curette.
- Plaats monster in een 15 ml conische buis met 8 ml RPMI 1640, vervoer op het ijs.
- Gebruik een tang om de sonde te halen, los weefsel van neushoorn sonde met een P-1000 pipet, gooi sonde
- Centrifuge tot pellet (4 ° C, 400 xg, 5 min), aspireren supernatant (opgelet: voorzichtig de pellet niet te zuigen).
- Resuspendeer de pellet in 1 ml BEGM met 10 ul van 100x DNase 1.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
- Centrifuge (4 ° C, 400 xg, 5 min), NIET het supernatans aspireren!
3. Seed de Cellen op Plastic (Dag 0)
- Verwijder de PureCol van de plaat en spoel af met HBSS (zie ook stap 1.2).
- Voeg een minimumhoeveelheid BEGM + + media (80-100 ul tot een meniscus media wordt in het midden van de put) in 1-4 putjes (afhankelijk biopsie grootte) van de beklede plaat.
- Gebruik een P-1000 pipet om verwijder voorzichtig de pellet van de biopsie weefsel van de buis, zonder opzuigen teveel media.
- Breng de pellet in het midden van de putten, houdt de biopsie samen als een cluster van cellen en niet breken tot een enkele celsuspensie te maken. Een goede biopsie opbrengsten tot 4 putjes die kunnen worden gezaaid. Plaats de plaat in weefselkweek incubator (37 ° C, 5% CO 2,> 90% relatieve vochtigheid).
- Controleer na twee uur om te verzekeren dat er voldoende media (zonder de meniscus).
- Dag1, 24 uur na het zaaien: verzamel alle niet-hechtende cellen van alle putjes (tilt plaat en media met cellen te verzamelen in een P-1000, collect alle putjes in een 1,5 ml centrifugebuis).
- Centrifuge (4 ° C, 400 xg, 5 min.).
- Terwijl centrifugeren celsuspensie: voeg 250 ul BEGM + + en 250 pl BEGM + medium aan de cellen gezaaid op dag 0.
- Herhaal stap 3.1-3.5 voor de niet-hechtende cellen.
- Dag 2-5: verandering media van de cellen dagelijks, voeg 500 ul media aan elk putje, de hoeveelheid BEGM + + media stapsgewijs (dag 2 te verminderen na het uitzaaien: 125 ul BEGM + + plus 375 ul BEGM +, day3 na zaaien en de volgende dagen: 73 pi BEGM + + plus 427 ul BEGM +).
4. Uitbreiding van de cellen in de kolven
- Monitor cellen dagelijks, zodra ze 80-90% confluentie (meestal 5-7 dagen na de biopsie, als het langer duurt voordat ze zullen niet succesvol te groeien) lift cellen hebben bereikt als volgt: zorgvuldig aspireren media; voeg 500 ul van 0,25% trypsine per putje houden bij 37 ° C totdat de cellen losgemaakt (duurt meestal 2-3 min).
- Bereid de noodzaaked volume van de Boon trypsineremmer (SBTI) (750 pi per 1 ml trypsine) in een 15 ml buis.
- Verjagen cellen door herhaaldelijk op en neer pipetteren de trypsine-oplossing; overdracht vrijstaande cellen in de 15 ml conische buis met SBTI.
- Spoel alle putjes met in totaal 1 ml HBSS, voeg HBSS aan de buis met de cellen.
- Centrifuge tot pellet (4 ° C, 400 xg, 5 min.), zuig de media, resuspendeer in 1 ml BEGM + media en vortex de buis.
- Expand cellen in een T25 of T75 fles, afhankelijk van korrelgrootte (dit is p1; ongeveer twee samenvloeiing putten gaan in een T75 kolf, een samenvloeiing goed genoeg is voor een T25, meestal 2 samenvloeiing putten leveren een T75).
- Voeg BEGM + aan de kolven (elk 5 ml voor T75, 3 ml elk voor een T25).
- Voeg de celsuspensie aan de kolven. Breng de kolven in een weefselkweek incubator.
- 24 uur na fles-zaaien: voeg extra BEGM + media aan de kolf (3 ml tot een T25, 10 ml tot een T75).
5. Zaad van de Cellen op Tissue Culture Inserts
- Verwijder het papier uit de kolf en voeg Trypsin (3 ml voor T25, 4 ml voor T75 kolf).
- Incubeer bij 37 ° C totdat de cellen losgemaakt (ongeveer 2-3 minuten).
- Bereid SBTI (750 pi per 1 ml trypsine> 2,25 ml voor T25, 3 ml voor T75) in een 15 ml buis.
- Los cellen door taping de kolf en neer te pipetteren en transfer naar conische buis met de SBTI.
- Spoel de kolf met HBSS (1 ml voor T25, 2 ml voor T75), voeg de HBSS aan de buis van 15 ml.
- Centrifugetot pellet (4 ° C, 400 xg, 5 min), verwijder supernatant voorzichtig.
- Bereid de platen: beslissen hoeveel platen zullen gezaaid worden, het etiket van de platen met voorbeeldcode en nummer, passage nummer (dwz p2) en datum. Voeg 700 ul BEGM + media om de basale kamer.
- Resuspendeer de cel pellet in 1 ml BEGM ALI media door vortexen de buis.
- Tel de cellen met een hemocytometer (een T25 produceert meestal ongeveer 4 miljoen cellen, een T75 kan maximaal 20 miljoen cellen hebben, afhankelijk van het eilandje, gebruik 1-2.000.000 van cellen voor een 12-well plaat) en verdun de celsuspensie met BEGM ALI media om het totale volume nodig is voor de hoeveelheid platen die moet worden gezaaid (1,2 x 10 6 cellen in 2,5 ml media per plaat) (Let op:. Als een deel van de cellen wilt worden bevroren, het etiket van de buis en verwijder cellen hier: we meestal bevriezen 2 x 10 6 cellen in 2 ml van het bevriezen media)
- Voeg 200 ul celsuspensie aan de apicale zijde van elke ongestreken Corning 12well celSteek (> dit zal ongeveer 80,000-150,000 cellen / insert zijn; 12 mm transwells met 0,4 micrometer porie polyester (polyethyleentereftalaat (PET)) membraan insert); zetten in weefselkweek incubator.
- Na 24 uur, veranderen de apicale media (200 ul expansie gemiddeld).
- Handhaving van de celculturen: Verander de media (BEGM ALI media; 700 ul basolaterale en 200 ul apicale) om de andere dag. Inserts hebben ondergedompeld te worden gehandhaafd tot cellen zijn totaal samenvloeiing (geen gaten in de monolaag zijn zichtbaar). Afhankelijk van het aantal cellen dit duurt meestal tussen de 2-6 dagen, als het langer duurt de cellen zal zeer waarschijnlijk niet levensvatbaar zijn.
6. Vestigen Air Liquid Interface Zodra de Cellen zijn volledig Confluent (wanneer de cellen op de Transwells zijn volledig Confluent)
- Zodra de cellen zijn volledig samenvloeiing vervangen zowel apicale en basolaterale media met BEGM ALI media aangevuld met 500 nM retinoinezuur voor 48 uur.
- 48 uur na het toevoegen van de retinoinezuur aangevuld BEGM ALI media: Bereid PneumaCult-ALI Maintenance Medium (instructies na de fabrikant): Bereken het volume van het medium nodig (voor een plaat meestal 8,5 ml voor basaal compartimenten), voeg per 1 ml PneumaCult Compleet Base Medium :
10 pl PneumaCult 100x Onderhoud Supplement
2 ul heparine (van 2 mg / ml voorraadoplossing)
5 pl Hydrocortison (van een 96 ul / ml stockoplossing). - Verwijder alle media en voeg 700 ul PneumaCult-ALI onderhoud media om de basolaterale zijde (geen medium aan de apicale kant).
- Handhaving van de celculturen gedurende 4 weken bij de ALI:
- Wijzig de media om de andere dag (maandag, woensdag en vrijdag schema werkt goed voor ons).
- Na een week bij ALI, een keer per week (woensdag) het apicale oppervlak wordt gespoeld: voeg 200 ul HBSS aan de apicale kant, houd ze gedurende 10 minuten in de incubator, voorzichtig zuig hetHBSS (gebruik een 9 in glazen pipet aan de vacuüm val de biologische veiligheidskast, gebruikt 200 ul uiteinden op de punt van de pipet te zuigen uit de HBSS).
Opmerking: Verander tips tussen de platen, evenals het veranderen van de tips als ik van apicale oppervlak versus basolaterale. Na ongeveer 2 weken in het ALI, cellen beginnen te differentiëren en cilia verschijnen. Celculturen bereiken het volledige differentiatie na ongeveer 4 weken in het ALI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
NEC gekweekt volgens de hier beschreven protocol opnieuw differentiëren tot een heterogene laag EC uit trilharen en niet-haarcellen, die de situatie in vivo (figuur 1). Sommige van de gedifferentieerde NEC's zijn slijm produceren (cellen kleuring in blauw met AB / PAS, figuur 1B). Hoewel de hier gepresenteerde protocol is geoptimaliseerd, kan differentiatie variëren met betrekking tot de verdeling van de totale cel populaties (verschillende verhoudingen van haarcellen: slijm producerende cellen: niet haarcellen) of leveren een squameus epitheel. Deze variaties kunnen afhangen van de donor bevolking staan en dus herhaling van een onderliggende ziekte fenotype, zoals we eerder hebben aangetoond met behulp van NEC's van rokers 18. Figuur 2 toont voorbeelden van suboptimale opnieuw gedifferentieerd NEC met een ander protocol en media formuleringen. De cellen zijn squameuze ennoch kubisch noch trilharen en geen pseudo-respiratoire epitheel (figuur 2) niet na te bootsen.
Figuur 1. Re-gesplitste mens NEC cultuur. NEC's werden gefixeerd met 4% PFA en ingebed in paraffine. Kweken werden gekleurd met hematoxyline en eosine (A) en Alcian blauw / periodieke zuur-Schiff (B) (volgende werkwijzen 19 beschreven). De beelden tonen NEM namelijk organisatie, een kubische structuur slijmvormende slijmbekercellen en trilharen EC.
Figuur 2. Hematoxyline en eosine gekleurde paraffine ingebedde deel van suboptimale culturen. NEC culturen met suboptimale differentiatie. Cellen blijken plaveiselcelcarcinoom, geen cuboidal structuur, geen haarcellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EC Respiratory niet alleen een fysieke barrière voor het menselijk lichaam te beschermen tegen exogene stimuli 20, maar ook als een schakelbord te initiëren en te reguleren respiratoire immuunsysteem responsen 1-3 via uitscheiding van oplosbare mediatoren of direct receptor-ligand cel-cel interacties. Om verdere analyse van de rol van EC in de immuunrespons op potentiaalverschillen tussen EC van zieke populaties te onderzoeken of de effecten van exogene stressoren EC bestuderen, is het belangrijk om de in vivo situatie recapituleren. De menselijke luchtwegen bevatten meer dan 40 verschillende celtypen waaronder 20 verschillende epitheelcellen, zoals haarcellen, goblet cellen en basale cellen 20. Ons protocol beschrijft hoe een oppervlakkige schaafwond nasale biopsie kunnen worden verwerkt om NEC's dat kan worden uitgebreid en gekweekt om re-differentiatie ondergaan, waardoor NEC culturen, die grotendeels de nasale epitheel na te bootsen in vivo opleveren.
Het gebruik van deze in vitro model van organotypische primaire humane gesplitste NEC biedt unieke mogelijkheden voor verschillende toepassingen. Het maakt het bestuderen van ziekte-specifieke verschillen van NEC's (bijvoorbeeld cystic fibrosis, astma, roken), onderliggende mechanismen van een ziekte, evenals gecontroleerde blootstelling aan luchtverontreinigende stoffen (bijv. ozon, diesel-uitlaatgassen, sigarettenrook) 18,21-23. Bovendien gedifferentieerde NEM gekweekt op weefselkweek inserts zich lenen voor co-cultuur met andere celtypen (bijv. dendritische cellen, NK cellen of macrofagen) 10,11, waardoor bij cel-cel interacties in een gecontroleerde omgeving te onderzoeken.
We beschrijven het kweken en opnieuw differentiëren van NEM en niet bronchiale epitheelcellen, die zijn gebruikt in vele eerder gepubliceerde studies 24-27. We zien verschillende redenen waarom het gebruik van NEC voordelig zijn in vergelijking met het gebruik vanbronchiale EC. Eerste, het verkrijgen van oppervlakkige nasale schrapen biopten is minder duur dan het uitvoeren van een bronchoscopie te poetsen biopten te verkrijgen. Ten tweede, voor een verscheidenheid van reeds bestaande ziekten (bijvoorbeeld verbreken astma) is het niet realistisch om het uitvoeren van een onderzoeksgerelateerde bronchoscopie te verkrijgen lagere epitheelcellen. Echter, de minder invasieve procedure schrapen het ondervlak van de onderste nasale turbinate met Rhino sonde worden uitgevoerd bij deze patiënten. Ten derde kan nasale schrapen biopsieën worden uitgevoerd op dezelfde personen meerdere keren (meestal ongeveer 4 weken tussen biopten) zonder significante bijwerkingen 28-30. Ten vierde, NEC behoren tot de eerste cellen worden blootgesteld aan milieu-invloeden, zoals luchtverontreinigende stoffen, pathogenen of allergenen ingeademd en derhalve waardevolle vertegenwoordigen in vitro modellen om de effecten van deze stressoren epitheelcellen bestuderen.
Verschillende celkweek systemen van re-verschillenentiated menselijke EC's zijn commercieel verkrijgbaar (bijv. EpiAirway model uit MatTek, Ashland, MA, Clonetics van Lonza, Bazel, Zwitserland, MucilAir van Epithelix Sars, Genève Zwitserland). Deze commercieel verkrijgbare celculturen stabiel gedurende een lange periode en zijn goed gekarakteriseerd. Ze zijn echter duur en de studies zijn meestal beperkt tot een klein aantal monsters van verschillende individuen. Bovendien is het moeilijk om de donorpopulatie, die afhankelijk van de beschikbaarheid door de leverancier regelen. Vers verkrijgen van NEC's met oppervlakkige schaafwond biopten kan de onderzoeker onderwerp kenmerken (zoals leeftijd, geslacht, ras, gewicht, body mass index, de status van de ziekte, medicijngebruik, etc.) controleren en opnieuw te bellen vrijwilligers terug voor een mogelijke follow- up.
In het algemeen, alle gepubliceerde protocollen voor re-differentiatie menselijke luchtwegen (hetzij bronchiale of nasale) EC's bij de ALI vergelijkbare procedures: obtaining EC, het uitbreiden van de cellen in weefselkweek kolven en dragen naar poreuze celkweek inserts voor de differentiatie van de ALI. De protocollen variëren in het mediumtype, de groeifactor supplementen, het aantal passages, de bekleding van de inzetstukken en de activering van de NEC alvorens een ALI. Terwijl in een protocol, na en verteren, de cellen gezaaid direct op ongecoat inserts en hield het slechts enkele dagen in het ALI vooraf met 13; andere protocollen omvatten kweken gedurende enkele weken opnieuw differentiëren van de ALI 12,14,15 . Er is geen consistentie over het bekleden van de inzetstukken met collageen of andere extracellulaire matrix componenten: terwijl sommige protocollen vereisen coating 12,15 anderen gebruiken ongestreken inserts 13,14. Echter, kweekomstandigheden van groot belang, met name de incubator instellingen. De relatieve vochtigheid, die moet> 90% te zijn, en de CO 2 aan te passen aan 5% zeer goedbelangrijke factoren om te voorkomen dat ze uitdrogen van de ALI celcultuur en helpen buffer de media. Om onze ervaringen te delen, willen we hier vermelden dat er geen 100% slagingspercentage. Sommige nasale schrapen biopsie monsters niet voldoen aan de weefselkweek plaat, terwijl sommige NEC monsters niet zullen houden aan de inserts of zal nooit confluentie bereiken. In de loop der jaren, ons succespercentages volgens de hieronder beschreven protocol is ongeveer 80%. Onze ervaring leert dat het kweken van NEC's van gedefinieerde zieke bevolking, zoals rokers, is een grotere uitdaging dan NEC's van gezonde niet-rokers
Ons protocol voor het kweken van primaire menselijke NEC's bevat een aantal belangrijke stappen die wij geoptimaliseerd door de jaren heen: 1. De NEC's zijn slechts twee keer uitgebreid voordat ze worden gezaaid op de weefselkweek inserts. 2. De inzetstukken zijn ongecoat gebruikt. 3. Eenmaal gezaaid op weefselkweekplaten, wordt de hoeveelheid NuSerum stapsgewijs verlaagd om te voorkomen dat de cellen tillen uit de weefselkweekplaten. 4. De NEC's worden minstens 25-28 dagen bij de ALI alvorens ze te gebruiken in experimenten complete re-differentiatie te verzekeren gehouden. Samengevat, de hier beschreven protocol bevat een geoptimaliseerd protocol cultuur en opnieuw differentiëren menselijke NEM op ALI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Lisa Dailey bedanken voor de nuttige ingangen.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (ES013611 en HL095163), de Steward Medical Research Institute (FAMRI) en de Environmental Protection Agency (CR83346301) en verklaart geen belangenconflict. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health. Hoewel de in dit artikel beschreven onderzoek is mede gefinancierd door het US Environmental Protection Agency via samenwerkingsovereenkomst CR83346301 met het Center for Environmental Medicine, Astma en Long Biologie aan de Universiteit van North Carolina, Chapel Hill, is het niet onderworpen aan de bureau's nodig collegiale en beleidsevaluatie en dus niet noodzakelijk overeen met de standpunten van het agentschap, en geen officiële goedkeuring moet worden afgeleid. Vermelden of handelsnamen of commerciële producten vormt geen goedkeuring of aanbeveling voor gebruik. Loretta Müller wordt ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation met een persoonlijke subsidie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Nasal speculum | Welch Allyn | Model 22009 | 9 mm, reusable polyproylene | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Operating otoscope | Welch Allyn | Model 21700 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Rhino probe cell cuvette | Arlington Scientific | SY-96-092 | bend the head of the cuvette a little more | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 12-well culture plates | Corning | 3512 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Transwell membrane cell culture inserts | Corning | 3460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tissue culture flask | Corning | 430639 and 430641 | T25 and T75 vented flask | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| RPMI 1640 media (with L-Glutamine) | Gibco | 11875 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium | Cell applications | 511-500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3170 | This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium Bicarbonate 7.5% solution | Gibco | 25080 | Use as it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NuSerum | BD Biosciences | 355104 | Use as it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| BAMBANKER freezing media | BAMBANKER | 302-14681 | Use as it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CoolCell | Biocision | HTBCS-136 | (CryoPrep alcohol-free cell freezing container) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PureCol | AdvancedBioMatrix | 5005-B | dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HBSS with Ca2 and Mg2+ | Gibco | 14025 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DNAse 1 | Sigma | DN25 | Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red | Gibco | 25200-056 | Use at it is | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI) | Sigma | T6522 | Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Retinoic acid | Sigma | R7632 | Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate | Gibco | 11995 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine Pituitary Extract | Gibco | 13028-014 | Used for BEGM ALI media. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Nystatin | Sigma | N4014-50 mg | Make up a solution of 3.3 mg/ml. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PneumaCult-ALI media | StemCell | 5001 | This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Hydrocortisone | StemCell | 7904 | Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml) | StemCell | 7980 | Use at it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Filter flasks (500 ml) | Corning | 431097 | 0.22 μm pore size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Filter tubes (50 ml) | Millipore | SCGP00525 | Steriflip, 0.22 μm pore size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pipette tips - ART Barrier Tips | Molecular Bioproducts | 2139RI, 2069RI, 2179RI | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ddH2O, absolute ethanol, ice | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CO2 incubator | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| refrigerated centrifuge | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| biological safety cabinet | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| gloves | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| lab coat with tight cuffs | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Swamy, M., Jamora, C., Havran, W., Hayday, A. Epithelial decision makers: in search of the 'epimmunome. Nat. Immunol. 11, 656-665 (2010).
- Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: soldier in the fight against respiratory viruses. Clin. Microbiol Rev. 24, 210-229 (2011).
- Muller, L., Jaspers, I. Epithelial cells, the "switchboard" of respiratory immune defense responses: Effects of air pollutants. Swiss Med. Wkly. , (2012).
- Sanders, C. J., Doherty, P. C., Thomas, P. G. Respiratory epithelial cells in innate immunity to influenza virus infection. Cell Tissue Res. 343, 13-21 (2011).
- Robertson, M. J. Role of chemokines in the biology of natural killer cells. J. Leukoc. Biol. 71, 173-183 (2002).
- Adachi, M., Matsukura, S., Tokunaga, H., Kokubu, F. Expression of cytokines on human bronchial epithelial cells induced by influenza virus. A. Int. Arch. Allergy Immunol. 113, 307-311 (1997).
- Borchers, M. T., Harris, N. L., Wesselkamper, S. C., Vitucci, M., Cosman, D. NKG2D ligands are expressed on stressed human airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291, L222-L231 (2006).
- Groh, V., et al. Costimulation of CD8alphabeta T cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol. 2, 255-260 (2001).
- Obeidy, P., Sharland, A. F.
- Horvath, K. M., Brighton, L. E., Zhang, W., Carson, J. L., Jaspers, I. Epithelial Cells From Smokers Modify Dendritic Cell Responses in the Context of Influenza Infection 1. Am. J. Resp. Cell. , (2010).
- Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify co-cultured natural killer cells. AJP Lung. , (2013).
- Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 791-798 (2002).
- Zimmermann, G. S., Neurohr, C., Villena-Hermoza, H., Hatz, R., Behr, J. Anti-inflammatory effects of antibacterials on human Bronchial epithelial cells. Respir. Res. 10, 89 (2009).
- Lopez-Souza, N., Avila, P. C., Widdicombe, J. H. Polarized cultures of human airway epithelium from nasal scrapings and bronchial brushings. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 39 (2003), 266-269 (2003).
- Gray, T. E., Guzman, K., Davis, C. W., Abdullah, L. H., Nettesheim, P. Mucociliary differentiation of serially passaged normal human tracheobronchial epithelial cells. Am. J. Respir. Cell Mo.l Biol. 14, 104-112 (1996).
- Adler, K. B., Schwarz, J. E., Whitcutt, M. J., Wu, R. A New Chamber System for Maintaining Differentiated Guinea-Pig Respiratory Epithelial-Cells between Air and Liquid-Phases. Biotechniques. 5, 462 (1987).
- Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell. Dev. Biol. 24, 420-428 (1988).
- Jaspers, I. Reduced expression of IRF7 in nasal epithelial cells from smokers after infection with influenza. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 43, 368-375 (2010).
- Muller, L., Brighton, L. E., Jaspers, I. Ozone exposed epithelial cells modify cocultured natural killer cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 304, 332-341 (2013).
- Ochs, M., Weibel, E. R. Fishman's Pulmoary Diseases and Disorders. Fishmanetal, A. P., et al. 4, Mc Graw Hill. New York, NY. 23-69 (2008).
- Kesic, M. J., Meyer, M., Bauer, R., Jaspers, I. Exposure to Ozone Modulates Human Airway Protease/Antiprotease Balance Contributing to Increased Influenza A Infection. PLoS ONE. 7, e35108 (2012).
- Jaspers, I. Diesel exhaust enhances influenza virus infections in respiratory epithelial cells. Toxicol. Sci. 85, 990-1002 (2005).
- Jaspers, I., Flescher, E., Chen, L. C. Ozone-induced IL-8 expression and transcription factor binding in respiratory epithelial cells. Am. J. Physiol. 272, L504-L511 (1997).
- Blume, C., et al. Barrier responses of human bronchial epithelial cells to grass pollen exposure. Eur. Respir. J. , (2012).
- Bauer, R. N. Influenza enhances caspase-1 in bronchial epithelial cells from asthmatic volunteers and is associated with pathogenesis. J. Allergy Clin. Immunol. 130, 958-967 (2012).
- Ostrowski, L. E., Stewart, D., Hazucha, M. Interferon gamma stimulates accumulation of gas phase nitric oxide in differentiated cultures of normal and cystic fibrosis airway epithelial cells. Lung. 190, 563-571 (2012).
- Jardim, M. J., Fry, R. C., Jaspers, I., Dailey, L., Diaz-Sanchez, D. Disruption of microRNA expression in human airway cells by diesel exhaust particles is linked to tumorigenesis-associated pathways. Environ. Health Perspect. 117, 1745-1751 (2009).
- Horvath, K. M., Brighton, L. E., Herbst, M., Noah, T. L., Jaspers, I. Live Attenuated Influenza Virus (LAIV) induces different mucosal T cell function in nonsmokers and smokers. Clin. Immunol. 142, 232-236 (2012).
- Horvath, K. M. Nasal lavage natural killer cell function is suppressed in smokers after live attenuated influenza virus. Respir. Res. 12, 102 (2011).
- Noah, T. L. Tobacco smoke exposure and altered nasal responses to live attenuated influenza virus. Environ. Health Perspect. 119, 78-83 (2011).
