Summary
인간 자원 봉사자의 표면 부스러기 생검을 통해 얻은 비강 상피 세포, 조직 배양 인서트로 확장 및 전송됩니다. 포화 상태에 도달하면, 세포는 섬모와 비 섬모 세포의 문화를 산출, 공기 액체 계면에서 재배되고 있습니다. 차별화 된 비강 상피 세포 배양은 호흡기 점막을 공부 가능한 실험 모델을 제공합니다.
Abstract
사용하여 시험 관내 모델에서 인간의 기본 상피 세포가 미생물 감염이나 흡입 제제의 맥락에서 호흡기 상피 세포의 주요 기능을 이해하는데 필수적이다. 병에 걸린 집단에서 얻은 세포의 직접 비교는 우리가 서로 다른 표현형을 특성화하고 상피 세포의 기능의 변화를 매개하는 기본 메커니즘을 해부 할 수 있습니다. 인간 기관지 영역에서 상피 세포를 배양하는 것은 잘 설명 하였지만, 기관지 브러쉬 생검 획득과 관련된 인간 폐 조직 또는 침입의 가용성에 의해 제한된다. 비강 상피 세포가 훨씬 덜 침습적 피상적 인 코 부스러기 생검을 통해 얻은 및 과목은 유의 한 부작용과 여러 번 생체 조직 검사를 할 수 있습니다. 또한, 코 호흡 기계에 엔트리 포인트이고, 따라서 이러한 미생물 제제로서 공수 스트레스의 어떤 종류에 노출되는 제 사이트 중 하나, 오염 물질, 또는 알레르기.
간단히, 인간 지원자로부터 얻어진 비강 상피 세포를 코팅 조직 배양 플레이트 상에 전개 한 후 세포 배양 인서트 상에 전사된다. 포화 상태에 도달하면, 세포가 더 중요한 생리 학적 조건을 만들어 여러 주에 대해, 공기 - 액체 계면 (ALI) 배양 계속. ALI 배양 조건은 생산 섬모와 점액 양 세포와 인간의 비강 상피 세포와 유사한 형태 학적 및 기능적 특성을 나타내는 차별화 된 상피 세포로 이어지는 정의 미디어를 사용합니다. 차별화 된 비강 상피 세포와 조직 문화 삽입은 연구 질문 (되는 약물 치료, 렌티 바이러스 벡터, 가스에 노출, 또는 미생물 제제와 감염 전달)에 따라 다양한 방법으로 조작 및 이르기까지 수많은 다른 엔드 포인트에 대해 분석 할 수 있습니다 세포 및 분자 경로, 기능 채널제스, 형태 등
차별화 된 인간의 비강 상피 세포의 체외 모델에서 크게 생체 내에서 비강 상피 세포를 모방하는의 Organotypic 실험 모델을 사용하여 새로운 중요한 연구 문제를 해결하기 위해 조사를 가능하게 할 것이다.
Introduction
기술의 목표
기도의 상피 세포 (내피)은 직접적 병원균, 알레르기 또는 대기 오염 물질로 흡입 환경 스트레스에 노출되는 최초의 사이트 중입니다. 내피는 구조적인 장벽보다 더 : 그들은 수용성 매개체 4-6 자신의 계면 7-9 리간드 / 수용체의 발현의 출시를 통해 호흡기 면역 반응 1-3을 시작하고 조절하는 스위치 역할을합니다. 불멸화 세포주가 시험 관내에서 내피 호흡을 연구 모델로서 사용될 수 있지만, 이들은 생체 내에서 관찰되는 것과 유사한 편광 섬모 점액 생산 세포로 구성된 이종 세포 집단으로 분화하는 데 실패한다. 생체 내에서 관찰 호흡기 상피의 중요한 특성을 다시 요약 차기도 EC에 사용할 수있다. 따라서, 우리의 목표는 비강되는 EC (NECs)를 이용하여 우리의 방법을 최적화 할 수 있었다 지원자로부터 얻어진. NECs은 생체 내에서 볼 수있는 비강 상피의 많은 기능을 모방 차별화 NECs의 세포 배양 모델을 산출, 체외에서 확장 배양된다.
이론적 해석
생체 내 상황을 흉내 낸 인간의 기본 내피와 체외 모델의 사용은 -이 연구에 설명 된대로 - 질병의 EC의 특정 차이기도 상피 세포와 관련된 생리 학적 매개 변수 또는 내피와 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 연구하는 독특한 가능성을 제공합니다 이러한 수지상 세포 10 개, 자연 살해 세포 (11) 또는 대 식세포. 기존의 여러 방법이 bronchoscopies 동안 브러시 생검을 통해 침습적으로 얻을, 또는 그렇지 않으면 폐기 폐 조직 12-17에서 할 수있는 기관지 내피를 사용합니다. 또한, 완전히 차별화 된 인간기도 상피 세포 배양을 얻기 위해 상용 소스는 MatTek, 애쉬 랜드, MA, 클론 틱스에서 (EpiAirway 모델이 존재수사관이 다른 기증자를 선택할 수 있습니다 론자, 바젤, 스위스, Epithelix 사스에서 MucilAir, 스위스 제네바)에서. 그러나, 제한된 시판 상피 세포, 또는 파라미터의 소정 세트의 제한된 풀 중에서, 시판 차 인간기도되는 EC 획득과 관련된 비용 및 폐기 폐 조직 또는 갓 얻어진 인간 기관지 생검 조직에 제한된 액세스는 많은 연구자 금지 완전히 차별화 된 인간의기도 내피에서 연구를 수행하십시오. 따라서, 우리는 1) 비 침습적으로 얻을 인간 NECs을 이용 2) 차별화 된 인간기도 상피 세포의 문화를 산출하는 프로토콜을 제공하고, 3) 기존의 조직 문화 인프라와 대부분의 실험실 설정에서 재현 할 것이다 기술을 개발하기 위해 밖으로 설정합니다.
기존 기술 / 모델에 비해 장점
신선한 NECs을 획득, 기관지 또는 작은기도의 EC에 비해 훨씬 적게 침략, 개성적의 때 심각한 부작용과 여러 번 생체 조직 검사를 할 수 있고, 표면 코 부스러기 생검 그렇지 않으면 연구 관련 bronchoscopies 필요하지 것이다 병에 걸린 집단에 실시 할 수 있습니다. NECs을 얻기 침습 피상적 크레이프 생검 조사가 수행되는 연구 목적에 따라 등 연령, 성별, 질병 상태, 등, 도너 사양에게 선험적으로 설정하는 것을 허용한다. 조사 연구를 설계 할 때 따라서, 연구자는 상업 벤더, 또는 디자인 침략 기관지 연구에서 고가의 차별화 된 세포 배양 모델을 구입, 임상 적으로 사용 가능한 조직 / 상피 표본에 의해 제한되지 않습니다. 또, NECs를 얻기 쉽게 관찰 결과의 통계적 유효성을 강화하는 다른 공여자로부터 세포에서 실험을 수행 할 수있는 능력을 증가시킨다. 마지막으로, 코 공수 스트레스의 어떤 종류에 노출되는 제 사이트 중 하나이다. 따라서,에서의 Organotypic를 생성비강 상피를 흉내 체외 배양 시스템은 쉽게 세포 배양 시스템을 사용하여 달성 될 수있는 바이러스 입자, 오염 물질, 알레르겐, 또는 가스의 흡입을 연구하는데 유용하다.
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Protocol
1. 플라스틱 구조물을 준비 코트 플레이트
- 12 - 웰 플레이트의 각 웰에 500 μL의 PureCol (1:100은 멸균 수로 희석)를 추가합니다.
- 30 분 동안 인큐베이터에서 37 ° C에서 알을 품다, PureCol을 제거하고 세포가 플레이트에 추가하기 전에 HBSS의 권리와 린스 (아래 단계 3.1 참조).
2. 획득 및 인간 NECs의 전처리 생검
- 코 부스러기 생검
- 검경과 운영 이경에 9mm 재사용이 가능한 폴리 프로필렌 코 검경 (모델 22009)를 통해 직접 비전 아래 코 비갑개를 안감 피상적되는 EC (모델 21700)을 얻었다. 이 장치는 코 비갑개와 운동의 유연성을 최적의 시각화를 제공합니다.
- 머리를 약간 뒤로 기울거나 시험 테이블에 앙와위로 누워있는 스트레이트 백업 의자에 똑바로 앉아 주제와 조직 검사를 수행합니다.
- 콧 구멍에 이경 검경 및 하부 turbi를 삽입네이트는 조명으로 시각화.
- 비갑개의 뒷면에 말단 연장 끝으로 검경을 통해 멸균 열가소성 큐 렛을 삽입합니다.
- 비갑개의 하부 표면에 부드러운 압력을 사용하여 큐 레트는 점막 표면의 5 배에 걸쳐 그려진 후퇴합니다. 모세관 작용에 의해 개최 점막 세포의 성공적인 검색은 큐 렛의 컵에 분명 할 것이다.
- RPMI 1640 8 ㎖, 얼음에 전송을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 샘플을 놓습니다.
- 프로브를 검색 P-1000 피펫 코뿔소 조사에서 조직을 제거, 프로브를 폐기 집게를 사용하여
- 원심 분리기, 기음 뜨는 (주의 : 펠렛을 대기음하지 않도록주의를) (4 ° C에서 400 XG, 5 분) 펠렛.
- 100X DNA 분해 효소 1의 10 μL와 1 ㎖ BEGM에서 펠렛을 재현 탁.
- 실온에서 20 분 동안 품어.
- 원심 분리기 (4 ° C에서 400 XG, 5 분), 뜨는을 대기음하지 마십시오!
3. 에스플라스틱에 EED 셀 (0 일)
- 플레이트에서 PureCol를 제거하고 HBSS 린스 (도 1.2 단계 참조).
- (미디어의 메 니스 커스 (meniscus)가 아니라 중앙에 나타날 때까지 80 ~ 100 μL) 코팅 된 플레이트 (생검의 크기에 따라) 1-4 우물에 BEGM + + 미디어의 최소 볼륨을 추가합니다.
- 조심스럽게 너무 많은 미디어를 흡입하지 않고, 튜브에서 생검 조직의 펠렛을 제거하기 위해 P-1000 피펫을 사용합니다.
- , 우물의 중앙으로 펠렛을 전송 세포의 클러스터로 함께 생검을 유지하고, 하나의 세포 현탁액을 만들기 위해 분쇄하지 않습니다. 시드 할 수있는 4 개의 우물까지 좋은 생검을 얻을 수 있습니다. 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO 2,> 90 % 상대 습도)에 접시를 넣어.
- (메 니스 커스 (meniscus)을 방해하지 않고) 충분한 미디어가 있음을 보장하기 위해 두 시간 후에 확인합니다.
- 첫째날, 24 시간 후 파종 : 모든 우물의 모든 비 부착 세포 (경사 판을 수집하고 P-1000, C에서 세포와 미디어를 수집1.5 ㎖의 원심 분리 관에 ollect 모든 우물).
- 원심 분리기 (4 ° C에서 400 XG, 5 분).
- 세포 현탁액을 원심 분리하는 동안 : 0 일에 씨앗을 품고 세포에 BEGM + + 및 BEGM + 미디어 혼합물 250 μL의 250 μL를 추가합니다.
- 반복하여 비 부착 세포에 대한 3.1-3.5 단계를 반복합니다.
- 일 2-5 : 매일 세포의 변화 미디어,, 각 웰에 500 ㎕의 미디어를 추가 BEGM + + 미디어 단계적 (2 일의 양을 줄일 파종 후 : 125 μL BEGM + + 플러스 375 μL BEGM +, 파종 후 3 일째 다음과 같은 일 : 73 μL BEGM + + 플러스 427 μL BEGM +).
4. 플라스크에 세포 확대
- 매일 세포를 모니터, 그들은 다음과 같은 80-90% 자랄 때 (그들은 오래 걸릴 경우 보통 5-7 일 생검 후, 그들은 성공적으로 성장하지 않습니다) 리프트 세포에 도달하면 :; 0.25 % 트립신의 500 μl를 추가 조심스럽게 대기음 미디어 세포가 분리 될 때까지 잘 당은 (그것은 일반적으로 2 ~ 3 분 소요) 37 ° C에서 보관하십시오.
- 필요 준비15 ML 튜브에 간장 콩 트립신 억제제 (SBTI) (1 ML 트립신 당 750 μL)의 ED 볼륨.
- 반복적으로 피펫 팅에 의해 트립신 솔루션 아래 세포를 이동시키다, SBTI과 15 ML 원뿔 관에 전송 분리 된 세포.
- 세포와 튜브에 HBSS를 추가, 총 1 ㎖ HBSS에 모든 우물을 씻어.
- (4 ° C, 400 XG, 5 분) 펠렛 1 ㎖ BEGM + 미디어 매체에 resuspend을 흡인 튜브 와동에 원심 분리기.
- 펠릿의 크기에 따라 T25이나 T75 플라스크에 세포를 확장 (이 P1이며, 약 2 합류 우물 하나 T75 플라스크에 이동 한 합류가 아니라 하나의 T25 충분하다, 보통 2 합류 우물 하나 T75) 얻었다.
- (T75를위한 5 ㎖를 각각 T25 3 ML 각) 플라스크에 BEGM +를 추가합니다.
- 플라스크에 세포 현탁액을 추가합니다. 조직 문화 인큐베이터로 플라스크를 전송합니다.
- 24 시간 후 플라스크 - 파종 : 플라스크 (T25에 3 ㎖, T75을 10 ㎖)에 추가 BEGM + 미디어를 추가 할 수 있습니다.
5. 조직 문화 삽입에 셀을 시드
- 플라스크에서 용지를 제거하고 트립신 (T25를위한 3 ㎖, T75 플라스크 4 ml)에 추가합니다.
- 세포가 분리 될 때까지 37 ° C에서 알을 품다 (약 2 ~ 3 분).
- SBTI (1 ML 트립신 당 750 μL> T25, T75를위한 3 ㎖ 2.25 ㎖)을 15 ㎖의 튜브를 준비합니다.
- 아래 플라스크 테이핑과 피펫 팅하여 세포를 이동시키다 SBTI과 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 15 ML 튜브에 HBSS를 추가, HBSS (T25, T75 2 ML 1 ml)로 플라스크를 씻어.
- 원심 분리기(4 ° C, 400 XG, 5 분) 펠렛, 조심스럽게 뜨는을 제거합니다.
- 접시를 준비 시드가 될 수 있습니다 얼마나 많은 접시를 결정, 샘플 코드 번호, 통로 번호 (즉, P2) 및 날짜와 함께 접시에 레이블을. 기초 챔버에 700 ㎕의 BEGM + 미디어를 추가합니다.
- 튜브를 소용돌이로 교반하여 1 ㎖ BEGM ALI 매체에있는 세포 펠렛을 resuspend.
- 혈구와 세포를 카운트 (T25는 일반적으로 약 4 백만 세포를 생산, T75는 섬에 따라 최대 2000 만 셀을 가질 수 하나 12 - 웰 플레이트에 세포를 1 ~ 2 만 사용)와 함께 세포 현탁액을 희석 (접시 당 2.5 ml의 미디어 1.2 X 10 6 세포)를 접종해야 플레이트의 양에 필요한 총 볼륨 BEGM ALI 미디어 (주 :. 세포의 일부가 동결 할 경우, 튜브 라벨과 세포를 제거 여기에서 우리는 일반적으로) 미디어를 동결 2 ㎖에 2 × 10 6 세포를 동결
- 각 코팅 코닝 12well 셀의 정점 측에 200 ㎕의 세포 현탁액을 추가삽입 (>이 약 80,000-150,000 세포 / 삽입 될 것입니다; 0.4 ㎛의 기공 폴리 에스테르 (폴리에틸렌 테레 프탈레이트 (PET)) 막 삽입과 12mm의 트랜스 웰), 조직 문화 인큐베이터로 전송합니다.
- 24 시간 후, 정점 미디어 (200 μL 확장 매체)를 변경합니다.
- 세포 배양을 유지 : (BEGM ALI 미디어, 700 ㎕의 기저 200 ㎕의 정점) 미디어를 변경 매일. 삽입은 세포가 (단일 층에 구멍이 표시되지 않습니다) 완전히 합류 할 때까지 물속에 잠긴 유지해야합니다. 이 세포가 가장 가능성이 실행 가능하지 않습니다 이상 걸리는 경우 세포 수에 따라이 보통 2-6 사이의 일이 소요된다.
6. 일단 세포가 (트랜스 웰의 세포가 완전히 플루 때) 완전히 플루 있습니다 에어 리퀴드 인터페이스를 설정
- 세포는 48 시간 동안 500 ㎚ 레티노 산으로 보충 BEGM ALI 매체와 두 정점과 기저 미디어를 대체 완전히 합류가되면.
- 레티노 산을 추가 한 후 48 시간이 BEGM ALI 미디어를 보충 : PneumaCult-ALI 유지 보수 매체 (다음 제조 업체의 지침을) 준비 (기초 구획 보통 8.5 ㎖의 한 판을 위해) 필요한 매체의 양을 계산, 1 ㎖ 당 추가 완료 기본 중간 PneumaCult :
10 μL의 PneumaCult의 100 배 유지 보수 보충
2 μL (2 ㎎ / ㎖의 원액) 헤파린
(96 μL / ㎖의 원액) 5 μL 하이드로 코티손. - 모든 미디어를 제거하고 기저 측면 만 (혀끝의 측면에없는 매체)에 700 ㎕의 PneumaCult-ALI 유지 보수 미디어를 추가 할 수 있습니다.
- ALI에서 4 주 동안 세포 배양 유지 :
- 미디어에게 (수요일, 금요일 일정이 우리를 위해 잘 작동 월요일) 매일을 변경합니다.
- ALI에서 일주일이 지난 뒤, 주 (수요일) 일단 혀끝의 표면이 세척되어 조심스럽게 대기음, 인큐베이터에 10 분을 유지, 꼭대기면에 200 ㎕의 HBSS를 추가HBSS는 (HBSS를 흡입하는 피펫의 팁에 200 ㎕의 팁을 사용, 생물 안전 캐비닛의 진공 트랩에 부착 된 유리 피펫에 9를 사용한다.)
참고 : 변경 판 사이의 팁뿐만 아니라 기저 대 혀끝의 표면에서 갈 때 팁을 변경합니다. ALI에서 약 2 주 후, 세포를 구별하기 시작하고 속눈썹이 나타납니다. 세포 배양은 ALI에서 약 4 주 후에 전체의 분화에 도달합니다.
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Representative Results
NECs는 여기에 설명 된 프로토콜은 생체 내 상황 (그림 1)를 나타내는 섬모와 비 섬모 세포로 구성되는 EC의 유형이 다른 층으로 다시 구분 다음 배양. 차별화 된 NECs 중 일부는 (AB / PAS, 그림 1B를 사용하여 파란색으로 염색 세포)를 생산하는 점액이다. 여기에 제시된 프로토콜 최적화 되더라도, 분화는 전체적인 세포 집단 (점액 생산 세포 : 섬모 세포 즉 상이한 비율 비 섬모 세포)의 배포와 관련하여 변화 할 수 또는 심지어 더 편평 상피를 얻었다. 이러한 변화가 기증자의 인구에 의존하기 때문에 우리가 이전에 흡연자 18에서 NECs를 사용하여 시연 등의 기저 질환 표현형의 발생 반복 설을 나타낼 수 있습니다. 2가 다른 프로토콜 및 미디어 공식을 사용하여 차선의 재 분화 NECs의 예를 보여줍니다. 세포는 편평하며입방이나 섬모와 pseudostratified 호흡기 상피 세포 (그림 2)를 모방하지 않습니다.도
그림 1. 다시 차별화 된 인간의 NEC 문화. NECs이 4 % PFA로 고정하고 파라핀에 포함되었다. 배양 물 (19에 기재된 방법 다음) 헤 마톡 실린 및 에오신 (A) 및 알 시안주기 / 블루 산 - 쉬프 (B)로 염색 하였다. 이미지는 분명 조직 입방 구조, 점액을 생산하는 배 세포뿐만 아니라 섬모의 EC와 NECs을 보여줍니다.
그림 2. 헤 마톡 실린 및 에오신은 차선 문화의 파라핀 섹션 스테인드. 차선의 분화와 NEC의 문화. 세포가 편평 표시, 더 cuboida 없습니다L 구조, 아니 섬모 세포.
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Discussion
호흡의 EC는 외생 적 자극 (20)로부터 인체를 보호뿐만 아니라 수용성 매개체 또는 직접 수용체 리간드 세포 - 세포 상호 작용의 분비를 통해 시작하고 호흡기 면역 방어 반응 1-3을 조절하는 스위치 역할을하는 물리적 장벽뿐만 아니라를 제공합니다. 또한, 면역 반응의 EC의 역할을 연구하는 질병 개체군에서 내피 간의 전위차를 검사하거나, 내피에 외인성 스트레스의 효과를 연구하기 위해, 생체 내 상황 요점을 되풀이하는 것이 중요하다. 인간의기도는 섬모 세포, 술잔 세포와 기저 세포 (20)와 같은 다른 상피 세포를 포함하여 40 개 이상의 서로 다른 세포 유형 (20)를 포함한다. 우리의 프로토콜은 피상적 인 코 부스러기 생검은 크게 생체 내에서 비강 상피 세포를 모방하는 NEC의 문화를 산출, 다시 분화를 받아야 확대 배양 할 수 NECs을 산출하기 위해 처리 할 수있는 방법에 대해 설명합니다.
의 Organotypic 인간의 기본 차별화 NECs이 체외 모델의 사용은 다양한 응용 프로그램에 대해 고유 한 가능성을 제공합니다. 그것은 질병 NECs (예를 들면 낭포 성 섬유증, 천식, 흡연)의 특정의 차이, 질병의 기본 메커니즘뿐만 아니라 대기 오염 물질 (예를 들어, 오존, 디젤 배기 가스, 담배 연기) 18,21-23에 제어 노출을 공부하실 수 있습니다. 또한, 조직 문화 삽입에 성장 차별화 NECs는 제어 된 환경에서 세포 - 세포 상호 작용을 검사 할 수있는 다른 세포 유형 (예를 들어, 수지상 세포, 자연 살해 세포, 또는 대 식세포) 10, 11와 공동 문화에 자신을 빌려.
우리는 많은 이전에 발표 된 연구 24-27에서 사용 된 기관지 상피 세포를 배양 및 NECs 재 차별화를 설명하지. 의 사용에 비해 NECs의 사용이 바람직 할 수있는 이유를 우리는 여러 가지 이유로 볼기관지 내피. 첫째, 표면 코 부스러기 생검을 획득하는 브러시 생검을 얻기 위해 기관지 내시경을 수행하는 것보다 저렴합니다. 둘째, 기존 질환의 다양한 (예를 들면 천식을 절단)는 얻을 낮은기도 상피 세포에 대한 연구 관련 기관 지경을 실시하는 것은 비현실적이다. 그러나, 코뿔소 프로브와 하부 코의 비갑개의 하부 표면을 긁는의보다 적게 침략적인 절차는이 주제에 수행 할 수 있습니다. 셋째, 코 부스러기 생검은 큰 부작용없이 28 ~ 30 (생검 사이에 일반적으로 약 4 개월) 같은 사람을 여러 번 수행 할 수 있습니다. 넷째, NECs는 대기 오염 물질, 병원균이나 알레르기와 같은 환경 스트레스를 흡입에 노출 된 최초의 세포 중 하나이며, 따라서기도 상피 세포에서 이러한 스트레스의 효과를 연구하기 위해 체외 모델에서 중요한 나타냅니다.
재 다를 다양한 세포 배양 시스템entiated 인간의 EC는 (MatTek, 애쉬 랜드, MA, 론자에서 클론 틱스, 바젤, 스위스, Epithelix 사스에서 MucilAir, 스위스 제네바에서 예 EpiAirway 모델) 상업적으로 사용할 수 있습니다. 시판되는 세포 배양은 오랜 기간 동안 안정적으로 유지하고 잘 특징 지어진다. 그러나, 이들은 고가이며 연구는 일반적으로 상이한 개인들로부터 시료의 낮은 숫자로 제한된다. 또한,이 업체가 제시 여부에 따라 기증자의 인구를 제어하기가 어렵습니다. 갓 표면 부스러기 생검으로 NECs을 획득하는 수사관 (등 나이, 성별, 인종, 체중, 신체 질량 지수, 질병 상태, 약물 사용 등) 대상의 특성을 제어하고 잠재적 인 후속 뒤 다시 전화 자원 봉사자 수 최대.
일반적으로, ALI에서 다시 분화 인간의기도에 대한 모든 출판 프로토콜 (기관지 또는 비강도) EC에 유사한 절차를 포함 : obtainin을G 내피는 조직 배양 플라스크에서 세포를 확대하고, 다공성 세포 배양로 전송하면 ALI에서 차별화 삽입합니다. 프로토콜은 미디어, 성장 인자 보조제, 계대 수, 인서트의 코팅 및 ALI을 설정하기 전에 NECs의 활성화 분류 될. 하나의 프로토콜에서, 획득 및 소화 한 후, 세포는 비 코팅 인서트에 직접 씨앗을 품고 있습니다 만 사용 13 전에 ALI에서 며칠 보관하는 동안, 다른 프로토콜은 몇 주 동안 ALI 12,14,15에서 다시 분화 할 배양을 포함 . 콜라겐 등 세포 외 기질의 구성 요소 삽입을 코팅에 대한 더 일관성이 없다 : 어떤 프로토콜이 코팅을 필요로하지만 12,15 다른 코팅 인서트 (13, 14)를 사용합니다. 그러나, 배양 조건은 매우 중요 특히 인큐베이터 설정입니다. 5 %로 조절해야> 90 %가 될 필요가 상대 습도, 및 CO 2는 매우 아르중요한 요인은 ALI 세포 배양의 건조 방지 및 미디어를 버퍼링하는 데 도움이. 우리의 경험을 공유하기 위해, 우리는 더 100 % 성공률이 없다는 것을 여기서 언급 할. 일부 NEC 샘플 삽입을 준수하지 않거나 포화 상태에 도달하지 않습니다 반면 일부 코 부스러기 생검 샘플은 조직 배양 접시에 부착하지 않는다. 수년에 걸쳐, 여기에서 설명한 프로토콜을 사용하여 우리의 성공률은 약 80 %이다. 우리의 경험은 흡연자로 정의 된 질병 인구에서 NECs의 배양 건강한 비 흡연자에서 NECs보다 더 도전적인 것을 보여줍니다
인간의 기본 NECs의 배양에 대한 우리의 프로토콜은 우리가 수년에 걸쳐 최적화 된 몇 가지 주요 단계를 포함 : 1. 그들은 조직 배양 삽입에 시드 전에 NECs는 두 번 확장됩니다. 2. 삽입은 코팅에 사용됩니다. 3. 조직 배양 플레이트에 접종하면 NuSerum의 양은 단계적으로 세포가 조직 배양에서 리프트 오프 것을 방지하도록 감소된다접시. 4. NECs은 다시 분화 완료를 보장하기 위해 실험에 사용하기 전에 ALI 적어도 25-28일 유지됩니다. 요약하면, 여기에 설명 된 프로토콜은 ALI의 문화와 재 구별 인간 NECs에 최적화 된 프로토콜을 포함한다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
저자는 도움이 입력에 대한 리사 데일리에게 감사의 말씀을 전합니다.
이 작품은 건강의 국립 연구소 (ES013611 및 HL095163)에서 교부금에 의해 지원되었다, 승무원 의학 연구소 (FAMRI)과 환경 보호청 (CR83346301)과 이익에 대한 갈등을 선언하지 않습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 이 문서에서 설명하는 연구는 환경 의학, 천식 및 노스 캐롤라이나 채플 힐 대학의 폐 생물학을위한 센터와 협력 계약 CR83346301을 통해 미국 환경 보호국 (EPA)에 의해 부분적으로 투자되어 있지만, 그것은 대상이되지 않았습니다 기관의 요구 피어 및 정책 검토 및 따라서 반드시 기관의 의견을 반영하지 않으며, 공식적인 승인은 그렇게 유추해서도 안됩니다. 언급 OF 무역 이름 또는 상용 제품은 사용 승인 또는 추천을 의미하지 않습니다. 로레타 뮐러는 개인 교부금과 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Nasal speculum | Welch Allyn | Model 22009 | 9 mm, reusable polyproylene | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Operating otoscope | Welch Allyn | Model 21700 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Rhino probe cell cuvette | Arlington Scientific | SY-96-092 | bend the head of the cuvette a little more | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 12-well culture plates | Corning | 3512 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Transwell membrane cell culture inserts | Corning | 3460 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tissue culture flask | Corning | 430639 and 430641 | T25 and T75 vented flask | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| RPMI 1640 media (with L-Glutamine) | Gibco | 11875 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bronchial/Tracheal Epithelial Cell Growth Medium | Cell applications | 511-500 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| BEGM Bronchial Epithelial Cell Growth Medium | Lonza | CC-3170 | This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium Bicarbonate 7.5% solution | Gibco | 25080 | Use as it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NuSerum | BD Biosciences | 355104 | Use as it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| BAMBANKER freezing media | BAMBANKER | 302-14681 | Use as it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CoolCell | Biocision | HTBCS-136 | (CryoPrep alcohol-free cell freezing container) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PureCol | AdvancedBioMatrix | 5005-B | dilute 1:100 with sterile water (should be roughly 0.03 mg/ml)use 500 μl/well of a 12-well plate | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HBSS with Ca2 and Mg2+ | Gibco | 14025 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DNAse 1 | Sigma | DN25 | Dissolve at 1.5 mg/ml, which is a 100x solution, add 10 μl to each ml of media | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin, 0.25%, 1x, with phenol red | Gibco | 25200-056 | Use at it is | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Soy Bean Trypsin Inhibitor (SBTI) | Sigma | T6522 | Use dissolved in HBSS at a concentration of 1 mg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Retinoic acid | Sigma | R7632 | Make it up 100 μM stock solution (see below), dilute to 10 μM with absolute alcohol, take 5 μl of this and add it to 1 ml BEGM media (our working solution). All-trans Retinol has a coefficient of extinction of 52,480 in ethanol at 325 nm. Dissolve 25 mg in 50 ml absolute ethanol. Serial dilutions need to be made, dilute 50 ml of stock in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute ethanol, and again take 50 ml of this, dilute in 450 ml absolute Ethanol, take 100 ml of this and dilute in 900 ml absolute ethanol and read in the spectrophotometer at 325 nm, this number is then multiplied by its’ dilution factor, then divided by the extinction coefficient of 52,480, this will give a number in mM. Make a 100 mM stock (store at -20 °C) and from this stock a 10 mM aliquot is made, the daily retinoic acid needed would be 5 ml of this 10 mM aliquot in 995 ml ALI media. Example: 325nm reading is 1.15. 1.15 x 10,000 (dilution factor) / 52,480 = 0.219 = 219 mM, make a 100 mM stock from this, in absolute ethanol. |
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| DMEM high glucose (1x), liquid, with L-glutamine and sodium pyruvate | Gibco | 11995 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine Pituitary Extract | Gibco | 13028-014 | Used for BEGM ALI media. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Nystatin | Sigma | N4014-50 mg | Make up a solution of 3.3 mg/ml. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | Make up a solution of 10 mg/ml solution in milliQ water. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PneumaCult-ALI media | StemCell | 5001 | This comes as a kit of one bottle of medium and vials with supplements. For details see below. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Hydrocortisone | StemCell | 7904 | Dissolve 2.4 mg hydrocortisone in 1 ml ddH2O (used to make the 200x Hydrocortisone stock solution) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heparin Sodium Salt in PBS (2 mg/ml) | StemCell | 7980 | Use at it is. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Filter flasks (500 ml) | Corning | 431097 | 0.22 μm pore size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Filter tubes (50 ml) | Millipore | SCGP00525 | Steriflip, 0.22 μm pore size | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pipette tips - ART Barrier Tips | Molecular Bioproducts | 2139RI, 2069RI, 2179RI | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Conical tubes, sterile, 15 ml and 50 ml | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ddH2O, absolute ethanol, ice | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| CO2 incubator | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| refrigerated centrifuge | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| biological safety cabinet | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| pipettes (p2, p200, p1000), 9 in glass pipettes | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| gloves | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| lab coat with tight cuffs | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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References
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