Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

الكمي للاستجابة انفجر الجهاز التنفسي باعتبارها مؤشر الفطري المناعي الصحة في الزرد

doi: 10.3791/50667 Published: September 12, 2013

Summary

الاستجابة المناعية الفطرية يحمي الكائنات الحية من الإصابة الممرض. وثمة عنصر حاسم من الاستجابة المناعية الفطرية، وانفجر الجهاز التنفسي بلعمية، وتولد أنواع الاكسجين التفاعلية التي تقتل الكائنات الدقيقة الغازية. نحن تصف مقايسة انفجر الجهاز التنفسي يحدد مقدار أنواع الاكسجين التفاعلية تنتج عندما يتم الناجم عن الاستجابة المناعية الفطرية كيميائيا.

Abstract

انفجار الجهاز التنفسي بلعمية هي جزء من الاستجابة المناعية الفطرية للإصابة الممرض وينطوي على إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS). ROS سامة وتعمل على قتل الكائنات الحية الدقيقة phagocytized. في الجسم الحي الكمي للالمشتقة بلعمية ROS يوفر معلومات بشأن قدرة الكائن الحي على شن استجابة مناعية فطرية قوية. نحن هنا وصف بروتوكول لتحديد ومقارنة ROS في الأجنة الزرد كله على الحث الكيميائي للانفجار الجهاز التنفسي بلعمية. هذا الأسلوب يجعل من استخدام مركب غير الفلورسنت التي يصبح الفلورسنت على الأكسدة التي كتبها ROS. و pipetted الأجنة الزرد الفردية في آبار من صفيحة ميكروسكوبية والمحتضنة في هذا الركيزة الفلورة مع أو من دون محفز الكيميائية للانفجار في الجهاز التنفسي. وكميا مضان في كل بئر في نقاط زمنية المطلوب باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية. تم تعديل قراءات مضان للقضاء على مضان الخلفية ثم شاركmpared باستخدام المفردة اختبار t. يسمح هذا الأسلوب للمقارنة من احتمال انفجار الجهاز التنفسي الأجنة الزرد في مراحل تنموية مختلفة وردا على التلاعب التجريبية مثل ضربة قاضية البروتين، من overexpression، أو العلاج مع وكلاء الدوائية. ويمكن أيضا أن هذه الطريقة يمكن استخدامها لمراقبة استجابة انفجر الجهاز التنفسي في الكلى تشريح كله أو مستحضرات خلية من الكلى من الزرد الكبار وبعض أنواع الأسماك الأخرى. ونحن نعتقد أن البساطة النسبية والقدرة على التكيف من هذا البروتوكول سوف تكمل البروتوكولات القائمة وسوف تكون ذات فائدة للباحثين الذين يسعون إلى فهم أفضل للاستجابة المناعية الفطرية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويتكون الجهاز المناعي من فرعين: المناعة الفطرية والتكيفية. المناعة الفطرية هي أكثر تطويريا القديمة من الحصانة على التكيف. ويعتقد حاليا أن يكون اللافقاريات المناعة الفطرية فقط، في حين تمتلك كل من الفقاريات فروع الفطرية والتكيفية. في حين الحصانة التكيف يمنح الحصانة محددة وطويلة الأمد لبعض مسببات الأمراض، والحصانة الفطرية هو استجابة فورية لغزو البكتيريا، والفيروسات، والفطريات. أحد الجوانب الحاسمة للاستجابة المناعية الفطرية ينطوي على الإفراج عن السيتوكينات و chemokines، مما يؤدي إلى التهاب وتجنيد البالعات (مثل الضامة، العدلات) لابتلاع وتدمير الغزاة الأجانب.

الاستجابات المناعية الفطرية الناجحة تنطوي على: (1) الاعتراف الكائنات الدقيقة الغازية، (2) تحريض من أجهزة الطرد المركزي الإشارات المناسبة (على سبيل المثال الإفراج عن السيتوكينات وكيموكينات)، (3) التنمية السليمة / أعداد كافية من الخلايا البلعمية، (4) هجرة البالعات إلى مواقع الإصابة، (5) الإحاطة من مسببات الأمراض، و (6) تدمير الكائنات الحية الدقيقة غارقة. وهناك نقص في أي واحدة من هذه الخطوات يمكن أن تؤدي إلى المضيف طغيان، والخضوع ل، والعدوى. A الاستجابة المناعية الفطرية قوية أمر حيوي لصحة الكائنات الحية لأنها خط الدفاع الأول ضد مسببات الأمراض في جميع النباتات والحيوانات. في الفقاريات، فإنه يقوي أيضا الاستجابة المناعية التكيفية 1. لذا، فمن الأهمية بمكان أن نكون قادرين على تقييم جميع جوانب الاستجابة المناعية الفطرية من أجل فهم أفضل وذلك لتحسين وظيفتها.

وتستخدم العديد من الكائنات الحية نموذج لدراسة المناعة الفطرية، بدءا من Arabadopsis إلى C. ايليجانس لذبابة الفاكهة إلى الفئران إلى الخلايا البشرية المستزرعة. ميزة لاستخدام الزرد (دانيو rerio) نظام نموذجي لدراسة المناعة الفطرية هي أن الزرد هو الفقاريات، مع كل الفطرية والتكيفية ايمفقد المناعة، إلا أن تطور المناعة الفطرية والتكيفية يتم فصل زمنيا. الزرد تعتمد فقط على الحصانة الفطرية للوقاية من العدوى حتى يصبح الحصانة التكيف تعمل بكامل طاقتها، والذي يحدث بعد حوالي 4-6 أسابيع الإخصاب 2. بالإضافة إلى أدوات للتلاعب الجيني، والوضوح البصري، وتنمية الخارجية السريعة، والحصانة الفطرية كوضع مبدأ الدفاع في الأجنة الزرد توفر نموذج مبسط للدراسة تعقيدات الاستجابة المناعية الفطرية في الجسم الحي.

وقد وضعت بروتوكولات متعددة لتقييم جوانب مختلفة من الاستجابة المناعية الفطرية في الأجنة الزرد. والتحقق من صحتها وميكروأرس RNAseq أن ملامح خلوى التي تسببها الاستجابة المناعية الفطرية الزرد هي مماثلة لتلك التي للبشر ولقد اقترح أيضا إشراك الجينات غير متوقعة في المناعة الفطرية 3،4. شفافية الجنين الزرد والفلورسنت، transgenجيم سلالات من مسببات الأمراض والزرد تسمح لرؤية ديناميكية التفاعلات المضيف الممرض في الجسم الحي في الوقت الحقيقي. جعلت الأجنة الزرد المعدلة وراثيا معربا عن GFP تحت سيطرة العدلات محددة الميلوبيروكسيداز المروج 5،6 أو بلعم محددة MPEG1 المروج 7 من الممكن تصور وقياس الهجرة بلعمية إلى مواقع الالتهابات الموضعية 8 وكذلك لتصور البلعمة وتدمير fluorescently المسمى مسببات الأمراض 8،9. الأجنة الزرد هي أيضا قابلة للتوليد فحوصات عالية الإنتاجية وشاشات الكيميائية. وفقا لذلك، وقد تم مؤخرا تطوير أساليب إنتاجية عالية من التحليل Transcriptome على بناء 10 وإصابة الهجرة بلعمية إلى مواقع الإصابة التي يسببها كيميائيا 11.

من التقنيات المذكورة أعلاه، فإن أيا كميا تقييم المرحلة النهائية من الدمار من قبل الممرض البالعات. هذه المرحلة النهائيةينطوي على انفجار الجهاز التنفسي (أي إنتاج ريوس والمركبات السامة الأخرى)، والذي قتل مسببات الأمراض اجتاحت. أوكسيديز NADPH الانزيم هو المصدر الرئيسي للROS في الخلايا البلعمية. تجميع مفارز من نتائج انزيم أوكسيديز NADPH في نقل الإلكترونات إلى الأكسجين، وتوليد الأنيونات الفائق. من خلال التفاعلات الإنزيمية لاحقة، ويمكن بعد ذلك تحويلها الفائق في بيروكسيد الهيدروجين وحمض تحت الكلور (الشكل 1A). هو انفجار الجهاز التنفسي من البالعات الذي يقتل مسببات الأمراض وبالتالي، فإن القياس الكمي لإمكانات الجهاز التنفسي انفجار الأجنة الزرد يدل على صحة المناعة الفطرية بشكل عام. وضعنا مقايسة على أساس مضان لقياس انفجر الجهاز التنفسي في مجموعات من الأجنة الزرد الفردية 12. يستخدم هذا الاختبار في غير الفلورسنت، وانخفاض شكل، صبغة خلايا قابلة للاختراق متاحة تجاريا. هذه الصبغة، 2 '، 7'-dichlorodihydrofluorescein ثنائي الأسيتات (H2DCFDA)، يتم تحويلها إلى الفلوريةمجمع المائة، 2 '، 7'-dichlorofluorescein (DCF)، بناء على الأكسدة. يمكن للROS المتنوعة الناتجة عن انفجار الجهاز التنفسي بلعمية أكسدة H2DCFDA وتوليد مضان 24. ظهور مضان يمكن استخدامها لقياس ومقارنة استجابة انفجر الجهاز التنفسي بين مجموعات من الزرد. ويستخدم البروتين كيناز C خلات ناهض phorbol ميريستات (سلطة النقد الفلسطينية) للحث على كيميائيا أوكسيديز NADPH لإنتاج ريوس وبالتالي زيادة قراءات مضان (الشكل 1B). هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة من نسخة معدلة ومحسنة من هذا الجنين الزرد الجهاز التنفسي انفجار الفحص. هذا الاختبار يمكن استخدامها للمقارنة بين انفجار الجهاز التنفسي بين مجموعات من الأجنة الزرد الفردية مع مرور الوقت و / أو استجابة لالتلاعب التجريبية (مثل morpholino بوساطة البروتين ضربة قاضية). استخدام هذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع غيرها من فحوصات المناعة الفطرية الزرد، وتقديم صورة أكثر اكتمالا من المعقدة والحرجةالاستجابة المناعية الفطرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. رعاية الزرد والصيانة

  1. تربية: تفرخ قداس الزرد الكبار كما هو موضح سابقا 13. جمع الأجنة ولدت كما هو موضح سابقا 14.
  2. حقن مكروي (إذا رغبت): Microinject 1-4 مرحلة خلية الأجنة الزرد مع أليغنوكليوتيد] morpholino ضربة قاضية لمنتجات الجين أو مرنا إلى overexpress منتجات الجين كما هو موضح سابقا 15.
    1. الحفاظ على مجموعة كافية من الضوابط وهمية حقن (لا يقل عن 48 المعيشة، حقن وهمية الأسماك السيطرة و48 المعيشة، وهناك حاجة إلى التلاعب الأسماك تجريبيا لملء البئر صفيحة ميكروسكوبية 96).
  3. الحفاظ على الأجنة: نمو الأجنة في أطباق بتري العميق عند 28 درجة مئوية في الماء البيض (60 ميكروغرام / مل الفوري المحيط بحر الملح في الماء المقطر-تعقيمها) حتى المرحلة التنموية المنشودة (استجابة الجهاز التنفسي هو انفجار لا يمكن كشفها باستخدام هذا البروتوكول في الأجنة الزرد الذين تقل أعمارهم عن 2 يوما بعد الإخصاب 12). ملاحظة: لقد كان سbserved أن منع تصبغ في الأجنة الزرد إما عن طريق استخدام 1-2-فينيل ثيويوريا (PTU) أو الزرد متحولة golden/slc24a5 لا يغير كثيرا من تحريض من قبل سلطة النقد الفلسطينية مضان (بيانات غير منشورة، الأجنة اختبارها في 48، 72، و 96 HPF).
    1. إزالة الأجنة الميتة يوميا مع ماصة نقل البلاستيك.
    2. صب الماء بعناية البيض القديمة وتجديد بالماء بيضة جديدة يوميا.
  4. الأجنة Dechorionate: في يوم من التجربة والأجنة dechorionate (إن الأجنة لا تزال في chorions الخاصة بهم) كما هو موضح سابقا باستخدام اثنين من ملقط غرامة 14 (هذا الاندفاع فحص الجهاز التنفسي يمكن أيضا إجراء تشريح على الكلى من الزرد الكبار 12 و بروتوكولات مفصلة عن الكلى تشريح من الزرد الكبار وقد وصفت في وقت سابق 16،17).

2. إعداد الحل

  1. إعداد محلول المخزون من H2DCFDA: زن من 1 ملغ من H2DCFDA.
    1. ديssolve 1 ملغ من H2DCFDA في 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لجعل 1 ملغ / مل محلول المخزون.
    2. جعل مأخوذة 22 ميكرولتر من هذا الحل الأسهم في 1.7 مل أنابيب microcentrifuge.
    3. التفاف مأخوذة من H2DCFDA حل الأسهم في رقائق الألومنيوم والاحتفاظ بها في الظلام كلما كان ذلك ممكنا لأن H2DCFDA هو الحساسة للضوء.
    4. مأخوذة متجر H2DCFDA في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  2. تنبيه - إعداد محلول المخزون من خلات phorbol ميريستات (سلطة النقد الفلسطينية): زن من 1 ملغ من سلطة النقد الفلسطينية باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (مثل القفازات، نظارات واقية وقناع).
    1. حل سلطة النقد الفلسطينية في 1 مل من DMSO لجعل 1 ملغ / مل محلول المخزون.
    2. جعل 11 ميكرولتر مأخوذة في 1.7 مل أنابيب microcentrifuge.
    3. مخزن aliquots من سلطة النقد الفلسطينية حل السهم عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  3. يعد حل عمل H2DCFDA: في يوم من التجربة، وجعل الحل تعمل H2DCFDA بإضافة جزء 1 محلول المخزون H2DCFDA إلى 1جزء DMSO (500 ميكروغرام / مل H2DCFDA تركيز النهائي). على سبيل المثال، إضافة 20 ميكرولتر من محلول المخزون H2DCFDA و 20 ميكرولتر DMSO إلى رقائق ملفوفة 1.7 مل أنبوب microcentrifuge.
  4. يعد حل عمل سلطة النقد الفلسطينية: في يوم من التجربة، وجعل الحل تعمل سلطة النقد الفلسطينية وذلك بإضافة جزء 1 محلول المخزون سلطة النقد الفلسطينية إلى 49 أجزاء المياه nuclease حرة (20 ميكروغرام / مل تركيز النهائي سلطة النقد الفلسطينية). على سبيل المثال، وتمييع 10 ميكرولتر حل سلطة النقد الفلسطينية الأسهم في 490 ميكرولتر المياه nuclease خالية في أنبوب 1.7 مل ميكروسنتريفوج.
  5. إعداد الحل الجرعات من H2DCFDA: في يوم من التجربة، وجعل الحل الجرعات H2DCFDA مع تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل H2DCFDA في الماء البيض. يمكن تعديل وحدات التخزين أعدت للحلول الجرعات كما تريد، ولكن تأكد من أن تركيزات النهائي من الكواشف والحفاظ عليها. على الكلى، بدلا من الماء البيض، واستخدام نفس حجم medium/F-12 تعديل Dulbecco والنسر (50٪ DMEM، و 50٪ F-12، من دون أحمر الفينول). لجعل 5 مل من H2DCFDAالجرعات الحل، استخدم 5 مل ماصة المصلية لنقل 5 مل من الماء البيض (أو DMEM/F-12) إلى 15 مل المخروطية أنبوب الطرد المركزي ملفوفة في احباط وصفت 'H'.
    1. إزالة 10 ميكرولتر من المياه البيض (أو DMEM/F-12) من 15 مل أنبوب مخروطي المسمى 'H' وتجاهل.
    2. إضافة 10 ميكرولتر من الحل H2DCFDA العمل في أنبوب 15 مل المخروطية المسمى 'H' ودوامة لخلط (هذا الحجم يكفي لمدة 48 الجنين أو عينات الكلى (نصف كامل 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا) وسوف توفر هذه الآبار قياسات مستوى من مضان الخلفية).
  6. إعداد الحل الجرعات من H2DCFDA + سلطة النقد الفلسطينية: في يوم من التجربة، وجعل حل H2DCFDA + سلطة النقد الفلسطينية الجرعات مع تركيزات النهائي من: H2DCFDA - 1 ميكروغرام / مل وسلطة النقد الفلسطينية - 400 نانوغرام / مل. لجعل 5 مل من H2DCFDA + سلطة النقد الفلسطينية الحل الجرعات، استخدم 5 مل ماصة المصلية لنقل 5 مل من الماء البيض (أو DMEM/F-12) في أنبوب 15 مل المخروطية الجديد المسمى 'H + P'.
    1. إزالة 110 _6؛ لتر من الماء بيضة (أو DMEM/F-12) من 15 مل أنبوب مخروطي المسمى 'H + P' وتجاهل.
    2. إضافة 10 ميكرولتر من الحل H2DCFDA العمل، ثم إضافة 100 ميكرولتر من حل سلطة النقد الفلسطينية العاملة في أنبوب 15 مل المخروطية المسمى 'H + P' ودوامة لخلط (هذا الحجم يكفي لمدة 48 عينات أو النصف الآخر من كامل 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا ).
  7. الحفاظ على حلول الجرعات على الجليد.

3. صفيحة ميكروسكوبية قارئ البرمجة

  1. إعداد الصك: السلطة على القارئ صفيحة ميكروسكوبية.
    1. الاحماء مصدر الضوء.
    2. وضع برنامج لقراءة مضان: مثل الإثارة: 485 نانومتر؛ الانبعاثات: 528 نانومتر؛ بصريات الوظيفة: أعلى 510 نانومتر؛ الحساسية: 65، مع الهز الخطوة 5 ثانية قبل القراءة.

4. حسنا 96 صفيحة ميكروسكوبية إعداد (انظر الشكل 2)

  1. جمع اللوازم: الحصول الأطباق مع الأجنة dechorionated، أسود 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا، P200 pipettor ونصائح، دلو الثلج مع H2DCFDA وحلول الجرعات H2DCFDA + سلطة النقد الفلسطينية، P200 pipettor الأقنية، واثنين من الخزانات المعقمة، رقائق الألومنيوم، ومقص.
  2. نقل الأجنة واحد في كل بئر من 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا: استخدام مقص لقطع طرف ماصة بحيث الأجنة أو الكلى مناسبا من خلال فتح.
    1. تعيين pipettor P200 إلى 100 ميكرولتر ونقل جنين واحد جنبا إلى جنب مع الماء البيض (أو DMEM/F-12) إلى أكبر عدد ممكن من آبار سوداء 96 صفيحة ميكروسكوبية جيدا كما تريد (ليس من الضروري تغيير غيض ماصة لكل مختلفة عينة الجنين داخل حالة تجريبية، ولكن قد يكون من الضروري تغيير نصائح بين الظروف التجريبية). تأكد من تجنب نقل chorions المتبقية، وهذه تميل إلى الانحراف البيانات التي تم جمعها. لنقل الكلى، وهو pipettor حجم أكبر (لتعيين 100 ميكرولتر) يمكن استخدامها، ويمكن خفض نصائح ماصة للحصول على حجم أكبر تتحمل، إذا لزم الأمر. قد يكون من الضروري لدمج الآبار دون الجنين أو الكلى العينات، ولكن معالحلول الجرعات للسيطرة على بعض التلاعب التجريبية.
  3. إضافة حلول الجرعات: صب H2DCFDA الحل الجرعات في العقيمة 25 مل الخزان.
    1. استخدام الأقنية P200 pipettor وثمانية نصائح لماصة في وقت واحد 100 ميكرولتر من الحل H2DCFDA الجرعات في عمود واحد على البئر صفيحة ميكروسكوبية 96 (500 نانوغرام / مل تركيز النهائي من H2DCFDA).
    2. كرر هذا (تغيير نصائح ليس من الضروري) للعديد من كأعمدة كما تريد (عادة ستة أعمدة أو 48 بئرا إذا يملأ كامل صفيحة ميكروسكوبية 96 أيضا). إضافة إلى هذا الحل نصف العينات الجنين السيطرة والنصف من العينات الجنين التلاعب بشكل تجريبي (ويرد مثالا جيدا 96 صفيحة ميكروسكوبية حتى في الشكل 2، وهذه الآبار (برتقالي اللون) ستوفر البيانات مضان الخلفية في عينات لا يسببها مع سلطة النقد الفلسطينية) .
    3. صب الحل الجرعات H2DCFDA + سلطة النقد الفلسطينية في عالم جديد، خزان معقم 25 مل.
    4. استخدام الأقنية P200 pipettor وثمانية نصائح لsimultaneously ماصة 100 ميكرولتر من H2DCFDA + سلطة النقد الفلسطينية الحل الجرعات في الأعمدة المتبقية (باللون الأحمر في الشكل 2) من البئر صفيحة ميكروسكوبية 96 (تغيير نصائح ليست ضرورية، تركيزات النهائي من H2DCFDA-500 نانوغرام / مل وPMA-200 نانوغرام / مل) .
  4. تغطية صفيحة ميكروسكوبية بورق الألمنيوم.
  5. يهز صفيحة ميكروسكوبية لحوالي 20 ثانية في 150 دورة في الدقيقة إلى التجانس الحلول في كل بئر.
  6. احتضان صفيحة ميكروسكوبية عند 28 درجة مئوية عندما لا يتم قراءتها.

5. مضان الكمي

  1. قراءة صفيحة ميكروسكوبية في الوقت = 0 ساعة بعد إضافة سلطة النقد الفلسطينية باستخدام المعلمات هو موضح في الخطوة 3.1.2.
    1. مواصلة اتخاذ قياسات كل بضع دقائق لالفاصل الزمني المطلوب أو احتضان رقائق ملفوفة صفيحة ميكروسكوبية عند 28 درجة مئوية حتى نقطة وقت لاحق ومن ثم اتخاذ قياس نقطة النهاية في الوقت المطلوب (على سبيل المثال 4 ساعة بعد إضافة سلطة النقد الفلسطينية).
  2. استخدام ر البلاستيكاملحول ماصة لاسترداد الأجنة من الآبار.
  3. الموت ببطء الأجنة وفقا لرعاية الحيوان واستخدام البروتوكول، على سبيل المثال الانغماس في تريكين MS222.
  4. التخلص من صفيحة ميكروسكوبية ومواد أخرى يمكن التخلص منها في حاوية النفايات biohazardous.

6. تحليل البيانات

  1. البت في نقطة الوقت الذي كنت ترغب في مقارنة القيم مضان (على سبيل المثال 4 ساعة بعد إضافة سلطة النقد الفلسطينية، الجدول 1).
  2. طرح قيمة مضان متوسط ​​المجموعة الضابطة التي يسببها الغير من القيم مضان السيطرة على المجموعة الفردية سلطة النقد الفلسطينية التي يسببها لل.
  3. كرر هذا لصالح المجموعة التجريبية مع وبدون سلطة النقد الفلسطينية.
  4. تخزين هذه القيم مضان تطبيع في عمودين، ومراقبة + مجموعة سلطة النقد الفلسطينية وسلطة النقد الفلسطينية + مجموعة التجريبية (الجدول 2).
  5. حساب المتوسطات الحسابية والانحرافات المعيارية للقيم مضان تطبيع للسيطرة + سلطة النقد الفلسطينية الحبوع والتجريبية مجموعة + سلطة النقد الفلسطينية.
  6. مقارنة القيم مضان تطبيع باستخدام المفردة اختبار t لتحديد الدلالة الإحصائية (الجدول 2).
  7. الرسم البياني وسائل السيطرة + مجموعة سلطة النقد الفلسطينية وسلطة النقد الفلسطينية + مجموعة تجريبية مع أشرطة الخطأ تعكس الانحرافات المعيارية المناسبة.
  8. تسجيل مستوى الدلالة على الرسم البياني وفي أسطورة الرقم (الشكل 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

هنا، ونحن نقدم بيانات مقارنة استجابة انفجر الجهاز التنفسي في الأجنة الزرد (من النوع البري، AB الخلفية) في 48 و 72 ساعة بعد الإخصاب (HPF). 48 HPF الأجنة بمثابة المجموعة الضابطة لدينا و72 HPF الأجنة كمجموعة تجريبية لدينا. وكان حجم العينة المستخدمة 24 الأجنة التي يسببها للامم المتحدة و 24 الأجنة سلطة النقد الفلسطينية التي يسببها في مرحلة التطوير. تم الحصول على قراءات مضان الخام (في وحدات الإسفار النسبية (RFU)) من خلال قراءة صفيحة ميكروسكوبية بعد 4 ساعات إضافة سلطة النقد الفلسطينية. وتقدم القيم مضان الخام في الجدول 1. كانت القيم مضان الخام أعلى باستمرار في HPF الناجم عن الامم المتحدة الأجنة 48 من 72 HPF الناجم عن الامم المتحدة الأجنة، مع استثناء واحد الجنين 72 HPF (الوسائل: 48 HPF = 758 RFU، 72 HPF = 230 RFU). كان التباين داخل هذه العينتين متساوية تقريبا (الانحرافات المعيارية: 48 HPF = 549 ± RFU، 72 HPF = 513 ± RFU)، ولكن اختلفت المجموعة 72 HPF أكثر فيما يتعلق يعني (deviatio القياسيةن كنسبة مئوية من متوسط: 48 HPF = 72٪، 72 HPF = 223٪). في مجموعات سلطة النقد الفلسطينية التي يسببها، وكانت القيم مضان الخام في الغالب أعلى في عدد السكان HPF 72 (وسائل: 48 HPF سلطة النقد الفلسطينية = 3798 RFU، 72 HPF سلطة النقد الفلسطينية = 5825 RFU). كان هناك المزيد من التقلبات في المجموعة سلطة النقد الفلسطينية التي يسببها 72 HPF من المجموعة 48 HPF سلطة النقد الفلسطينية التي يسببها (الانحرافات المعيارية: 48 HPF سلطة النقد الفلسطينية = 831 RFU، 72 HPF سلطة النقد الفلسطينية = 1365 RFU)، ولكن التباين فيما يتعلق يعني متساوية تقريبا (48 HPF سلطة النقد الفلسطينية = 22٪، 72 HPF سلطة النقد الفلسطينية = 23٪).

لحساب التباين في مستويات خلفية مضان، تم حساب القيم مضان تطبيع (القيمة سلطة النقد الفلسطينية التي يسببها ناقص متوسط ​​القيم للامم المتحدة التي يسببها المرحلة التنموية المناسبة). يتم توفير هذه القيم مضان تطبيع في الجدول 2، جنبا إلى جنب مع الوسائل، الانحرافات المعيارية، وف قيمة للفئات 48 و 72 HPF. ويرد الرسم البياني من هذه البيانات في الشكل 2. القيم مضان تطبيع ومرحبا باستمرارgher في المجموعة 72 HPF من المجموعة HPF 48 (يعني: 48 HPF = 3040 RFU، 72 HPF = 5596 RFU) وتباين مماثل فيما يتعلق المتوسط ​​(48 HPF = 27٪، 72 HPF = 24٪). وكشف هذا الاندفاع فحص الجهاز التنفسي أن الأجنة الزرد 72 HPF قادرون على انتاج المزيد من ROS، وبالتالي شن استجابة أكثر قوة انفجار الجهاز التنفسي من 48 HPF الأجنة بعد الاستقراء مع سلطة النقد الفلسطينية. قد تكون هذه النتيجة بسبب زيادة عدد الخلايا، بما في ذلك زيادة عدد المحببة 18، في 72 HPF الأجنة مقارنة ب 48 HPF الأجنة. وأكد متحدث المفردة اختبار t لمقارنة البيانات إحصائيا أن الاستجابة انفجر الجهاز التنفسي تختلف اختلافا كبيرا في 72 HPF الأجنة من 48 HPF الأجنة (* ص = 2 X 10 -9).

بمعنى أعم، في ذلك الوقت نقطة = ر 0 ساعة بعد إضافة سلطة النقد الفلسطينية، لا ينبغي أن تكون القيم مضان الخام المختلفة إحصائيا بين سلطة النقد الفلسطينية والتي يسببها المجموعات التي يسببها للامم المتحدة. سوف القيم مضان الخام الزيادهه على مر الزمن في كل من العينات التي يسببها للامم المتحدة والتي يسببها، مع زيادة أكبر من ذلك بكثير تحدث في الأجنة سلطة النقد الفلسطينية التي يسببها 12. الزيادة في القيم مضان الخام في المجموعة سلطة النقد الفلسطينية التي يسببها، مقارنة مع المجموعة التي يسببها للامم المتحدة، وسوف تصبح ذات دلالة إحصائية بعد في حوالي 1-2 ساعات إضافة سلطة النقد الفلسطينية (اعتمادا على مرحلة تنموية من الأجنة الزرد، مع كبار السن تصاعد الأجنة استجابة أسرع انفجر الجهاز التنفسي من الأجنة الأصغر سنا). القيم مضان تطبيع (الناجم عن الامم المتحدة والتي يسببها ناقص) أن تزيد مع المرحلة التنموية المتزايدة من الأجنة الزرد، مع أكبر الفرق التي تحدث بين 48 و 72 ساعة بعد الإخصاب وفرق أصغر تحدث بين 72 و 96 التسميد آخر ساعة. يجب أن تكون أرقام مضان الخام 5 إلى 60 أضعاف في المجموعة النسبية سلطة النقد الفلسطينية التي يسببها للمجموعة التي يسببها للامم المتحدة، اعتمادا على مرحلة تنموية من الأجنة الزرد (بين 48 و 96 التسميد آخر ساعة). اختلافسوف تحدث بين الفرد عينات الأجنة الزرد، وبالتالي، فمن المستحسن أن ما يقرب من 24 عينة الجنين في العلاج استخدامها.

الشكل 1
الشكل 1. مخطط الحث الكيميائي للانفجار الجهاز التنفسي داخل بلعمية. (A) في هذا الاندفاع فحص الجهاز التنفسي، يتم استخدام سلطة النقد الفلسطينية للحث على إنتاج الشوارد الفائق بواسطة NADPH أوكسيديز. يتم تحويل الفائق إلى أكسجين وهيدروجين بيروكسيد بواسطة ديسموتاز الفائق. يتم تحويل بيروكسيد الهيدروجين وكلوريد الأنيونات إلى حمض تحت الكلور بواسطة الميلوبيروكسيداز. الصبغة غير الفلورسنت، H2DCFDA، يتم تحويلها إلى مجمع الفلورسنت، DCF، عندما يتأكسد من قبل العديد من ROS مختلفة. (B) رسم بياني لكيفية القياس الكمي لمضان هو قراءة للخروج من استجابة انفجر الجهاز التنفسي.

لتر = "الشكل 2" FO: محتوى العرض = "4.5in" سرك = "/ files/ftp_upload/50667/50667fig2.jpg" />
الشكل 2. التخطيطي من التصميم التجريبي للانفجار فحص الجهاز التنفسي. dechorionated الفردية يتم نقل الأجنة الزرد في الآبار بئر صفيحة ميكروسكوبية 96. الآبار الواردة في الأبيض تحتوي على أجنة التحكم والآبار الواردة في السوداء تحتوي على أجنة من المجموعة التجريبية. تضاف H2DCFDA أو H2DCFDA + سلطة النقد الفلسطينية الحلول الجرعات إلى الآبار المناسب (الملونة البرتقالي أو الأحمر، على التوالي). وكميا مضان باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية. ثم يتم تحليل البيانات مقايسة انفجر الجهاز التنفسي، ومقارنة، وقدم. الجدول في هذا الرقم هو مجموعة فرعية من القيم مضان تطبيع المعروضة في الجدول رقم 2. يتضمن الرسم البياني في هذا الرقم الوسائل، الانحرافات المعيارية وف قيمة لمجموعة البيانات بالكامل الواردة في هذا المخطوط، والتي يتم عرضها أيضا في الجدول رقم 2. * ص = 2 X 10 - 9.

1 "> 48 HPF 72 HPF 3955 2821 2220 5432 3702 6822 3268 4618 2411 5553 2984 6535 2970 5448 1767 3042 2110 4638 4010 5914 2975 4199 3220 8259 4266 5391 2212 5786 2953 7408 3474 5893 4386 4650 1240 4405 2226 6442 2553 5924 2785 5274 3870 5728 3879 5601 3530 8505 متوسط 3040 5596 STDEV 831 1365 P القيمة 2E-09

الجدول 1. القيم مضان الخام من الامم المتحدة التي يسببها (الخلفية البرتقالي) والتي يسببها (خلفية حمراء) 48 أو 72 ساعة آخر الإخصاب (HPF) الأجنة الزرد (أرقام بيضاء أو سوداء، على التوالي) في 4 ساعات بعد إضافة سلطة النقد الفلسطينية. يتم حساب متوسط ​​لعينات من الامم المتحدة التي يسببها.

</ آر>
48 HPF الأجنة 72 HPF الأجنة
408 326 358 92 83 208
276 381 1124 473 106 86
518 180 1085 110 93 109
1196 232 380 143 152 81
1416 339 735 123 85 81
489 390 347 98 118
2139 1183 1015 95 97 2609
1660 385 1630 111 115 136
متوسط 758 230
48 HPF embroys + سلطة النقد الفلسطينية 72 HPF الأجنة + سلطة النقد الفلسطينية
4713 2868 5144 3051 4868 4880
2978 4768 1998 5662 6144 4635
4460 3733 2984 7052 4429 6672
4026 3978 3311 4848 8489 6154
3169 5024 3543 5783 5621 5504
3742 2970 4628 6765 6016 5958
3728 3711 4637 5678 7638 5831
2525 4232 4288 3272 6123 8735

الجدول 2. التطبيع والمقارنة الإحصائية للبيانات. للحصول على القيم مضان تطبيع، وحساب الفرق بين كل قيمة مضان سلطة النقد الفلسطينية التي يسببها والتي يسببها للامم المتحدة القيمة المتوسطة المناسبة. مقارنة إحصائية هاتين المجموعتين من البيانات باستخدام المفردة اختبار t. حساب المتوسطات الحسابية والانحرافات المعيارية. عرض الوسائل، الانحرافات المعيارية، وقيمة ف (ق) في شكل رسوم بيانية (كما في الشكل 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الوظيفة الأساسية للالبالعات هو الكشف، تبتلع، وتدمير مسببات الأمراض. قدرة البالعات لإنتاج انفجار الجهاز التنفسي أمر بالغ الأهمية الكافية لهذه المهمة. وبالتالي، القياس الكمي للاستجابة انفجار الجهاز التنفسي هو أسلوب واحد للسماح للمقارنة بين الصحة العامة والمناعة الفطرية وظيفة بين مجموعات من الأفراد و / أو استجابة لالتلاعب التجريبية. هنا، نحن تصف البروتوكول للحث، كميا، ومقارنة استجابة انفجر الجهاز التنفسي بين مجموعات من الأجنة الزرد الفردية. وباختصار، سلطة النقد الفلسطينية النتائج في إنتاج ROS من قبل انزيم أوكسيديز NADPH. هذه ROS تعمل على صبغة الفلورسنت وغير ذلك أكسدة لتشكيل مجمع الفلورسنت. ويستخدم قارئ صفيحة ميكروسكوبية للكشف عن مضان النسبي في كل بئر. مضان المتولدة على سلطة النقد الفلسطينية الاستقراء يدل على احتمال انفجار الجهاز التنفسي والصحة العامة المناعة الفطرية الأجنة الزرد. مقارنة بين مستوى تطبيع الفلوريةcence بين سلطة النقد الفلسطينية مجموعات يسببها استخدام المفردة اختبار t يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان هناك فرق كبير في احتمال انفجار الجهاز التنفسي بين مجموعات من الزرد. سوف التلاعب التجريبية مما أدى إلى فروق ذات دلالة إحصائية في استجابة الجهاز التنفسي انفجار توفير نظرة ثاقبة آليات المناعة الفطرية، مثل المنتجات الجينات اللازمة لانفجار الجهاز التنفسي بلعمية، الأدوية التي تحفيز أو استعداء استجابة انفجر الجهاز التنفسي.

وقد وضعت بروتوكولات لفحص الجوانب المختلفة للاستجابة المناعية الفطرية في نموذج الزرد (انظر المقدمة). عدد قليل نسبيا من هذه التقنيات قياس إنتاج ريوس. تقنية مفصلة في هذه المقالة الكمي إنتاج ROS في الأجنة الزرد على تحفيز الاستجابة المناعية الفطرية لدى سلطة النقد الفلسطينية. هذه التقنية مشابهة لفحوصات انفجار الجهاز التنفسي التي أجريت على عينات الدم الكامل معزولة، والذي يستخدم في سلطة النقد الفلسطينية أيضا ايندوم استجابة انفجر الجهاز التنفسي، ومن ثم يتم قياس ROS إنشاؤها باستخدام الركيزة الفلورة (على سبيل المثال Phagoburst، Orpegen فارما). الطريقة الموصوفة هنا يمكن استخدامها مع الأجنة الزرد كله، وكذلك تشريح الكلى من الزرد الكبار 13، والكلى الأمامي الزرد هو مماثل لنخاع العظام البشرية، والذي هو موقع الكبار تكون الدم 19. الطريقة الموصوفة هنا هو أيضا مرنة بما فيه الكفاية ليتم استخدامها مع أنواع الأسماك الأخرى، ونظم الخلايا، مثل الخلايا الاستعدادات من الكلى المنوة 20.

طريقة بديلة للكشف عن ROS في الأجنة الزرد كله يجعل من استخدام بيروكسيد الهيدروجين في الجسم الحي الاستشعار. يتم حقن الرنا المرسال عن البروتين الفلوري حساسة الأكسدة في الأجنة الزرد ويتم مراقبة نسبة مضان بمرور الوقت التالية زعنفة الذيل اصابة 21. هذا الاستشعار الأكسدة المشفرة وراثيا يسمح التصور من الزمانية وديناميات المكاني للإنتاج بيروكسيد الهيدروجين في الجسم الحي. كشف تطبيق هذا الأسلوب نتيجة المستغرب أن بيروكسيد الهيدروجين تنتج صول سبقت البداية من أول الخلايا المناعية الفطرية، مما يشير إلى أن بيروكسيد الهيدروجين الصادرة عن الخلايا الظهارية الجرحى بمثابة إشارة لتجنيد البالعات 21. هذه التقنية، في حين قوية وغنية بالمعلومات، ويشمل تستغرق وقتا طويلا وإجراءات الجنينية والمجهري صعبة من الناحية التقنية. هذا الاستشعار الأكسدة هي أيضا محددة لبيروكسيد الهيدروجين، الذي هو واحد فقط من العديد من ROS تعمل خلال الاستجابة المناعية الفطرية.

بالمقارنة مع النهج التي نوقشت أعلاه، يقيس أيضا أسلوبنا في الجسم الحي ROS، وحتى الآن هو أقل تطلبا من الناحية الفنية ويستخدم مادة كيميائية لإحداث استجابة مناعية فطرية بدلا من الجرح الجسدي. على النقيض من الأسلوب أعلاه، والذي يقيس تحديدا إنتاج بيروكسيد الهيدروجين، يقيس الإجراء لديناالمستوى الإجمالي للROS. ميزة للكشف عن ROS واحد هو أن الأدوار لهذا المركب وحده في المناعة الفطرية يمكن توضيح. مماثلة إلى الطريقة التي نوقشت أعلاه، تشترك نهجنا أيضا مزايا وعيوب المتأصلة التي يتم تنفيذها في الحيوان كله. التفاعلات بين البالعات وبيئتها، والتي يتم حلها عندما يتم تنفيذ المقايسات انفجر الجهاز التنفسي على عينات الدم المعزولة، يتم الاحتفاظ في هذه المقايسات الحيوان كله. ومع ذلك، استخدام الحيوان كله المرجح النتائج في الكشف عن ROS من مصادر غير بلعمية (مثل mitochondrially المستمدة من ROS، nonphagocyte NADPH أوكسيديز). في محاولة للتصدي للخصوصية أسلوب لدينا للكشف عن ROS المستمدة بلعمية، أشرنا إلى الدراسة التي أجريت هذا الفحص التنفسي انفجار في الأجنة الزرد تفتقر بلعمية محددة NADPH أوكسيديز 9. كانت تحول دون بلعمية محددة NADPH أوكسيديز عبر بوساطة morpholino نهدم من p47phox أو p91pالبروتين هوكس. في الأجنة الزرد، في هذه المرحلة التنموية يعاير، يقتصر التعبير عن هذه مفارز NADPH أوكسيديز إلى مجموعة فرعية من خلايا الدم، من المحتمل الضامة 22،23. وكان احتمال انفجار الجهاز التنفسي من الأجنة التي تفتقر إلى بلعمية محددة NADPH أوكسيديز أن ما يقرب من ثلث من الضوابط 9 (الاتصالات الشخصية، والدكتور روبرت ويلر). وتشير هذه النتيجة أنه في حين أن لدينا الجهاز التنفسي انفجار فحص يفعل كشف ROS من مصادر أخرى غير البالعات، ويمكن أن يعزى معظم مضان الكشف عن لانفجار الجهاز التنفسي عن طريق بلعمية NADPH أوكسيديز. وقد تجلى المزيد من خصوصية هذا الاختبار باستخدام مكرر indolylmaleimide الأول (بيسى)، مثبط الدوائية للبروتين كيناز C، لمنع عمل سلطة النقد الفلسطينية، ناهض بروتين كيناز C، على NADPH أوكسيديز. أدت المعالجة المسبقة من سلطة النقد الفلسطينية الكلى الزرد التي يسببها أو الأجنة مع بيسى في مستويات مضان مماثلة لضوابط الامم المتحدة التي يسببها 12. والجهاز التنفسي المثاليسوف يكون فحص تنفجر في الجسم الحي الإنتاجية العالية مقايسة حيث بلعمية محددة ROS يمكن على حد سواء كميا وتصور مع مرور الوقت. حتى هذا ممكن، وطبيعة السريع وسهولة التقنية من الطريقة الموصوفة هنا يوفر بديلا مفيدا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أنوه أعضاء في الماضي والحاضر من المختبر كيم، مارك Nilan للرعاية الزرد والصيانة، والدكتور روبرت ويلر لإجراء مناقشات مفيدة وتبادل البيانات، والمعاهد الوطنية للصحة منح 3RO1GM087308-02S1 و1P20RR024475-01A2 ومين الزراعية والغابات تجربة محطة (عدد النشر 3303) للحصول على التمويل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instant Ocean Sea Salt Instant Ocean SS15-10
H2DCFDA Sigma Aldrich 35845-1G
PMA Fisher BP6851
DMSO Sigma Aldrich D2438-5X10ML
Tricaine S MS222 Western Chemical 100 grams
DMEM/F-12, No Phenol Red Life Technologies 11039-021
Deep Petri Dishes VWR 89107-632
Plastic Transfer Pipettes Fisher 13-711-7M
#5 Dumont Forceps Electron Microscopy Sciences 72700-D
1.7 ml Micro Centrifuge Tubes Axygen 10011-724
15 ml Conical Centrifuge Tubes VWR 21008-918
5 ml Serological Pipettes Greiner Bio One 606180
Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader BioTek Contact BioTek
Black 96 Well Microplate VWR 82050-728
25 ml Sterile Reservoirs VistaLab 3054-2003
P200 Pipettor Gilson F123601
Multichannel Pipettor VWR 89079-948
Pipette Tips VWR 89079-478

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Medzhitov, R., Janeway, C. A. Jr Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
  2. Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling. In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).
  3. Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection. J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).
  4. Ordas, A., Hegedus, Z., et al. Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection. Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).
  5. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation. Blood. 13, 3976-3978 (2006).
  6. Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish. J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).
  7. Ellett, F., Pase, L., et al. mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish. Blood. 4, 56-56 (2011).
  8. Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Infect. Immun. 11, 4542 (2010).
  9. Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth. Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).
  10. Rotman, J., van Gils, W., et al. Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription - Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. BMC Research Notes. 4, (2011).
  11. d'Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish. BMC Biology. 8, 151 (2010).
  12. Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos. Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).
  13. Avdesh, A., Chen, M., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).
  14. Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).
  15. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  16. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
  17. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
  18. Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  19. Davidson, A. J., Zon, L. I. The 'Definitive' (and 'Primitive') Guide to Zebrafish Hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
  20. Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque. Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).
  21. Niethammer, P., Grabher, C., et al. A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish. Nature. 459, 996-1000 (2009).
  22. Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). ZFIN Direct Data Submission. (2001).
  23. Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. ZFIN Direct Data Submission. (2004).
  24. Table 18.4. The Molecular Probes Handbook. 11th, Forthcoming.
الكمي للاستجابة انفجر الجهاز التنفسي باعتبارها مؤشر الفطري المناعي الصحة في الزرد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Goody, M. F., Peterman, E., Sullivan, C., Kim, C. H. Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish. J. Vis. Exp. (79), e50667, doi:10.3791/50667 (2013).More

Goody, M. F., Peterman, E., Sullivan, C., Kim, C. H. Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish. J. Vis. Exp. (79), e50667, doi:10.3791/50667 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter