Summary
Svaret medfødte immunforsvar beskytter organismer mod patogen infektion. En kritisk komponent af medfødte immunreaktion, fagocytten respirationsbølge genererer reaktive oxygenarter, der dræber invaderende mikroorganismer. Vi beskriver en respiratorisk burst analyse, der kvantificerer reaktive ilt arter produceret når medfødt immunrespons er kemisk induceret.
Abstract
Fagocytten respirationsbølge er en del af svaret på patogeninfektion medfødte immunsystem og indebærer fremstilling af reaktive oxygenarter (ROS). ROS er giftige og kan fungere til at dræbe fagocyteret mikroorganismer. In vivo kvantificering af fagocyt-afledte ROS giver oplysninger om en organismes evne til at montere en reaktion robust medfødte immunreaktion. Her beskriver vi en protokol til at kvantificere og sammenligne ROS i hele zebrafisk embryoner ved kemisk induktion af fagocytten respiratorisk burst. Denne metode gør brug af en ikke-fluorescerende forbindelse, der bliver fluorescerende ved oxidation af ROS. Individuelle zebrafisk embryoer pipetteres i brøndene på en mikroplade og inkuberet i dette fluorogent substrat med eller uden en kemisk inducer af den respiratorisk burst. Fluorescens i hver brønd kvantificeres ved ønskede tidspunkter ved hjælp af en mikropladelæser. Fluorescensaflæsninger justeres for at eliminere baggrundsfluorescens og derefter compared anvendelse af en uparret t-test. Denne metode giver mulighed for sammenligning af respiratorisk burst potentiale zebrafisk embryoner på forskellige udviklingsstadier, og som reaktion på eksperimentelle manipulationer såsom protein knockdown, overekspression eller behandling med farmakologiske midler. Denne metode kan også anvendes til at overvåge respirationsbølge respons i hele dissekeret nyrer eller cellepræparater fra nyrerne af voksne zebrafisk og nogle andre fiskearter. Vi mener, at den relative enkelhed og tilpasningsevne denne protokol skal supplere de eksisterende protokoller og vil være af interesse for forskere, der søger at bedre at forstå medfødt immunrespons.
Introduction
Immunsystemet består af to grene: medfødte og adaptive immunitet. Medfødte immunitet er evolutionært ældre end adaptiv immunitet. Hvirvelløse er i øjeblikket menes at have kun medfødte immunitet, mens hvirveldyr besidder både medfødte og adaptive grene. Mens adaptiv immunitet giver specifik og langvarig immunitet over for visse patogener, medfødte immunitet er en umiddelbar reaktion på invaderende bakterier, vira og svampe. Et afgørende aspekt af det medfødte immunforsvar omfatter frigivelse af cytokiner og kemokiner, hvilket resulterer i inflammation og rekruttering af fagocytter (f.eks makrofager, neutrofile) at opsluge og ødelægge udenlandske angribere.
Succesfulde medfødte immunrespons indebærer: (1) anerkendelse af invaderende mikroorganismer, (2) induktion af de relevante signalleringskaskader (fx frigivelse af cytokiner og kemokiner), (3) en ordentlig udvikling / passende antal fagocytceller, (4) Migration af fagocytter til sites med infektion, (5) engulfment af patogener, og (6) destruktion af opslugte mikroorganismer. En mangel på en hvilken som helst af disse trin kan føre til værten at blive overvældet af, og at bukke under for infektionen. Et svar robust medfødte immunforsvar er afgørende for sundheden for organismer, fordi det er den første linje i forsvaret mod patogener i alle planter og dyr. I hvirveldyr, er det også forstærker den immunrespons 1 adaptive. Derfor er det afgørende, at vi er i stand til at vurdere alle aspekter af medfødt immunrespons for bedre at kunne forstå det og optimere dens funktion.
Mange modelorganismer bruges til at undersøge medfødte immunitet, der spænder fra Arabadopsis til C. elegans til Drosophila til mus til dyrkede humane celler. En fordel ved at bruge zebrafisk (Danio rerio) modelsystem til at studere medfødte immunitet er, at zebrafisk er et hvirveldyr, med både medfødte og adaptive imFællesskab, men udviklingen af medfødte og adaptive immunitet er tidsmæssigt adskilt. Zebrafisk stole udelukkende på medfødte immunitet til beskyttelse mod infektion, indtil adaptiv immunitet bliver fuldt funktionel, hvilket sker omkring 4-6 uger efter befrugtningen 2. Ud over værktøjer til genetisk manipulation, optisk klarhed og hurtig, ekstern udvikling, medfødte immunitet som princippet form for forsvar i zebrafisk embryoner giver en forenklet model til at studere kompleksiteten i den medfødte immunrespons in vivo.
Der er udviklet flere protokoller til at vurdere forskellige facetter af det medfødte immunrespons i zebrafisk embryoner. Microarrays og RNAseq har valideret, at de cytokinprofiler fremkaldt af reaktionen zebrafisk medfødte immunsystem er på samme måde som mennesker, og har også foreslået inddragelse af uventede gener i medfødte immunitet 3,4. Gennemsigtigheden af zebrafisk embryoner og fluorescerende, transgenic stammer af patogener og zebrafisk mulighed for visualisering af dynamiske host-patogen interaktioner in vivo i realtid. Transgene zebrafisk embryoner udtrykker GFP under kontrol af neutrofil-specifik myeloperoxidase promotor 5,6 eller makrofag-specifikke MPEG1 promotor 7 har gjort det muligt at visualisere og kvantificere fagocyt migration til lokaliteter af lokaliserede infektioner 8 samt visualisere fagocytose og destruktion af fluorescensmærket patogener 8,9. Zebrafisk embryoner er også modtagelig for generation af high-throughput assays og kemiske skærme. Følgelig er for nylig blevet udviklet high-throughput metoder til transkriptom analyse efter infektion 10 og fagocytisk migration til lokaliteter af kemisk induceret skade 11.
Af de teknikker, der er anført ovenfor, kvantitativt ingen vurdere den afsluttende fase af ødelæggelse patogen af fagocytter. Denne sidste etapeindebærer en respiratorisk burst (dvs. produktion af ROS og andre giftige stoffer), som dræber opslugt patogener. Enzymet NADPH-oxidase er en væsentlig kilde af ROS i fagocyterende celler. Samling af underenhederne af NADPH-oxidase enzym resulterer i overførsel af elektroner til oxygen, genererer superoxidanioner. Gennem efterfølgende enzymatiske reaktioner, kan superoxid derefter omdannes til hydrogenperoxid og chlorundersyrling (figur 1A). Det er den respiratoriske burst af fagocytter der dræber patogener og dermed kvantificering af den respiratoriske burst potentiale zebrafisk embryoner er tegn på generelle medfødte immunforsvar. Vi udviklede en fluorescens-baserede assay at kvantificere det respiratoriske burst i grupper af individuelle zebrafisk embryoner 12. Dette assay udnytter ikke-fluorescerende, reducerede form af en kommercielt tilgængelig, celle-permeable farvestof. Dette farvestof, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (H2DCFDA), omdannes til de fluorescerendecent forbindelse, 2 ', 7'-dichlorfluorescein (DCF), ved oxidation. De forskellige ROS genereret af fagocytten respirationsbølge kan oxidere H2DCFDA og generere fluorescens 24. Fremkomsten af fluorescens kan anvendes til at kvantificere og sammenligne respirationsbølge reaktion mellem grupper af zebrafisk. Proteinkinase C agonist phorbolmyristatacetat (PMA) anvendes til kemisk inducere NADPH-oxidase til fremstilling af ROS og dermed øge fluorescensaflæsninger (Figur 1B). Heri giver vi en detaljeret protokol af en modificeret og optimeret version af denne zebrafisk embryo respirationsbølge assay. Dette assay kan bruges til at sammenligne den respiratoriske burst mellem grupper af individuelle zebrafisk embryoner over tid og / eller som reaktion på eksperimentelle manipulationer (fx morpholino-medieret protein knockdown). Brugen af denne metode, sammen med andre zebrafisk medfødte immunitet analyser, vil give et mere fuldstændigt billede af den komplekse og kritiskemedfødt immunrespons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Zebrafisk Vedligeholdelse
- Husbandry: Mass spawn voksen zebrafisk som tidligere beskrevet 13. Saml opfostrede embryoner som tidligere beskrevet 14.
- Mikroinjektion (om ønsket): Microinject 1-4 cell stage zebrafisk embryoner med morpholino oligonukleotider til knockdown genprodukter eller mRNA at overudtrykke genprodukter som tidligere beskrevet 15.
- Opretholde en tilstrækkelig pulje af mock injicerede kontroller (mindst 48 levende, mock injiceret kontrol fisk og 48 levende, eksperimentelt manipuleret fisk er nødvendige for at udfylde en 96 brønds mikroplade).
- Vedligehold embryoner: Grow embryoner i dybe petriskåle ved 28 ° C i æg vand (60 ug / ml Instant Ocean Sea Salt i destilleret vand-autoklaveres), indtil den ønskede udviklingsstadiet (en respiratorisk burst svar ikke kan påvises ved hjælp af denne protokol i zebrafisk embryoner yngre end 2 dage efter befrugtningen 12). Bemærk: Det har været observed at forhindre pigmentering i zebrafisk embryoner enten gennem brug af 1-phenyl 2-thiourinstof (PTU) eller golden/slc24a5 mutant zebrafisk ændrer ikke signifikant induktion af fluorescens ved PMA (upublicerede data, testet ved 48, 72 embryoner og 96 HPF).
- Fjern døde embryoer dagligt med en plastik transfer pipette.
- Dekanteres forsigtigt gamle æg vand og genopbygge med nye æg vand dagligt.
- Dechorionate embryoner: På dagen for eksperimentet, dechorionate embryoner (hvis embryoner er stadig i deres chorions) som tidligere beskrevet ved hjælp af to fine tænger 14 (denne respiratorisk burst analyse kan også udføres på dissekerede nyrer fra voksne zebrafisk 12 og detaljerede protokoller for nyre dissektion fra voksne zebrafisk er tidligere blevet beskrevet 16,17).
2. Solution Preparation
- Forbered en stamopløsning af H2DCFDA: Afvej 1 mg H2DCFDA.
- Dissolve 1 mg H2DCFDA i 1 ml dimethylsulfoxid (DMSO) for at gøre en 1 mg / ml stamopløsning.
- Lav 22 ul portioner af denne stamopløsning i 1,7 ml mikrocentrifugerør.
- Wrap portioner af H2DCFDA stamopløsning i aluminiumsfolie og holde i mørke når det er muligt, fordi H2DCFDA er lysfølsomt.
- Store H2DCFDA portioner ved -20 ° C i op til 3 måneder.
- ADVARSEL - Forbered en stamopløsning af phorbolmyristatacetat (PMA): Afvej 1 mg PMA bruge personlige værnemidler (dvs. handsker, beskyttelsesbriller og maske).
- Opløs PMA i 1 ml DMSO at 1 mg / ml stamopløsning.
- Lav 11 pi portioner i 1,7 ml mikrocentrifugerør.
- Store portioner af PMA stamopløsning ved -80 ° C i op til 3 måneder.
- Forbered en arbejdsgruppe løsning H2DCFDA: På dagen for eksperimentet, lave en H2DCFDA arbejder ved tilsætning af 1 del H2DCFDA stamopløsning til 1del DMSO (500 ug / ml H2DCFDA slutkoncentration). For eksempel tilsættes 20 pi H2DCFDA stamopløsning og 20 pi DMSO til en folieomvikling 1,7 ml mikrocentrifugerør.
- Forbered en arbejdsgruppe løsning af PMA: På dagen for eksperimentet, lave en PMA arbejder ved tilsætning af 1 del PMA stamopløsning til 49 dele nukleasefrit vand (20 mg / ml PMA endelig koncentration). For eksempel fortyndes 10 pi PMA stamopløsning i 490 pi nuclease frit vand i et 1,7 ml mikrocentrifugerør.
- Forbered en dosering opløsning H2DCFDA: På dagen for eksperimentet, lave en H2DCFDA dosering løsning med en endelig koncentration på 1 mg / ml H2DCFDA i æg vand. De fremstillede mængder af doseringsopløsningerne kan modificeres som ønsket, men sikre, at de endelige koncentrationer af reagenserne bibeholdes. For nyrer, i stedet for æg vand, brug den samme mængde Dulbeccos modificerede Eagles medium/F-12 (50% DMEM, 50% F-12, uden phenolrødt). For at gøre 5 ml H2DCFDAdosering løsning, skal du bruge en 5 ml serologisk pipette til at overføre 5 ml æg vand (eller DMEM/F-12) i en 15 ml konisk centrifugerør pakket i folie og mærket 'H'.
- Fjern 10 pi æg vand (eller DMEM/F-12) fra de 15 ml konisk rør mærket "H" og kasseres.
- Tilsæt 10 ul H2DCFDA arbejder opløsningen i 15 ml konisk rør mærket "H" og vortex at blande (denne mængde er nok til 48 embryo eller nyreprøver (halvdelen af en fuld 96 godt mikroplade), og disse brønde vil give målinger af niveauet af baggrundsfluorescens).
- Forbered en dosering opløsning H2DCFDA + PMA: På dagen for eksperimentet, lave en H2DCFDA + PMA dosering løsning med endelige koncentrationer af: H2DCFDA - 1 mg / ml og PMA - 400 ng / ml. For at gøre 5 ml H2DCFDA + PMA dosering løsning, skal du bruge en 5 ml serologisk pipette til at overføre 5 ml æg vand (eller DMEM/F-12) i en ny 15 ml konisk rør mærket "H + P '.
- Fjern 110 _6, l æg vand (eller DMEM/F-12) fra de 15 ml konisk rør mærket "H + P 'og kasseres.
- Tilsæt 10 ul H2DCFDA arbejder løsning, hvorefter der tilsættes 100 ul PMA arbejder opløsningen i 15 ml koniske rør mærket "H + P 'og vortex at blande (denne mængde er nok til 48 prøver eller den anden halvdel af en fuld 96 godt mikroplade ).
- Hold doseringsopløsningerne på is.
3. Mikropladeaflæser Programmering
- Forbered instrument: Tænd mikropladelæseren.
- Varm op lyskilden.
- Opsæt et program til at læse fluorescens: f.eks Excitation: 485 nm, emission: 528 nm, Optik Position: top 510 nm, Følsomhed: 65, med en 5 sek ryste skridt forud for læse.
4.. 96-brønds mikroplade opsætning (se figur 2)
- Samle forsyninger: Opnå retter med dechorionated embryoner, sort 96 brønds mikroplade, P200 pipettor ogtips, isspand med H2DCFDA og H2DCFDA + PMA dosering løsninger multikanal P200 pipette, to sterile reservoirer, aluminiumsfolie og saks.
- Overførsel ét embryon i hver brønd på en 96 brønds mikroplade: Brug en saks til at klippe en pipettespids sådan, at embryoner eller nyrer fit gennem åbningen.
- Indstil en p200 pipette til 100 pi og overføre et embryon sammen med æg vand (eller DMEM/F-12) i så mange af brønde i en sort 96-brønds mikroplade som ønsket (det er ikke nødvendigt at ændre pipettespidsen for hver forskellig embryo prøven inden for en eksperimentel betingelse, men det kan være nødvendigt at ændre tip mellem eksperimentelle betingelser). Vær sikker på at undgå at overføre resterende chorions, da disse har en tendens til at forvrænge de indsamlede data. Til overførsel af nyrer, kan et større volumen pipette (sat til 100 ul) skal anvendes, og pipettespidser kan skæres for at opnå en større boring størrelse, hvis det er nødvendigt. Det kan være nødvendigt at inkorporere brønde uden embryoner eller nyreprøver, men meddoseringsopløsningerne at kontrollere for nogle eksperimentelle manipulationer.
- Tilføj forsøgsopløsningerne: Hæld H2DCFDA dosering opløsning i en steril 25 ml reservoir.
- Brug en multikanal P200 pipette og otte tips til samtidigt Tilsæt 100 ul H2DCFDA dosering løsning i en kolonne på 96 brønds mikroplade (500 ng / ml slutkoncentration H2DCFDA).
- Gentag dette (skiftende tip er ikke nødvendigt) for så mange kolonner som ønsket (normalt seks kolonner eller 48 brønde, hvis fylde en hel 96 godt mikroplade). Føj denne løsning til halvdelen af de kontrol-embryo prøver og halvdelen af de eksperimentelt manipulerede embryo prøver (et eksempel 96 brønds mikroplade oprettet er vist i figur 2, disse brønde (farvet orange) vil give baggrundsfluorescens data i prøver ikke induceret med PMA) .
- Hæld H2DCFDA + PMA dosering opløsning i en ny, steril 25 ml reservoir.
- Brug en multikanal P200 pipette og otte tips til simultaneously Tilsæt 100 pi H2DCFDA + PMA dosering løsning til de resterende søjler (rød farve i figur 2) i 96 brønds mikroplade (skiftende tip er ikke nødvendigt, slutkoncentrationer på H2DCFDA-500 ng / ml og PMA-200 ng / ml) .
- Dæk mikropladen med alufolie.
- Ryst mikropladen cirka 20 sekunder ved 150 rpm for at homogenisere løsningerne i hver brønd.
- Inkuberes mikropladen ved 28 ° C, når den ikke bliver læst.
5.. Fluorescens Kvantificering
- Læs mikropladen ved tid = 0 timer efter tilsætningen af PMA anvendelse af de parametre, der er beskrevet i trin 3.1.2.
- Fortsæt med at tage målinger hvert par minutter for den ønskede tidsinterval eller inkuberes folien indpakket mikroplade ved 28 ° C, indtil et senere tidspunkt, og derefter tage et slutpunkt måling på et ønsket tidspunkt (fx 4 timer efter tilsætning af PMA).
- Brug en plastik transfer pipette til at hente de embryoner fra brøndene.
- Aflive embryoner i henhold til dit dyr pleje og brug protokol, fx nedsænkning i tricaine MS222.
- Bortskaf mikropladen og andre disponible materialer i biologisk farligt affald container.
6.. Dataanalyse
- Beslut om tidspunkt hvor du gerne vil sammenligne fluorescens værdier (fx 4 timer efter tilsætning af PMA, tabel 1).
- Fratræk den gennemsnitlige un-induceret kontrol gruppens fluorescens værdi fra den enkelte PMA-induceret kontrol koncernens fluorescens værdier.
- Gentag dette for forsøgsgruppen med og uden PMA.
- Opbevar disse normaliserede fluorescens i to søjler, kontrol + PMA-gruppen og eksperimenterende + PMA-gruppen (tabel 2).
- Beregn midler og standardafvigelser for de normaliserede fluorescens værdier af kontrol + PMA group og den eksperimentelle + PMA gruppe.
- Sammenlign de normaliserede fluorescens værdier anvendelse af en uparret t-test til (tabel 2) bestemme statistisk signifikans.
- Graf midlerne til kontrolgruppen + PMA-gruppen og eksperimenterende + PMA-gruppen med fejlsøjler afspejler de relevante standardafvigelser.
- Optag signifikansniveau på grafen og figurteksten (figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her giver vi data, der sammenligner det respiratoriske burst respons i zebrafisk embryoner (vildtype, AB baggrund) ved 48 og 72 timer efter befrugtning (HPF). De 48 HPF embryoner fungeret som vores kontrolgruppe og de 72 hpf embryoner som vores forsøgsgruppe. Stikprøvens størrelse blev anvendt, var 24 un-inducerede embryoner og 24 PMA-inducerede embryoner pr udviklingsstadiet. Rå fluorescensaflæsninger (i relative fluorescensenheder (RFU)) blev opnået ved at læse mikropladen 4 timer efter tilsætningen af PMA. Rå fluorescens værdier er angivet i tabel 1. Rå fluorescens værdier var konsekvent højere i de 48 HPF un-induceret embryoner, end de 72 HPF un-induceret embryoner, med undtagelse af en 72 HPF embryo (middel: 48 HPF = 758 RFU, 72 HPF = 230 RFU). Variabiliteten inden for disse to prøver var omtrent lige (standardafvigelser: 48 HPF = ± 549 RFU 72 HPF = ± 513 RFU), men 72 HPF gruppe varierede mere med hensyn til den gennemsnitlige (standard deviation som en procentdel af den gennemsnitlige: 48 HPF = 72%, 72 HPF = 223%). I PMA-inducerede grupper var rå fluorescens-værdier for det meste højere i 72 HPF befolkning (middel: 48 hpf PMA = 3798 RFU, 72 hpf PMA = 5825 RFU). Der var mere variation i 72 HPF PMA-induceret gruppen end i 48 HPF PMA-induceret gruppe (standardafvigelser: 48 HPF PMA = 831 RFU, 72 HPF PMA = 1365 RFU), men variation med hensyn til gennemsnitlig var ca (48 HPF PMA = 22%, 72 HPF PMA = 23%).
For at tage højde for variabiliteten i baggrundsniveauer af fluorescens blev normaliseret fluorescens beregnede værdier (PMA-induceret minus gennemsnittet af de un-inducerede værdier af den passende udviklingsstadiet). Disse normaliserede fluorescens værdier er angivet i tabel 2, sammen med de midler, standardafvigelser og p-værdi for de 48 og 72 hpf grupper. En graf af disse data er tilvejebragt i figur 2. De normaliserede fluorescens-værdier er konsekvent higher i 72 HPF gruppen end i 48 HPF gruppen (forstås: 48 HPF = 3040 RFU 72 HPF = 5596 RFU) og variabilitet er ens med hensyn til den gennemsnitlige (48 HPF = 27%, 72 HPF = 24%). Denne respiratorisk burst assay viste, at 72 HPF zebrafisk embryoner er i stand til at producere mere ROS og derfor montere en mere robust respiratorisk burst respons end 48 hpf embryoner efter induktion med PMA. Dette resultat kan skyldes en stigning i antallet af celler, herunder en øget antal granulocytter 18, i 72 HPF embryoer sammenlignet med 48 HPF embryoner. En uparret t-test for statistisk sammenligne data bekræftede, at den respiratoriske burstrespons er væsentlig forskellig i 72 HPF embryoner end 48 HPF embryoner (* p = 2 x 10 -9).
I en mere generel forstand på det tidspunkt t = 0 timer efter tilsætning af PMA, de rå fluorescens værdier bør ikke være statistisk forskellig mellem PMA-inducerede og FN-inducerede grupper. De rå fluorescens værdier stigendee over tid i både FN-inducerede og inducerede prøver, med en langt større stigning forekommer i PMA-inducerede embryoner 12. Stigningen i de rå fluorescens værdier i PMA-induceret gruppe sammenlignet med den ikke-inducerede gruppe, bliver statistisk signifikant på cirka 1-2 timer efter tilsætning af PMA (afhængig af udviklingsstadiet af zebrafisk embryoner med ældre embryoner montering af en hurtigere respirationsbølge respons end yngre embryoner). Normaliserede fluorescens-værdier (induceret minus un-induceret) skal stige med den stigende udviklingsstadiet af zebrafisk embryoner med den største forskel forekommer mellem 48 og 72 timer efter befrugtning og en mindre forskel forekommer mellem 72 og 96 timer efter befrugtningen. Rå fluorescens numre bør være 5 til 60 gange højere i PMA-inducerede gruppe i forhold til den ikke-inducerede gruppen, afhængigt af udviklingsstadiet af zebrafisk embryoner (mellem 48 og 96 timer efter befrugtning). Variationvil forekomme mellem de enkelte zebrafisk embryo prøver, således, anbefales det, at cirka 24 embryo prøver pr behandling anvendes.
Figur 1. Diagram af kemisk induktion af det respiratoriske burst inden en phagocyt. (A) I dette respirationsbølge assay PMA anvendes til at inducere produktion af superoxidanioner af NADPH-oxidase. Superoxid omdannes til oxygen og hydrogenperoxid af superoxiddismutase. Brintoverilte og chloridanioner omdannes til hypochlorsyre ved myeloperoxidase. Den ikke-fluorescerende farvestof, H2DCFDA, omdannes til fluorescerende forbindelse, DCF, når oxideret ved mange forskellige ROS. (B) Diagram over hvordan kvantificering af fluorescens er en skrivebeskyttet ud af respirationsbølge respons.
lt = "Figur 2" fo: content-width = "4.5in" src = "/ files/ftp_upload/50667/50667fig2.jpg" />
Figur 2. Skematisk af eksperimentelle design for respirationsbølge assay. Individuel dechorionated zebrafisk embryoner overføres til brøndene i en 96-brønds mikroplade. Brøndene, der er skitseret i hvid indeholde kontrolelementer embryoner og brøndene er skitseret i sort indeholder embryoner fra den eksperimentelle gruppe. Tilføjes H2DCFDA eller H2DCFDA + PMA dosering løsninger til de relevante brønde (farvet orange eller rød, henholdsvis). Fluorescens er kvantificeret ved hjælp af en mikropladelæser. Respirationsbølge assay data er derefter analyseret, sammenlignet og fremlagt. Tabellen i denne figur er en delmængde af de normaliserede fluorescens værdier, der vises i tabel 2.. Grafen i dette tal omfatter de midler, standardafvigelser og p-værdi for hele data præsenteres i dette manuskript sæt, som også vises i tabel 2. * P = 2 X 10 - 9.
Tabel 1. Rå fluorescens værdier fra un-induceret (orange baggrund) og induceret (rød baggrund) 48 eller 72 timer efter befrugtning (HPF) zebrafisk embryoner (hvide eller sorte tal, henholdsvis) ved 4 timer efter tilsætningen af PMA. Gennemsnittet er beregnet for de FN-inducerede prøver.
| 48 HPF embryoner | 72 HPF embryoner | ||||
| 408 | 326 | 358 | 92 | 83 | 208 |
| 276 | 381 | 1124 | 473 | 106 | 86 |
| 518 | 180 | 1085 | 110 | 93 | 109 |
| 1196 | 232 | 380 | 143 | 152 | 81 |
| 1416 | 339 | 735 | 123 | 85 | 81 |
| 489 | 390 | 347 | 98 | 118 | |
| 2139 | 1183 | 1015 | 95 | 97 | 2609 |
| 1660 | 385 | 1630 | 111 | 115 | 136 |
| Mean | 758 | 230 | |||
| 48 HPF embroys + PMA | 72 HPF embryoner + PMA | ||||
| 4713 | 2868 | 5144 | 3051 | 4868 | 4880 |
| 2978 | 4768 | 1998 | 5662 | 6144 | 4635 |
| 4460 | 3733 | 2984 | 7052 | 4429 | 6672 |
| 4026 | 3978 | 3311 | 4848 | 8489 | 6154 | </ Tr>
| 3169 | 5024 | 3543 | 5783 | 5621 | 5504 |
| 3742 | 2970 | 4628 | 6765 | 6016 | 5958 |
| 3728 | 3711 | 4637 | 5678 | 7638 | 5831 |
| 2525 | 4232 | 4288 | 3272 | 6123 | 8735 |
Tabel 2. Normalisering og statistisk sammenligning af data. At opnå normaliserede fluorescens-værdier, beregne forskellen mellem hver PMA-induceret fluorescens værdi og den passende un-inducerede middelværdi. Statistisk sammenligne disse to sæt af data ved hjælp af en uparret t-test. Beregn gennemsnit og standardafvigelser. Vise de midler, standardafvigelser og p-værdi (r) i grafisk form (som i figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den primære funktion af fagocytter er at opdage, opsluge og ødelægge patogener. Evnen af fagocytter til frembringelse af en passende respiratorisk burst er kritisk for denne funktion. Således kvantificering af respirationsbølge respons er en metode til at tillade sammenligning af almindelige medfødte immunsystem sundhed og funktion mellem grupper af individer og / eller som reaktion på eksperimentelle manipulationer. Her beskriver vi en protokol til at fremkalde, kvantificere og sammenligne det respiratoriske burstrespons mellem grupper af individuelle zebrafisk embryoner. Kort sagt, PMA resulterer i produktionen af ROS ved hjælp af enzymet NADPH-oxidase. Disse ROS virke på en ikke-fluorescerende farvestof og oxidere det til dannelse af en fluorescerende forbindelse. En mikropladelæser anvendes til at detektere den relative fluorescens i hver brønd. Fluorescens dannes ved PMA induktion er betegnende for den respiratoriske burst potentiale og generelle medfødte immunsystem sundhed zebrafisk embryoner. Sammenligning af det normaliserede niveau for fluorescerendecens mellem PMA inducerede grupper ved hjælp af en uparret t-test kan bruges til at afgøre, om der er en væsentlig forskel i luftvejene burst potentiale mellem grupper af zebrafisk. Eksperimentelle manipulationer resulterer i betydelige forskelle i den respiratoriske burst svar vil give indsigt i mekanismerne for medfødte immunitet, f.eks genprodukter er nødvendige for fagocytten respiratorisk burst, narkotika, der forstærker eller modvirke respirationsbølge respons.
Protokoller til assay forskellige facetter af det medfødte immunrespons i zebrafisk model er blevet udviklet (se Indledning). Relativt få af disse teknikker måle produktionen af ROS. Teknikken beskrevet i denne artikel kvantificerer produktion af ROS i zebrafisk embryoner ved stimulering af et immunrespons medfødt med PMA. Denne teknik svarer til respiratoriske burst analyser udført på isolerede blodprøver hele, hvori PMA også anvendes til at induce en respiratorisk burst reaktion, og derefter ROS genereret måles ved anvendelse af et fluorogent substrat (f.eks Phagoburst, Orpegen Pharma). Den her beskrevne metode kan anvendes med hele zebrafisk embryoner samt dissekerede nyrer fra voksne zebrafisk 13, som zebrafisk forreste nyre er analog med human knoglemarv, som er stedet for voksen hæmatopoese 19. Den her beskrevne metode er også alsidig nok til at blive anvendt sammen med andre fiskearter og celle-systemer, såsom cellepræparater fra Tykhovedet elritse nyrer 20.
En alternativ metode til at påvise ROS hele zebrafisk embryoner gør brug af en in vivo hydrogenperoxid sensor. Messenger RNA til en redox-følsomme fluorescerende protein injiceres i zebrafisk embryoner og fluorescensen forholdet overvåget over tid efter halefinnen såret 21. Denne genetisk kodet redox sensor tillader visualisering af den tidsmæssige ogrumlige dynamik produktion af hydrogenperoxid in vivo. Anvendelsen af denne metode viste det overraskende resultat, at hydrogenperoxid forud første ankomst af de første medfødte immunceller, tyder på, at hydrogenperoxid frigives af sårede epitelceller fungerer som et signal til at rekruttere fagocytter 21. Denne teknik, mens kraftfuld og informativ, indebærer tidskrævende og teknisk vanskelige embryologiske og mikroskopi procedurer. Denne redox-sensoren er også specifik for hydrogenperoxid, som kun er en af de mange ROS fungerer under medfødte immunreaktion.
I sammenligning med den fremgangsmåde, beskrevet ovenfor vores metode måler også in vivo ROS, og alligevel er teknisk mindre krævende og bruger et kemikalie til at inducere en medfødt immunrespons snarere end en fysisk sår. I modsætning til den ovennævnte metode, som specifikt måler produktion af hydrogenperoxid, vores procedure målersamlede niveau for ROS. En fordel at påvise en enkelt ROS er, at roller for at sammensatte alene i medfødte immunitet kan belyses. Svarende til fremgangsmåden beskrevet ovenfor vores fremgangsmåde også deler de iboende fordele og ulemper ved at blive udført i hele dyret. Samspillet mellem fagocytter og deres omgivelser, som er elimineret, når respirationsbølge analyser udføres på prøver isolerede blod, er bevaret i disse helt dyr assays. Men brug af hele dyret sandsynligvis resulterer i detektering af ROS fra ikke-phagocyt kilder (f.eks mitokondrier afledt ROS, nonphagocyte NADPH oxidase). I et forsøg på at behandle specificiteten af vores fremgangsmåde til påvisning af fagocyt-afledte ROS, vi henvist til en undersøgelse, hvor denne respirationsbølge assay blev udført i zebrafisk embryoner mangler fagocyt-specifikke NADPH-oxidase 9. Phagocyt-specifikke NADPH oxidase blev hæmmet via morpholino-medieret knock ned af p47phox eller p91pHOX protein. I zebrafisk embryoner på udviklingsstadiet analyseres, er ekspressionen af disse NADPH oxidase subunits begrænset til en delmængde af blodlegemer, sandsynligvis makrofager 22,23. Det respiratoriske burst potentiale embryoner mangler fagocyt-specifikke NADPH oxidase var omkring en tredjedel, der af kontrollen 9 (personlig kommunikation, Dr. Robert Wheeler). Dette resultat tyder på, at mens vores respirationsbølge assay kan registrere ROS fra andre end fagocytter kilder, kan de fleste af fluorescensen detekteres tilskrives den respiratoriske burst via fagocyt NADPH-oxidase. Yderligere specificitet af dette assay blev påvist under anvendelse af bis-indolylmaleimide I (Bisi) en farmakologisk inhibitor af proteinkinase C, for at forhindre virkningen af PMA, en proteinkinase C-agonist, på NADPH-oxidase. Forbehandling af PMA-inducerede zebrafisk nyrer eller embryoner med Bisi resulterede i fluorescens lignende niveauer til at un-inducerede kontroller 12. En ideel respiratoriskburst assay ville være en in vivo high-throughput assay hvor fagocyt-specifik ROS kan både kvantificeres og visualiseres over tid. Indtil dette er muligt, den hurtige natur og teknisk lethed den her beskrevne fremgangsmåde giver en nyttig alternativ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende tidligere og nuværende medlemmer af Kim laboratorium, Mark Nilan for zebrafisk pleje og vedligeholdelse, Dr. Robert Wheeler for nyttige diskussioner og udveksling af data, og NIH tilskud 3RO1GM087308-02S1 og 1P20RR024475-01A2 og Maine Landbrugs-og Forest Experiment Station (publikation nummer 3303) til finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
References
- Medzhitov, R., Janeway, C. A. Jr Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
- Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling. In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).
- Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection. J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).
- Ordas, A., Hegedus, Z., et al. Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection. Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation. Blood. 13, 3976-3978 (2006).
- Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish. J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., et al. mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish. Blood. 4, 56-56 (2011).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Infect. Immun. 11, 4542 (2010).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth. Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).
- Rotman, J., van Gils, W., et al. Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription - Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. BMC Research Notes. 4, (2011).
- d'Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish. BMC Biology. 8, 151 (2010).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos. Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).
- Avdesh, A., Chen, M., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).
- Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al.
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The 'Definitive' (and 'Primitive') Guide to Zebrafish Hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque. Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).
- Niethammer, P., Grabher, C., et al. A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish. Nature. 459, 996-1000 (2009).
- Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). ZFIN Direct Data Submission. , (2001).
- Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. ZFIN Direct Data Submission. , (2004).
- Table 18.4. The Molecular Probes Handbook. , 11th, Forthcoming.
