Summary

Kvantifisering av Respiratory Burst Response som en indikator på medfødte immun Health i sebrafisk

Published: September 12, 2013
doi:

Summary

Det medfødte immunforsvaret beskytter organismer mot patogen infeksjon. En kritisk komponent i det medfødte immunrespons, den phagocyte åndedretts briste, genererer reaktive oksygen arter som dreper invaderende mikroorganismer. Vi beskriver en luftveis burst analyse som kvantifiserer reaktive oksygen arter som produseres når det medfødte immunrespons er kjemisk indusert.

Abstract

Den phagocyte respiratorisk utbrudd er en del av den medfødte immunrespons mot patogene infeksjoner, og omfatter produksjon av reaktive oksygenarter (ROS). ROS er giftige og funksjon for å drepe phagocytized mikroorganismer. In vivo kvantifisering av phagocyte-avledet ROS gir informasjon om en organismes evne til å montere en robust medfødte immunforsvaret. Her beskriver vi en protokoll for å kvantifisere og sammenligne ROS i hele sebrafisk embryo ved kjemisk induksjon av phagocyte åndedretts briste. Denne fremgangsmåte gjør bruk av en ikke-fluoriserende forbindelse som blir fluorescent ved oksydasjon av ROS. Individuell sebrafisk embryoer blir pipettert inn i brønnene i en mikroplate og inkubert i dette fluorogene substrat, med eller uten en kjemisk induser av respiratoriske utbrudd. Fluorescens i hver brønn er kvantifisert ved ønskede tidspunkter ved hjelp av en mikroplateleser. Fluorescens målinger er justert for å eliminere bakgrunnsfluorescens og deretter compared ved hjelp av en uparet t-test. Denne fremgangsmåte gir mulighet for sammenligning av de respiratoriske utbrudd potensialet av sebrafisk embryoer på forskjellige utviklingsstadier, og som reaksjon på eksperimentelle manipulasjoner slik som protein knockdown, overekspresjon eller behandling med farmakologiske midler. Denne metoden kan også benyttes for å overvåke luftveis burst respons i hele dissekert nyrer eller cellepreparater fra nyrer fra voksne sebrafisk og enkelte andre fiskearter. Vi tror at den relative enkelhet og tilpasning av denne protokollen vil utfylle eksisterende protokoller, og vil være av interesse for forskere som ønsker å bedre forstå det medfødte immunrespons.

Introduction

Immunsystemet består av to grener: medfødt og adaptiv immunitet. Medfødt immunitet er evolusjonært eldre enn adaptiv immunitet. Virvelløse dyr er i dag antatt å ha bare medfødt immunitet, mens virveldyr besitter både medfødte og ervervede grener. Selv om adaptiv immunitet confers spesifikk og langvarig immunitet mot visse patogener, er medfødt immunitet en umiddelbar respons på invasjon av bakterier, virus og sopp. En viktig del av det medfødte immunrespons innebærer frigjøring av cytokiner og chemokiner, noe som resulterer i betennelse og rekruttering av fagocytter (f.eks makrofager, nøytrofile) til å sluke og ødelegge fremmede inntrengere.

Vellykkede medfødte immunresponser omfatte: (1) anerkjennelse av invaderende mikroorganismer, (2) induksjon av de aktuelle signaleringskaskader (f.eks frigivelse av cytokiner og kjemokiner), (3) god utvikling / tilstrekkelig antall fagocytiske celler, (4) Migrasjon av fagocytter til nettsteder for infeksjon, (5) engulfment av patogener, og (6) ødeleggelse av oppslukt mikroorganismer. En mangel på ett av disse trinnene vil kunne føre til verten mottar altfor og bukke under for infeksjonen. En robust medfødte immunforsvaret er viktig for helsen til organismer fordi det er den første linjen i forsvaret mot patogener i alle planter og dyr. I virveldyr, forsterker det også det adaptive immunresponsen en. Derfor er det avgjørende at vi er i stand til å vurdere alle sider av det medfødte immunforsvaret for å bedre forstå det og å optimalisere sin funksjon.

Mange modellorganismer blir brukt til å studere medfødt immunitet, alt fra Arabadopsis til C. elegans til Drosophila til mus til dyrkede humane celler. En fordel ved å bruke sebrafisk (Danio rerio) modellsystem for å studere medfødt immunitet er at sebrafisk er et virveldyr, med både medfødte og adaptive imsamfunnet, men utviklingen av medfødte og adaptive immunitet er timelig segregert. Sebrafisk stole utelukkende på medfødt immunitet for beskyttelse mot infeksjon før adaptiv immunitet blir fullt funksjonell, noe som skjer rundt 4-6 uker etter befruktning to. I tillegg til verktøy for genetisk manipulasjon, optisk klarhet og rask, ekstern utvikling, medfødt immunitet som prinsippet modus i forsvaret i sebrafisk embryo gir en forenklet modell for å studere kompleksiteten i det medfødte immunrespons in vivo.

Flere protokoller har blitt utviklet for å vurdere ulike fasetter av det medfødte immunrespons hos sebrafisk embryo. Mikromatriser og RNAseq har validert at cytokinprofiler oppstår ved sebrafisk medfødte immunrespons er lik som mennesker og har også foreslått involvering av uventede gener i medfødt immunitet 3,4. Gjennomsiktigheten av sebrafisk embryo og fluorescerende, transgenic stammer av patogener og sebrafisk tillate visualisering av dynamiske verts-patogen interaksjoner in vivo i sanntid. Transgene sebrafisk embryoer som uttrykker GFP under styring av den nøytrofile spesifikke myeloperoksidase promoter 5,6 eller makrofag-spesifikk promoter MPEG1 7 har gjort det mulig å visualisere og kvantifisere phagocyte migrering til områder av lokale infeksjoner 8, så vel som for å visualisere fagocytose og ødeleggelse av fluorescensmerkede patogener 8,9. Sebrafisk embryo er også mottagelig for den generasjon av high-throughput analyser og kjemiske skjermer. Følgelig har høy gjennomstrømming metoder for transkriptom analyse ved infeksjon 10 og phagocyte migrasjon til områder av kjemisk indusert skade 11 nylig blitt utviklet.

Av de teknikkene som er nevnt ovenfor, ingen kvantitativt vurdere den siste fasen av patogen ødeleggelse av fagocytter. Denne siste etappeninnebærer en luftveis burst (dvs. produksjon av ROS og andre giftige forbindelser), som dreper de oppslukt patogener. Enzymet NADPH oksidase er en viktig kilde til ROS i fagocytterende celler. Montering av subenheter av NADPH oksidase enzym resulterer i overføring av elektroner til oksygen, genererer superoxide anioner. Gjennom etterfølgende enzymatiske reaksjoner, kan superoksid og deretter omdannes til hydrogenperoksid og hypoklorsyre (figur 1A). Det er den respiratoriske utbrudd av fagocytter som dreper patogener og er således en indikasjon på total medfødte immun helse kvantifisering av respiratoriske utbrudd potensialet av sebrafisk embryoer. Vi utviklet en fluorescens-basert analyse for å kvantifisere luft briste i grupper av individuelle sebrafisk embryo 12. Denne assay anvender den ikke-fluoriserende, reduserte form av en kommersielt tilgjengelig, cellepermeabel fargestoff. Dette fargestoff, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (H2DCFDA), er konvertert inn i elektronisk fProsent forbindelse, 2 ', 7'-dichlorofluorescein (DCF), ved oksydasjon. De ulike ROS generert av phagocyte åndedretts burst kan oksidere H2DCFDA og generere fluorescens 24.. Utseendet av fluorescens kan brukes til å kvantifisere og sammenligne den respiratoriske utbrudd reaksjon mellom grupper av sebrafisk. Den proteinkinase C agonist forbolmyristatacetat (PMA) blir brukt til å indusere kjemisk NADPH oksidase for å produsere ROS og dermed øke fluorescens opplesninger (figur 1B). Heri, gir vi en detaljert protokoll av en modifisert og optimalisert versjon av denne sebrafisk embryo åndedretts burst analysen. Denne analysen kan brukes til å sammenligne den respiratoriske utbrudd mellom grupper av individuelle sebrafisk embryoer over tid og / eller i respons på eksperimentelle manipulasjoner (f.eks morfolino-mediert protein knockdown). Bruken av denne metoden, i samarbeid med andre sebrafisk medfødt immunitet analyser, vil gi et mer fullstendig bilde av den komplekse og kritiskemedfødte immunforsvaret.

Protocol

En. Sebrafisk Stell og vedlikehold Husbandry: Mass spawn voksen sebrafisk som tidligere beskrevet 13. Samle gytt embryoer som tidligere beskrevet 14. Mikroinjeksjon (hvis ønskelig): Microinject 1-4 celle scenen sebrafisk embryo med morfolino oligonukleotider til knockdown genprodukter eller mRNA til økt ekspresjon av genprodukter som tidligere beskrevet 15. Opprettholde en tilstrekkelig pool av mock injisert kontroller (minst 48 levende, mock injisert kont…

Representative Results

Her gir vi data som sammenligner luft burst respons i sebrafisk embryo (villtype, AB bakgrunnen) på 48 og 72 timer etter befruktning (HPF). De 48 HPF embryoer fungerte som vår kontrollgruppe og de 72 HPF embryoer som vår eksperimentelle gruppen. Størrelsen på utvalget brukt var 24 un-indusert embryoer og 24 PMA-indusert embryoer per utviklingsstadiet. Rå fluorescens-målinger (i relative fluorescensenheter (RFU)) ble oppnådd ved å lese mikroplate 4 timer etter tilsetning av PMA. Rå fluorescens verdier er gitt i…

Discussion

Den primære funksjon av fagocytter er å oppdage, sluker, og ødelegge patogener. Muligheten av fagocytter til å produsere en tilstrekkelig respiratorisk utbrudd er kritisk for denne funksjonen. Således er kvantifisering av respiratoriske utbrudd respons en metode for å tillate sammenligning av generell medfødte immun helse og funksjon mellom grupper av individer og / eller som reaksjon på eksperimentelle manipulasjoner. Her beskriver vi en protokoll for å indusere, kvantifisere og sammenligne luft burst respons …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker å takke tidligere og nåværende medlemmer av Kim laboratoriet, Mark Nilan for sebrafisk stell og vedlikehold, Dr. Robert Wheeler for nyttige diskusjoner og deling av data, og NIH tilskudd 3RO1GM087308-02S1 og 1P20RR024475-01A2 og Maine Agricultural and Forest Experiment Station (publikasjonsnummer 3303) for finansiering.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Instant Ocean Sea Salt Instant Ocean SS15-10
H2DCFDA Sigma Aldrich 35845-1G
PMA Fisher BP6851
DMSO Sigma Aldrich D2438-5X10ML
Tricaine S MS222 Western Chemical 100 grams
DMEM/F-12, No Phenol Red Life Technologies 11039-021
Deep Petri Dishes VWR 89107-632
Plastic Transfer Pipettes Fisher 13-711-7M
#5 Dumont Forceps Electron Microscopy Sciences 72700-D
1.7 ml Micro Centrifuge Tubes Axygen 10011-724
15 ml Conical Centrifuge Tubes VWR 21008-918
5 ml Serological Pipettes Greiner Bio One 606180
Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader BioTek Contact BioTek
Black 96 Well Microplate VWR 82050-728
25 ml Sterile Reservoirs VistaLab 3054-2003
P200 Pipettor Gilson F123601
Multichannel Pipettor VWR 89079-948
Pipette Tips VWR 89079-478

References

  1. Medzhitov, R., Janeway, C. A. Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
  2. Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling. In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).
  3. Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection. J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).
  4. Ordas, A., Hegedus, Z., et al. Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection. Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).
  5. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation. Blood. 13, 3976-3978 (2006).
  6. Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish. J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).
  7. Ellett, F., Pase, L., et al. mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish. Blood. 4, 56-56 (2011).
  8. Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Infect. Immun. 11, 4542 (2010).
  9. Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth. Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).
  10. Rotman, J., van Gils, W., et al. Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription – Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. BMC Research Notes. 4, (2011).
  11. d’Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish. BMC Biology. 8, 151 (2010).
  12. Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos. Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).
  13. Avdesh, A., Chen, M., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).
  14. Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).
  15. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  16. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
  17. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
  18. Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
  19. Davidson, A. J., Zon, L. I. The ‘Definitive’ (and ‘Primitive’) Guide to Zebrafish Hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
  20. Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque. Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).
  21. Niethammer, P., Grabher, C., et al. A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish. Nature. 459, 996-1000 (2009).
  22. Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). ZFIN Direct Data Submission. , (2001).
  23. Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. ZFIN Direct Data Submission. , (2004).
  24. . Table 18.4. The Molecular Probes Handbook. , .

Play Video

Cite This Article
Goody, M. F., Peterman, E., Sullivan, C., Kim, C. H. Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish. J. Vis. Exp. (79), e50667, doi:10.3791/50667 (2013).

View Video