Kvantifisering av Respiratory Burst Response som en indikator på medfødte immun Health i sebrafisk

Summary

Det medfødte immunforsvaret beskytter organismer mot patogen infeksjon. En kritisk komponent i det medfødte immunrespons, den phagocyte åndedretts briste, genererer reaktive oksygen arter som dreper invaderende mikroorganismer. Vi beskriver en luftveis burst analyse som kvantifiserer reaktive oksygen arter som produseres når det medfødte immunrespons er kjemisk indusert.

Abstract

Den phagocyte respiratorisk utbrudd er en del av den medfødte immunrespons mot patogene infeksjoner, og omfatter produksjon av reaktive oksygenarter (ROS). ROS er giftige og funksjon for å drepe phagocytized mikroorganismer. In vivo kvantifisering av phagocyte-avledet ROS gir informasjon om en organismes evne til å montere en robust medfødte immunforsvaret. Her beskriver vi en protokoll for å kvantifisere og sammenligne ROS i hele sebrafisk embryo ved kjemisk induksjon av phagocyte åndedretts briste. Denne fremgangsmåte gjør bruk av en ikke-fluoriserende forbindelse som blir fluorescent ved oksydasjon av ROS. Individuell sebrafisk embryoer blir pipettert inn i brønnene i en mikroplate og inkubert i dette fluorogene substrat, med eller uten en kjemisk induser av respiratoriske utbrudd. Fluorescens i hver brønn er kvantifisert ved ønskede tidspunkter ved hjelp av en mikroplateleser. Fluorescens målinger er justert for å eliminere bakgrunnsfluorescens og deretter compared ved hjelp av en uparet t-test. Denne fremgangsmåte gir mulighet for sammenligning av de respiratoriske utbrudd potensialet av sebrafisk embryoer på forskjellige utviklingsstadier, og som reaksjon på eksperimentelle manipulasjoner slik som protein knockdown, overekspresjon eller behandling med farmakologiske midler. Denne metoden kan også benyttes for å overvåke luftveis burst respons i hele dissekert nyrer eller cellepreparater fra nyrer fra voksne sebrafisk og enkelte andre fiskearter. Vi tror at den relative enkelhet og tilpasning av denne protokollen vil utfylle eksisterende protokoller, og vil være av interesse for forskere som ønsker å bedre forstå det medfødte immunrespons.

Introduction

Immunsystemet består av to grener: medfødt og adaptiv immunitet. Medfødt immunitet er evolusjonært eldre enn adaptiv immunitet. Virvelløse dyr er i dag antatt å ha bare medfødt immunitet, mens virveldyr besitter både medfødte og ervervede grener. Selv om adaptiv immunitet confers spesifikk og langvarig immunitet mot visse patogener, er medfødt immunitet en umiddelbar respons på invasjon av bakterier, virus og sopp. En viktig del av det medfødte immunrespons innebærer frigjøring av cytokiner og chemokiner, noe som resulterer i betennelse og rekruttering av fagocytter (f.eks makrofager, nøytrofile) til å sluke og ødelegge fremmede inntrengere.

Vellykkede medfødte immunresponser omfatte: (1) anerkjennelse av invaderende mikroorganismer, (2) induksjon av de aktuelle signaleringskaskader (f.eks frigivelse av cytokiner og kjemokiner), (3) god utvikling / tilstrekkelig antall fagocytiske celler, (4) Migrasjon av fagocytter til nettsteder for infeksjon, (5) engulfment av patogener, og (6) ødeleggelse av oppslukt mikroorganismer. En mangel på ett av disse trinnene vil kunne føre til verten mottar altfor og bukke under for infeksjonen. En robust medfødte immunforsvaret er viktig for helsen til organismer fordi det er den første linjen i forsvaret mot patogener i alle planter og dyr. I virveldyr, forsterker det også det adaptive immunresponsen ^en. Derfor er det avgjørende at vi er i stand til å vurdere alle sider av det medfødte immunforsvaret for å bedre forstå det og å optimalisere sin funksjon.

Mange modellorganismer blir brukt til å studere medfødt immunitet, alt fra Arabadopsis til C. elegans til Drosophila til mus til dyrkede humane celler. En fordel ved å bruke sebrafisk (Danio rerio) modellsystem for å studere medfødt immunitet er at sebrafisk er et virveldyr, med både medfødte og adaptive imsamfunnet, men utviklingen av medfødte og adaptive immunitet er timelig segregert. Sebrafisk stole utelukkende på medfødt immunitet for beskyttelse mot infeksjon før adaptiv immunitet blir fullt funksjonell, noe som skjer rundt 4-6 uker etter befruktning ^to. I tillegg til verktøy for genetisk manipulasjon, optisk klarhet og rask, ekstern utvikling, medfødt immunitet som prinsippet modus i forsvaret i sebrafisk embryo gir en forenklet modell for å studere kompleksiteten i det medfødte immunrespons in vivo.

Flere protokoller har blitt utviklet for å vurdere ulike fasetter av det medfødte immunrespons hos sebrafisk embryo. Mikromatriser og RNAseq har validert at cytokinprofiler oppstår ved sebrafisk medfødte immunrespons er lik som mennesker og har også foreslått involvering av uventede gener i medfødt immunitet ^3,4. Gjennomsiktigheten av sebrafisk embryo og fluorescerende, transgenic stammer av patogener og sebrafisk tillate visualisering av dynamiske verts-patogen interaksjoner in vivo i sanntid. Transgene sebrafisk embryoer som uttrykker GFP under styring av den nøytrofile spesifikke myeloperoksidase promoter ^5,6 eller makrofag-spesifikk promoter MPEG1 ⁷ har gjort det mulig å visualisere og kvantifisere phagocyte migrering til områder av lokale infeksjoner ^8, så vel som for å visualisere fagocytose og ødeleggelse av fluorescensmerkede patogener ^8,9. Sebrafisk embryo er også mottagelig for den generasjon av high-throughput analyser og kjemiske skjermer. Følgelig har høy gjennomstrømming metoder for transkriptom analyse ved infeksjon ¹⁰ og phagocyte migrasjon til områder av kjemisk indusert skade ¹¹ nylig blitt utviklet.

Av de teknikkene som er nevnt ovenfor, ingen kvantitativt vurdere den siste fasen av patogen ødeleggelse av fagocytter. Denne siste etappeninnebærer en luftveis burst (dvs. produksjon av ROS og andre giftige forbindelser), som dreper de oppslukt patogener. Enzymet NADPH oksidase er en viktig kilde til ROS i fagocytterende celler. Montering av subenheter av NADPH oksidase enzym resulterer i overføring av elektroner til oksygen, genererer superoxide anioner. Gjennom etterfølgende enzymatiske reaksjoner, kan superoksid og deretter omdannes til hydrogenperoksid og hypoklorsyre (figur 1A). Det er den respiratoriske utbrudd av fagocytter som dreper patogener og er således en indikasjon på total medfødte immun helse kvantifisering av respiratoriske utbrudd potensialet av sebrafisk embryoer. Vi utviklet en fluorescens-basert analyse for å kvantifisere luft briste i grupper av individuelle sebrafisk embryo ^12. Denne assay anvender den ikke-fluoriserende, reduserte form av en kommersielt tilgjengelig, cellepermeabel fargestoff. Dette fargestoff, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (H2DCFDA), er konvertert inn i elektronisk fProsent forbindelse, 2 ', 7'-dichlorofluorescein (DCF), ved oksydasjon. De ulike ROS generert av phagocyte åndedretts burst kan oksidere H2DCFDA og generere fluorescens ^24.. Utseendet av fluorescens kan brukes til å kvantifisere og sammenligne den respiratoriske utbrudd reaksjon mellom grupper av sebrafisk. Den proteinkinase C agonist forbolmyristatacetat (PMA) blir brukt til å indusere kjemisk NADPH oksidase for å produsere ROS og dermed øke fluorescens opplesninger (figur 1B). Heri, gir vi en detaljert protokoll av en modifisert og optimalisert versjon av denne sebrafisk embryo åndedretts burst analysen. Denne analysen kan brukes til å sammenligne den respiratoriske utbrudd mellom grupper av individuelle sebrafisk embryoer over tid og / eller i respons på eksperimentelle manipulasjoner (f.eks morfolino-mediert protein knockdown). Bruken av denne metoden, i samarbeid med andre sebrafisk medfødt immunitet analyser, vil gi et mer fullstendig bilde av den komplekse og kritiskemedfødte immunforsvaret.

Protocol

En. Sebrafisk Stell og vedlikehold Husbandry: Mass spawn voksen sebrafisk som tidligere beskrevet 13. Samle gytt embryoer som tidligere beskrevet 14. Mikroinjeksjon (hvis ønskelig): Microinject 1-4 celle scenen sebrafisk embryo med morfolino oligonukleotider til knockdown genprodukter eller mRNA til økt ekspresjon av genprodukter som tidligere beskrevet 15. Opprettholde en tilstrekkelig pool av mock injisert kontroller (minst 48 levende, mock injisert kont…

Representative Results

Her gir vi data som sammenligner luft burst respons i sebrafisk embryo (villtype, AB bakgrunnen) på 48 og 72 timer etter befruktning (HPF). De 48 HPF embryoer fungerte som vår kontrollgruppe og de 72 HPF embryoer som vår eksperimentelle gruppen. Størrelsen på utvalget brukt var 24 un-indusert embryoer og 24 PMA-indusert embryoer per utviklingsstadiet. Rå fluorescens-målinger (i relative fluorescensenheter (RFU)) ble oppnådd ved å lese mikroplate 4 timer etter tilsetning av PMA. Rå fluorescens verdier er gitt i…

Discussion

Den primære funksjon av fagocytter er å oppdage, sluker, og ødelegge patogener. Muligheten av fagocytter til å produsere en tilstrekkelig respiratorisk utbrudd er kritisk for denne funksjonen. Således er kvantifisering av respiratoriske utbrudd respons en metode for å tillate sammenligning av generell medfødte immun helse og funksjon mellom grupper av individer og / eller som reaksjon på eksperimentelle manipulasjoner. Her beskriver vi en protokoll for å indusere, kvantifisere og sammenligne luft burst respons …

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
H2DCFDA	Sigma Aldrich	35845-1G
PMA	Fisher	BP6851
DMSO	Sigma Aldrich	D2438-5X10ML
Tricaine S MS222	Western Chemical	100 grams
DMEM/F-12, No Phenol Red	Life Technologies	11039-021
Deep Petri Dishes	VWR	89107-632
Plastic Transfer Pipettes	Fisher	13-711-7M
#5 Dumont Forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-D
1.7 ml Micro Centrifuge Tubes	Axygen	10011-724
15 ml Conical Centrifuge Tubes	VWR	21008-918
5 ml Serological Pipettes	Greiner Bio One	606180
Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader	BioTek	Contact BioTek
Black 96 Well Microplate	VWR	82050-728
25 ml Sterile Reservoirs	VistaLab	3054-2003
P200 Pipettor	Gilson	F123601
Multichannel Pipettor	VWR	89079-948
Pipette Tips	VWR	89079-478