Kvantifiering av Respirator Burst Response som en indikator för Innate Immune Health i Zebrafish

Summary

Det medfödda immunförsvaret skyddar organismer mot patogen infektion. En kritisk del av det medfödda immunförsvaret, fagocyten respiratory burst genererar reaktiva syreföreningar som dödar invaderande mikroorganismer. Vi beskriver en respiratory burst analys som kvantifierar reaktiva syreradikaler som produceras när det medfödda immunsvaret är kemiskt inducerad.

Abstract

Den fagocyt respiratory burst är en del av det medfödda immunsvaret mot patogeninfektion och innebär produktion av reaktiva syreradikaler (ROS). ROS är giftiga och fungera för att döda fagocytiserade mikroorganismer. In vivo kvantifiering av fagocyt-derived ROS ger information om en organism förmåga att montera ett robust medfödda immunsvaret. Här beskriver vi ett protokoll för att kvantifiera och jämföra ROS i hela zebrafisk embryon vid kemisk induktion av fagocytsystemet respiratory burst. Metoden använder sig av en icke-fluorescerande förening som blir fluorescerande vid oxidation av ROS. Enskilda zebrafiskembryon pipetteras i brunnar i en mikroplatta och inkuberades i detta fluorogent substrat med eller utan en kemisk inducerare av respiratory burst. Fluorescens i varje brunn kvantifieras vid önskade tidpunkter med hjälp av en mikroplattläsare. Fluorescens avläsningar justeras för att eliminera bakgrunds fluorescens och compared hjälp av ett oparat t-test. Denna metod gör det möjligt att jämföra den respiratory burst potential zebrafisk embryon i olika utvecklingsstadier och som svar på experimentella manipulationer såsom protein knockdown, överuttryck eller behandling med farmakologiska medel. Denna metod kan också användas för att övervaka andningsskursvar i hela dissekerades njurarna eller cellpreparat från njurar hos vuxna zebrafisk och några andra fiskarter. Vi tror att den relativa enkelheten och anpassningsförmåga av detta protokoll kommer att komplettera befintliga protokoll och kommer att vara av intresse för forskare som vill bättre förstå det medfödda immunsvaret.

Introduction

Immunförsvaret består av två grenar: medfödd och adaptiv immunitet. Medfödd immunitet är evolutionärt mer gammal än adaptiv immunitet. Ryggradslösa djur är för närvarande tros ha endast medfödd immunitet, medan ryggradsdjur besitter både det medfödda och adaptiva grenar. Även adaptiv immunitet ger specifik och långvarig immunitet mot vissa patogener, är medfödd immunitet ett omedelbart svar på invaderande bakterier, virus och svampar. En viktig aspekt av det medfödda immunsvar involverar frisättning av cytokiner och kemokiner, som resulterar i inflammation och rekrytering av fagocyter (t ex makrofager, neutrofiler) att uppsluka och förstöra främmande inkräktare.

Framgångsrika medfödda immunsvar involverar: (1) erkännande av invaderande mikroorganismer, (2) induktion av lämpliga signaleringskaskader (t.ex. utsläpp av cytokiner och kemokiner), (3) ordentlig utveckling / tillräckligt många fagocytceller, (4) Migrering av fagocyter till webbplatser på infektion, (5) omvälvning av patogener, och (6) förstörelse av uppslukade mikroorganismer. Brist på någon av dessa åtgärder skulle kunna leda till värd bli överväldigade av, och ge efter för, infektionen. En robust medfödda immunsvar är avgörande för hälsan hos organismer eftersom det är den första försvarslinjen mot patogener i alla växter och djur. I ryggradsdjur, potentierar den även det adaptiva immunsvaret ^ett. Därför är det viktigt att vi har möjlighet att utvärdera alla aspekter av det medfödda immunsvaret för att bättre förstå den och att optimera dess funktion.

Många modellorganismer som används för att studera medfödd immunitet, från Arabadopsis till C. elegans till Drosophila till möss till odlade humana celler. En fördel med att använda zebrafisk (Danio rerio) modellsystem för att studera medfödd immunitet är att zebrafisk är ett ryggradsdjur, med både medfödda och adaptiva imskapen, men utvecklingen av medfödd och adaptiv immunitet är tidsmässigt segregerade. Zebrafisk enbart förlita sig på medfödd immunitet för skydd mot infektion tills adaptiv immunitet blir fullt fungerande, vilket sker cirka 4-6 veckor efter befruktning ^2. Förutom verktyg för genetisk manipulation, optisk klarhet och snabb, extern utveckling, medfödd immunitet som principen sättet försvar i zebrafisk embryon ger en förenklad modell där för att studera komplexiteten i det medfödda immunsvaret in vivo.

Flera protokoll har utvecklats för att utvärdera olika aspekter av det medfödda immunsvaret i zebrafisk embryon. Microarrays och RNAseq har validerat att cytokinprofiler som framkallas av den zebrafisk medfödda immunsvar är liknande till det av människor och har också föreslagit medverkan av oväntade gener i medfödd immunitet ^3,4. Insynen i zebrafisk embryot och fluorescerande, transgenic stammar av patogener och zebrafisk möjliggör visualisering av dynamiska värd-patogen interaktioner in vivo i realtid. Transgena zebrafisk embryon som uttrycker GFP under kontroll av neutrofila specifika myeloperoxidas promotor ^5,6 eller makrofag-specifika MPEG1 promotorn ⁷ har gjort det möjligt att visualisera och kvantifiera phagocyte migration till platser av lokala infektioner ⁸ samt att visualisera fagocytos och förstörelse av märkt med fluorescens patogener ^8,9. Zebrafisk embryon är också mottagliga för generering av hög kapacitet för analyser och kemiska skärmar. Följaktligen har hög kapacitet metoder transkriptomanalys vid infektion ¹⁰ och phagocyte migration till platser av kemiskt inducerad skada ¹¹ nyligen utvecklats.

Av de metoder som anges ovan, inget kvantitativt bedöma den sista etappen av patogen förstörelse av fagocyter. Det sista stegetinnebär en respiratory burst (dvs. produktion av ROS och andra giftiga föreningar), som dödar de uppslukade patogener. Enzymet NADPH-oxidas är en viktig källa för ROS i fagocyterande celler. Montering av subenheterna av NADPH-oxidasenzymresulterar i överföringen av elektroner till syre, generera superoxidanjoner. Genom efterföljande enzymatiska reaktioner, kan superoxid sedan omvandlas till väteperoxid och underklorsyrlighet (Figur 1A). Det är den respiratoriska utbrott av fagocyter som dödar patogener och sålunda är en indikation på total medfödda immun hälsa kvantifieringen av respiratory burst potential zebrafiskembryon. Vi utvecklade en fluorescensbaserad analys för att kvantifiera den respiratoriska utbrott i grupper av enskilda zebrafiskembryon ^12. Denna analys utnyttjar den icke-fluorescerande, reducerad form av en kommersiellt tillgänglig, cellgenomsläppliga färgämnet. Detta färgämne, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (H2DCFDA), omvandlas till de lysrörcent förening, 2 ', 7'-diklorfluorescein (DCF), vid oxidation. De olika ROS genereras av fagocytsystemet respiratory burst kan oxidera H2DCFDA och generera fluorescens ^24. Uppträdandet av fluorescens kan användas för att kvantifiera och jämföra respiratory burst svar mellan grupper av zebrafisk. Proteinkinas C-agonist forbolmyristatacetat (PMA) användes för att kemiskt förmå NADPH-oxidas för framställning av ROS och därmed öka fluorescensavläsningar (Figur 1B). Häri ger vi ett detaljerat protokoll av en modifierad och optimerad version av denna zebrafisk embryo respiratory burst-analys. Denna analys kan användas för att jämföra den respiratory burst mellan grupper av enskilda zebrafiskembryon över tid och / eller till följd av experimentella manipulationer (t.ex. morfolino-förmedlad protein knockdown). Användningen av denna metod, tillsammans med andra zebrafisk medfödd immunitet analyser, kommer att ge en mer fullständig bild av den komplexa och kritiskamedfödda immunsvaret.

Protocol

1. Zebrafish Skötsel och underhåll Uppfödnings: Mass spawn vuxna zebrafisk, såsom tidigare beskrivits 13. Samla spawned embryon som tidigare beskrivits 14. Mikroinjektion (om så önskas): mikroinjicera 1-4 cell skede zebrafisk embryon med morpholino oligonukleotider att knockdown genprodukter eller mRNA för att överuttrycker genprodukter som tidigare beskrivits 15. Upprätthålla en tillräcklig pool av mock injicerade kontroller (minst 48 levande, h?…

Representative Results

Här ger vi data som jämför den respiratory burst svar i zebrafiskembryon (vildtyp, AB bakgrund) vid 48 och 72 timmar efter befruktning (HPF). De 48 HPF embryon agerade som vår kontrollgrupp och 72 HPF embryon som vår försöksgrupp. Urvalsstorleken som användes var 24 un-inducerade embryon och 24 PMA-inducerade embryon per utvecklingsstadiet. Råa Fluorescensavläsningar (i relativa fluorescensenheter (RFU)) erhölls genom avläsning av mikroplattan 4 timmar efter tillsats av PMA. Råa fluorescensvärden ges i <st…

Discussion

Den primära uppgiften för fagocyter är att upptäcka, uppsluka, och förstöra patogener. Förmågan hos fagocyter att producera en tillräcklig respiratory burst är kritisk för denna funktion. Således är kvantifiering av respiratory burst svar en metod för att möjliggöra jämförelser av allmänna medfödda immun hälsa och funktion mellan grupper av individer och / eller som svar på experimentella manipulationer. Här beskriver vi ett protokoll för att framkalla, kvantifiera och jämföra den respiratory b…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Instant Ocean Sea Salt	Instant Ocean	SS15-10
H2DCFDA	Sigma Aldrich	35845-1G
PMA	Fisher	BP6851
DMSO	Sigma Aldrich	D2438-5X10ML
Tricaine S MS222	Western Chemical	100 grams
DMEM/F-12, No Phenol Red	Life Technologies	11039-021
Deep Petri Dishes	VWR	89107-632
Plastic Transfer Pipettes	Fisher	13-711-7M
#5 Dumont Forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-D
1.7 ml Micro Centrifuge Tubes	Axygen	10011-724
15 ml Conical Centrifuge Tubes	VWR	21008-918
5 ml Serological Pipettes	Greiner Bio One	606180
Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader	BioTek	Contact BioTek
Black 96 Well Microplate	VWR	82050-728
25 ml Sterile Reservoirs	VistaLab	3054-2003
P200 Pipettor	Gilson	F123601
Multichannel Pipettor	VWR	89079-948
Pipette Tips	VWR	89079-478