Zebrafish में सहज प्रतिरक्षा स्वास्थ्य का एक संकेतक के रूप में श्वसन फट रिस्पांस की मात्रा
Summary
सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया रोगज़नक़ संक्रमण के खिलाफ जीवों की रक्षा करता है. सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण घटक है, भक्षककोशिकीय सांस फट, हमलावर सूक्ष्मजीवों को मारने कि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों उत्पन्न करता है. हम सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया रासायनिक प्रेरित है जब उत्पादित प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों quantifies कि एक सांस फट परख का वर्णन.
Abstract
भक्षककोशिकीय सांस फट रोगज़नक़ संक्रमण को सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का हिस्सा है और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के उत्पादन शामिल है. आरओएस विषाक्त कर रहे हैं और phagocytized सूक्ष्मजीवों को मारने के लिए कार्य करते हैं. भक्षककोशिकीय व्युत्पन्न आरओएस के vivo मात्रा का ठहराव एक मजबूत सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया माउंट करने के लिए एक जीव की क्षमता के बारे में जानकारी प्रदान करता है. यहाँ हम भक्षककोशिकीय सांस फट का रासायनिक प्रेरण पर पूरे zebrafish भ्रूण में आरओएस यों और तुलना के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इस विधि आरओएस द्वारा ऑक्सीकरण पर फ्लोरोसेंट हो जाता है कि एक गैर फ्लोरोसेंट परिसर का उपयोग करता है. व्यक्तिगत zebrafish भ्रूण एक microplate के कुओं में pipetted और सांस फट का एक रासायनिक inducer के साथ या बिना इस fluorogenic सब्सट्रेट में incubated हैं. प्रत्येक कुएं में प्रतिदीप्ति एक microplate रीडर का उपयोग कर वांछित समय बिंदुओं पर मात्रा निर्धारित है. प्रतिदीप्ति रीडिंग पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को खत्म करने के लिए समायोजित और फिर सह रहे हैंएक unpaired टी परीक्षण का उपयोग कर mpared. इस विधि विभिन्न विकासात्मक चरणों में और इस तरह के प्रोटीन पछाड़ना, overexpression, या औषधीय एजेंटों के साथ इलाज के रूप में प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के जवाब में zebrafish भ्रूण की सांस फट क्षमता की तुलना के लिए अनुमति देता है. यह विधि भी वयस्क zebrafish के गुर्दे और कुछ अन्य मछली प्रजातियों से पूरे dissected गुर्दे या सेल की तैयारी में सांस फट प्रतिक्रिया पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम इस प्रोटोकॉल के रिश्तेदार सादगी और अनुकूलन क्षमता मौजूदा प्रोटोकॉल पूरक होगा और बेहतर सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को समझने के लिए तलाश के शोधकर्ताओं के लिए ब्याज की हो जाएगा.
Introduction
सहज और प्रतिरक्षा अनुकूली: प्रतिरक्षा प्रणाली के दो शाखाओं के शामिल है. सहज रोगक्षमता evolutionarily प्रतिरक्षा अनुकूली से अधिक प्राचीन है. रीढ़ दोनों सहज और अनुकूली शाखाओं के अधिकारी जबकि अकशेरुकी वर्तमान में, केवल जन्मजात उन्मुक्ति है लगा रहे हैं. प्रतिरक्षा अनुकूली कुछ रोगजनकों के लिए विशिष्ट और लंबे समय से स्थायी उन्मुक्ति प्रदान करते हैं, जन्मजात उन्मुक्ति हमलावर बैक्टीरिया, वायरस और कवक के लिए एक तत्काल प्रतिक्रिया है. सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक महत्वपूर्ण पहलू विदेशी आक्रमणकारियों निगल और नष्ट करने के लिए फ़ैगोसाइट (जैसे मैक्रोफेज, neutrophils) की सूजन और भर्ती में जो परिणाम साइटोकिन्स और chemokines की रिहाई शामिल है.
सफल सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को शामिल: हमलावर सूक्ष्मजीवों की (1) मान्यता; उचित cascades संकेत (साइटोकिन्स और chemokines के जैसे विज्ञप्ति) (2) के प्रेरण, phagocytic कोशिकाओं की (3) समुचित विकास / पर्याप्त संख्या, (4) संक्रमण की साइटों के लिए फ़ैगोसाइट के प्रवास; रोगजनकों के (5) घिराव; और घिरा सूक्ष्मजीवों की (6) विनाश. इन कदमों में से किसी एक में ए की कमी से अभिभूत किया जा रहा है मेजबान का कारण है, और संक्रमण, के सामने झुकने सकता है. यह सभी पौधों और पशुओं में रोगजनकों के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति है, क्योंकि एक मजबूत सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया जीवों के स्वास्थ्य के लिए महत्वपूर्ण है. रीढ़ में, यह भी अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1 potentiates. इसलिए, यह हम इसे बेहतर समझने के लिए और अपने कार्य का अनुकूलन करने के क्रम में सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के सभी पहलुओं का मूल्यांकन करने में सक्षम हैं कि महत्वपूर्ण है.
कई मॉडल जीवों Arabadopsis से सी. को लेकर सहज प्रतिरक्षा अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है सुसंस्कृत मानव कोशिकाओं को चूहों को ड्रोसोफिला को एलिगेंस. जन्मजात उन्मुक्ति का अध्ययन करने के लिए zebrafish (Danio rerio) मॉडल प्रणाली का उपयोग करने के लिए एक लाभ यह zebrafish सहज और अनुकूली दोनों आईएम के साथ, एक हड्डीवाला है कि हैसमुदाय, अभी तक सहज और प्रतिरक्षा अनुकूली के विकास अस्थायी अलग कर रहे हैं. प्रतिरक्षा अनुकूली पूरी तरह कार्यात्मक हो जाता है जब तक Zebrafish के आसपास 4-6 सप्ताह के बाद निषेचन 2 तब होती है, जो पूरी तरह से संक्रमण के खिलाफ संरक्षण के लिए सहज प्रतिरक्षा पर भरोसा करते हैं. आनुवंशिक हेरफेर, ऑप्टिकल स्पष्टता और तेजी से, बाहरी विकास के लिए उपकरणों के अलावा, zebrafish भ्रूण में रक्षा के सिद्धांत विधा के रूप में सहज उन्मुक्ति विवो में सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जटिलताओं का अध्ययन करने के लिए एक सरल मॉडल प्रदान करता है.
एकाधिक प्रोटोकॉल zebrafish भ्रूण में सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विभिन्न पहलुओं का आकलन करने के लिए विकसित किया गया है. प्रोटीन और RNAseq zebrafish सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से हासिल साइटोकाइन प्रोफाइल के मनुष्यों के समान हैं और भी सहज उन्मुक्ति 3,4 में अप्रत्याशित जीन की भागीदारी का सुझाव दिया है कि पुष्टि की है. zebrafish भ्रूण और फ्लोरोसेंट, transgen की पारदर्शितारोगजनकों और zebrafish के आईसी उपभेदों वास्तविक समय में vivo में गतिशील मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं. न्युट्रोफिल विशेष myeloperoxidase प्रमोटर 5,6 या बृहतभक्षककोशिका विशेष MPEG1 प्रमोटर 7 के नियंत्रण के तहत व्यक्त GFP ट्रांसजेनिक zebrafish भ्रूण कल्पना और यों भक्षककोशिकीय प्रवास स्थानीयकृत संक्रमण 8 की साइटों के लिए और साथ ही phagocytosis और विनाश की कल्पना करने के लिए यह संभव बना दिया है fluorescently 8,9 रोगजनकों लेबल. Zebrafish भ्रूण भी उच्च throughput assays और रासायनिक स्क्रीन की पीढ़ी के लिए उत्तरदायी हैं. तदनुसार, संक्रमण 10 और रासायनिक प्रेरित चोट 11 की साइटों के लिए भक्षककोशिकीय प्रवास पर transcriptome विश्लेषण के उच्च तरीकों का हाल ही में विकसित किया गया है.
ऊपर सूचीबद्ध तकनीकों में से कोई मात्रात्मक फ़ैगोसाइट द्वारा रोगज़नक़ विनाश के अंतिम चरण का आकलन करें. इस अंतिम चरणघिरा रोगजनकों मार जो एक सांस फट (यानी आरओएस के उत्पादन और अन्य जहरीले यौगिकों), शामिल है. एंजाइम NADPH oxidase phagocytic कोशिकाओं में आरओएस का एक प्रमुख स्रोत है. ऑक्सीजन इलेक्ट्रॉनों के हस्तांतरण में NADPH oxidase एंजाइम परिणामों के सब यूनिटों के विधानसभा, superoxide anions सृजन. बाद में एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के माध्यम से, superoxide तो हाइड्रोजन पेरोक्साइड और हाइपोक्लोरस अम्ल (चित्रा 1 ए) में परिवर्तित किया जा सकता है. यह रोगजनकों को मारता है और इस प्रकार, zebrafish भ्रूण की सांस फट क्षमता की मात्रा का ठहराव समग्र सहज प्रतिरक्षा स्वास्थ्य का सूचक है कि फ़ैगोसाइट की सांस फट है. हम व्यक्तिगत zebrafish भ्रूण 12 के समूह में सांस फट यों तो एक प्रतिदीप्ति आधारित परख विकसित की है. यह परख एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, सेल पारगम्य डाई की गैर फ्लोरोसेंट, कम फार्म का इस्तेमाल करता. इस डाई, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein Diacetate (H2DCFDA), fluores में बदल जाता हैऑक्सीकरण पर प्रतिशत यौगिक, 2 ', 7'-dichlorofluorescein (डीसीएफ),. भक्षककोशिकीय सांस फट से उत्पन्न विविध आरओएस H2DCFDA oxidize और प्रतिदीप्ति 24 उत्पन्न कर सकते हैं. प्रतिदीप्ति की उपस्थिति zebrafish के समूहों के बीच सांस फट प्रतिक्रिया यों और तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रोटीन kinase सी एगोनिस्ट phorbol myristate एसीटेट (पीएमए) रासायनिक आरओएस के उत्पादन के लिए NADPH oxidase प्रेरित है और इस तरह प्रतिदीप्ति रीडिंग (चित्रा 1 बी) में वृद्धि करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस के साथ साथ, हम इस zebrafish भ्रूण सांस फट परख का एक संशोधित और अनुकूलित संस्करण की एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. यह परख समय के साथ और / या प्रयोगात्मक जोड़तोड़ (जैसे morpholino की मध्यस्थता प्रोटीन पछाड़ना) के जवाब में व्यक्तिगत zebrafish भ्रूण के समूहों के बीच सांस फट तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस विधि का उपयोग, अन्य zebrafish जन्मजात उन्मुक्ति assays के साथ संयोजन के रूप में, जटिल और महत्वपूर्ण का एक और पूरी तस्वीर प्रदान करेगासहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया.
Protocol
Representative Results
Discussion
फ़ैगोसाइट का प्राथमिक कार्य रोगजनकों, का पता लगाने चपेट में ले, और नष्ट कर रहा है. एक पर्याप्त श्वसन फट निर्माण करने के लिए फ़ैगोसाइट की क्षमता इस समारोह के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रकार, श्वसन फट प्रतिक्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों किम प्रयोगशाला, उपयोगी विचार विमर्श और डेटा साझा करने के लिए zebrafish देखभाल और रखरखाव, डॉ. रॉबर्ट व्हीलर के लिए मार्क Nilan के अतीत और वर्तमान सदस्यों को स्वीकार करना, और एनआईएच अनुदान 3RO1GM087308-02S1 और 1P20RR024475-01A2 और मेन कृषि और वन होगा वित्त पोषण के लिए स्टेशन (प्रकाशन संख्या 3303) प्रयोग.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
References
- Medzhitov, R., Janeway, C. A. Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
- Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling. In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).
- Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection. J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).
- Ordas, A., Hegedus, Z., et al. Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection. Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation. Blood. 13, 3976-3978 (2006).
- Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish. J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., et al. mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish. Blood. 4, 56-56 (2011).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Infect. Immun. 11, 4542 (2010).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth. Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).
- Rotman, J., van Gils, W., et al. Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription – Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. BMC Research Notes. 4, (2011).
- d’Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish. BMC Biology. 8, 151 (2010).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos. Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).
- Avdesh, A., Chen, M., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).
- Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The ‘Definitive’ (and ‘Primitive’) Guide to Zebrafish Hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque. Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).
- Niethammer, P., Grabher, C., et al. A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish. Nature. 459, 996-1000 (2009).
- Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). ZFIN Direct Data Submission. , (2001).
- Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. ZFIN Direct Data Submission. , (2004).
- . Table 18.4. The Molecular Probes Handbook. , .
