Infinium Assay for Storstilet SNP Genotypebestemmelse Applications

Summary

En protokol er beskrevet, der bruger Illumina s Infinium assays til at udføre storstilet genotypebestemmelse. Disse analyser kan pålideligt genotype millioner af SNPs tværs af hundredvis af enkelte DNA-prøver i tre dage. Når der genereres, kan disse genotyper bruges til at kontrollere for foreninger med en række forskellige sygdomme eller fænotyper.

Abstract

Genotypebestemmelse varianter i det menneskelige genom har vist sig at være en effektiv metode til at identificere genetiske foreninger med fænotyper. Fordelingen af ​​varianter inden for familier eller befolkningsgrupper kan lette identifikationen af ​​de genetiske faktorer for sygdommen. Illumina panel af genotypebestemmelse BeadChips giver efterforskerne at genotype tusinder eller millioner af enkelt nukleotid polymorfier (SNP), eller til at analysere andre genomiske varianter, såsom kopiere nummer, på tværs af et stort antal DNA-prøver. Disse SNPs kan spredes over hele genomet eller målrettet i specifikke regioner med henblik på at maksimere potentialet opdagelse. Den Infinium analysen er optimeret til at give høj kvalitet og præcise resultater hurtigt. Med korrekt opstilling kan en enkelt tekniker behandle fra nogle få hundrede til over tusind DNA-prøver per uge, afhængigt af typen af ​​matrix. Denne analyse guider brugeren gennem alle trin, startende med genomisk DNA og slutter med scanning af array. Brug sømmelighed ReageNTS der prøver forstærkes, fragmenteret, udfældet, resuspenderet, hybridiseret til chippen, forlænges med en enkelt base, farves, og scannet på enten en iScan eller Hi Scan høj opløsning optisk imaging system. Én overnight trin er nødvendigt at forstærke DNA. DNA denatureres og isotermisk amplificeret ved hel-genom-amplifikation og derfor er ingen PCR påkrævet. Prøver hybridiseres til arrays løbet af en anden natten trin. Ved den tredje dag er prøverne klar til at blive scannet og analyseres. Amplified DNA kan oplagres i store mængder, så perle arrays til at blive behandlet hver dag i ugen og dermed maksimere gennemløb.

Introduction

Typing enkelt nukleotid polymorfier (SNP) er en vigtig metode til at identificere varianter risiko forbundet med sygdommen. Historisk set er omfanget af genotypebestemmelse eksperimenter været begrænset af den tilgængelige teknologi. Gelelektroforese-baserede genotypebestemmelse metoder er begrænset i sample-and SNP-throughput ^[1]. Udvikle disse analyser kan ofte være arbejdskrævende, stole på makeup og struktur i regionen omkring variant for optimering ^[1]. TaqMan genotypebestemmelse assays, udviklet af Life Technologies, kan køre et stort antal prøver hurtigt og med minimal tekniker involvering [2], men SNP-multiplexing restriktioner fortsat at begrænse det samlede antal genotyper til godt under en million om dagen ^{[3,4 ].} Sequenom s IPLEX platform kan også køre mange prøver på en gang, men som færre end hundrede SNPs kan multiplekses sammen, gennemløb er forholdsvis lav samlet ^[5]. Beckman Coulter s SNP stream teknologikunne teoretisk producere mere end tre millioner genotyper per dag, men denne teknologi grænser projekt rækkevidde til et maksimum på kun otteogfyrre SNPs pr reaktion ^[4,6]. Mens GoldenGate analysen kan behandle næsten to hundrede DNA-prøver hver dag på hundredvis eller tusindvis af SNPs per prøve, prisen pr genotype ikke er konkurrencedygtig med avancerede, ultra-high-throughput-teknikker, når du skriver over tre tusinde SNPs på én gang ^{[4,7 ].} For at kunne behandle flere millioner genotyper per dag, det nødvendige omfang for store genom-dækkende forening undersøgelser, har matrix-hybridiseringsanalyser blive den mest omkostningseffektive løsning på markedet.

Affymetrix linje af hybridisering arrays og Illumina linje af Infinium-baserede arrays tillader potentielt hundredvis af prøver, der skal skrives på hundreder af tusinder eller millioner af SNPs parallelt ^[4,8]. Disse SNPs kan være spredt over hele genomet, lokaliseret i regioner af interesse, såsom exomes, eller tilpasset til brugerens præferencer. Disse arrays har den fordel ikke kun at være i stand til præcist genotype en million SNPs per prøve på én gang, men også for at måle kopital variation potentielt afsløringen kromosomafvigelser. Infinium alliancefri OMNI BeadChip arrays i øjeblikket har mulighed for at genotype op til næsten fem millioner markører pr prøve, herunder en halv million brugerdefineret loci, på op til næsten et hundrede prøver hver dag.

Da de fleste sygdomme har en genetisk komponent, kan disse storskalaforsøg være afgørende i at finde gener forbundet med sygdom. High-throughput genotypebestemmelse giver mulighed for en effektiv genotype generation i prøve sætter stor nok til overbevisende afsløre genetisk association ved lavere mindre allelfrekvenserne. Hel-genom genotypebestemmelse projekter kan bruges til at lokalisere områder med statistisk signifikant case-control allelfrekvens eller kopital forskelle ^[9,10,11]. Ifølge National Menneskelige Genome Research Institute, genom-dækkende forening undersøgelser førte til 1.490 separate publikationer mellem November 25, 2008 og 25 januar 2013, stammer fra opdagelsen af 8.283 SNPs med en p-værdi mindre end 1 x 10 ^-5 (se http:// www.genome.gov/gwastudies/). Disse undersøgelser, der forsket vilkår spænder fra højden til testikelkræft, nydt godt af den brede tilgang ydes af en genom-dækkende analyse. I tilfælde som disse, måske hele regioner af interesse have undsluppet varsel havde omfanget af maskinskrivning været for restriktive. Således for store forening analyser, et genom-dækkende genotypebestemmelse teknik er teknik valg.

Forskellige versioner af Infinium analysen findes, hver beregnet til brug med specifikke typer af arrays. Den InfiniumUltra assay, drøftet indgående nedenfor, er egnet til mange 12 - eller 24-sample-chips. Disse ofte genotype over et hundrede tusinde SNPs pr DNA-prøve og fokusere på targeted regioner, såsom på exome eller brugerdefinerede paneler. Kan være påkrævet Andre assay versioner til andre chip typer, såsom de hel-genom genotypebestemmelse arrays. Men som alle Infinium analyser deler et fælles grundlag, og adskiller sig primært kun af reagens navne, reagensvolumener, eller den nøjagtige farvningsreagens procedure, teknikker perfektioneret på en assay-versionen kan ofte anvendes universelt. Andre arrays, såsom methylering arrays, kan bruge en næsten identisk protokol, så godt. Der skal udvises omhu til kun at bruge den version af assayet nødvendige for chip type brug. Nogle typer, såsom dem, der måler genekspression niveau, kan kræve brug af en nonInfinium protokol.

Prøverne skal behandles i partier. For eksempel med InfiniumUltra assay præhybridisering reagensglas indeholder tilstrækkeligt volumen til at køre 96 prøver, og rørene kan ikke genfryses. Derfor skal prøverne køres i partier af 96 prøver ad gangen. Prøverne vil blive forstærket på granert dag. Efter ca 1 time af benchwork, skal prøven opvarmes i en varmluftovn i 20-24 timer. Den følgende dag, næsten 4 timer blive brugt fragmentering, udfældning og resuspendere prøverne, på hvilket tidspunkt prøverne kan enten fryses til fremtidig brug eller hybridiseret til chippen. Henter chips tager næsten 2 timer, hvorefter prøverne vil blive hybridiseret natten over 16-24 timer. På den tredje dag, farvningen og udvidelse skridt tager ~ 4 timer. En yderligere en time vil blive brugt vask, belægning og tørring af chips. Endelig er arrays scannet, hvilket kan tage fra 15 til 60 min / chip, afhængigt af den anvendte type.

Standard laboratorium sikkerhed og renlighed forholdsregler gælder. Selvom amplifikation ikke PCR-baseret, er det nødvendigt separate arbejdsstationer til præ-og postamplification procedurer for at minimere sandsynligheden for forurening. Identifikationsnummeret på hver kit leveret reagens i brug skal være logget på en tracking ark. ReageNTS skal optøs umiddelbart før brug og omvendt flere gange før dispensering. DNA'et, der skal skrives, skal være af høj kvalitet genomisk DNA (260/280 absorbans forholdet 1,6-2,0, 260/230 absorbans forhold på under 3,0) isoleret ved standardmetoder og kvantificeres med et fluorometer. Nedbrydning af DNA ofte er en medvirkende faktor i lav kvalitet analyseresultater. Typisk er 200 ng DNA, der kræves, men dette beløb kan variere for nogle chiptyper. En Tecan væske-håndteringsrobot kan automatisere mange trin i protokollen og minimere menneskelige fejl som en faktor.

Protocol

Day One

1.. Forberedelse

1. Doser 200 ng af DNA i en dyb brønd, 96-prøveplade. Mindst 96 prøver (fuld plader) skal udpladet for at sikre, at ingen reagens vil være spildt. Mærk pladen med en stregkode mærkat leveret af kittet og centrifugere det.
2. For at normalisere mængderne, lade prøverne i en skuffe eller stinkskab natten over for at fordampe væsken. Dæk pladen løst med et låg eller et stykke køkkenrulle til at holde støv.

2. Forstærkning

ADVARSEL: prøver bør ikke undergår forstærkning medmindre 4 timer vil være tilgængelig på den følgende dag for fragmentering, nedbør, og resuspension trin.

1. Fjern selskabet leveret kasse eller pakke af rør mærket "Pre" fra -20 ° C fryser (en tube MA1, MA2, og MSM er tilstrækkelig for hvert sæt af 96 prøver). Sæt rør af MA2 og MSM på bænken til at tø. Tænd korrekt kalibreretovn og sat til 37 ° C.
2. Ved hjælp af en reagens bassin og en 10 ul, 8-kanals pipette, dispensere 4 pi DNA resuspensionsbuffer i hver brønd at rehydrere prøverne. Det er ikke nødvendigt at kassere pipettespidser mellem hver kolonne, hvis er sørget for ikke at røre væske.
3. Med en 8-kanals pipette dispensere 20 ul MA1 i hver brønd i pladen. For hver ny reagens bruge en frisk reagens bassin. Dæk pladen med en genanvendelig forsegling, puls-centrifuge, og vortex i 1 minut ved 1600 rpm på en mikropladeryster.
4. 2.4) inkuberes ved stuetemperatur i mindst 30 min.
5. Dispensér 4 pi 0,1 N NaOH til hver brønd i pladen. Dæk pladen med den genbrugelige segl, puls-centrifuge, og vortex i 1 min ved 1.600 rpm.
6. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min.
7. Doser 34 pi MA2 i hver brønd i pladen.
8. Doser 38 pi MSM i hver brønd i pladen. Dæk pladen medgenanvendelig segl, puls-centrifuge, og vortex i 1 min ved 1.600 rpm.
9. Placér i ovnen i 20-24 timer.

Dag to

3. Fragmentering

1. Fjern FMS rør fra "Post-1" -20 ° C boks (det ene rør er tilstrækkeligt for hvert sæt af 96 prøver). Optø på bænken eller i et rum-temperatur vandbad. Efter indsættelse af MIDI-plade insert i en bordplade microsample inkubationssystem, tænde for varmen blokken og indstilles til 37 ° C.
2. Når rørene er optøet, fjerne prøve plade fra ovnen og puls-centrifuge. Doser 25 pi FMS i hver brønd af DNA-plade. Sæt låget på, puls-centrifuge, og vortex ved 1.600 rpm i 1 min.
3. Inkuber plade i varmeblok i 1 time.

4.. Nedbør

1. Fjern PM1 rør fra "Post-3" 4 ° C kasse eller pakke og varm op til stuetemperatur (det ene rør er tilstrækkeligt for hvert sæt af 96 prøver). Fjern pladen fra varmen blokk og puls-centrifuge.
2. Doser 50 pi PM1 i hver brønd i pladen. Sæt låget på, puls-centrifuge, og vortex ved 1.600 rpm i 1 min.
3. Inkuber plade i varmeblok i 5 min.
4. Fjern pladen fra varmeblok, slukke den, og kassér pladen låget. Doser 155 pi 100% isopropanol i hver brønd i pladen. Cover stramt med en ny låg og manuelt vendes pladen flere gange for at blande.
5. Placer plade i 4 ° C i mindst 30 minutter. Tænd koelecentrifuge og sat til 4 ° C for at køle af.
6. Balance plade og centrifugeres ved 4 ° C i 20 minutter ved 3.000 x g.
7. Undersøg bunden af ​​pladen uden at vende det og bekræft prøverne fældes i en blå pille. Hvis der ikke pellets kan ses, centrifugeres igen. Få papirservietter.
8. Kassér låget og hurtigt at fjerne væsken ved at vende pladen og trykke det hårdt på stationære dækket i papirservietter. Når pladen er inverted, passe på ikke at vende den, mens nogen væske tilbage. Tryk gentagne gange på pladen mod stationære, indtil al væsken er fjernet.
9. Sæt pladen på et reagensglasstativ, inverteret, at tørre. Der inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.

5.. Resuspension

1. Fjern RA1 fra "Post-2" -20 ° C boks og tø i vandbad ved stuetemperatur. Tænd ovnen og sæt den til 48 ° C.
2. Optøede, dispensere 23 pi RA1 til hver brønd i prøvepladen. Hæld ikke hele flaske RA1 i bassinet, gemme 30 ml til senere. Hvis prøverne vil blive hybridiseret på arrays senere samme dag, placere RA1 ind i en 4 ° C koldere. Hvis prøverne vil blive kørt på et senere tidspunkt, mærke flasken og genfryses den RA1.
3. Heat-forsegle en ny låg på pladen. Pulse-centrifuge pladen og læg den i ovnen i 1 time.
4. Tag pladen ud af ovnen og vortex ved 1.800 rpm i 1 min.
   Prøverne kan sikkert være held på dette stadium i op til en uge. Pladerne kan oplagres, og prøver kan omlægges til at forberede perlen chip ansøgning, hvis det er nødvendigt. Hvis du fortsætter med den procedure, lade pladen ved stuetemperatur og slå varmen blok. Ellers opbevare pladen ved -20 ° C.

6.. Hybridisering

ADVARSEL: Prøverne skal ikke gennemgå hybridisering medmindre 5,5 hr findes på den følgende dag for farvning og vask trin.

1. Tænd for varmen blok og sæt den til 95 ° C. Tænd ovnen og sæt den til 48 ° C.
2. Når temperaturen har stabiliseret sig, inkuber pladen på varmeblok i 20 minutter.
3. Mens pladen denaturering, fjerne feltet af perle jetoner fra 4 ° C og sæt den på bænken. Tag en flaske XC4 (fra stuetemperatur kit) og tilsæt 330 ml 100% ethanol. Ryst det brønd og inkuberes ved stuetemperatur natten over. Forbered formamid / EDTA-blanding (95% formamid, 0,2%EDTA (0,5 M), 4,8% _H2O efter volumen) og fryse i separate 15 ml portioner. Overskydende formamid kan oplagres.
4. Prøven fjernes pladen fra varmeblokken. Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter.
5. Mens pladen er køling, forberede hyb kammeret. Et kammer vil være behov for hver fire perle chips behandles.
   Placer en gummimåtte på toppen af ​​hyb bunddel, tilpasse tykkere hul med forsiden af ​​basen. Stregkoden symbol ætset ind i basen skal stadig være synlig (se figur 2).
6. Ved hjælp af en 1.000 gl pipette dispensere 400 pi PB2 i hver af de otte befugtningsfunktionerne reservoirer hugget ind i basen. PB2 kan findes i "Post-3" boks eller pakken. Placer hyb kammerlåg på basen og hægte begge ender ved at lukke to hægter på diagonalt modsatte sider først.
7. Fjern de enkelte sølv packs perle chips fra deres respektive felter, men, for at minimere chips 'expoSørg for at luft og lys, endnu ikke åbne dem. Scan forsigtigt stregkoder af chips og registrere den rækkefølge, som de vil blive læsset på en tracking ark, sammen med boksen ID'er, hvorfra de kom. En grundig forståelse af hvor hver enkelt DNA-prøve vil blive afgivet på perle chips er nødvendig.
8. Fjern de enkelte sølv packs perle chips fra deres respektive felter, men, for at minimere chips udsættelse for luft og lys, endnu ikke åbne dem. Scan forsigtigt stregkoder af chips og registrere den rækkefølge, som de vil blive læsset på en tracking ark, sammen med boksen ID'er, hvorfra de kom. En grundig forståelse af hvor hver enkelt DNA-prøve vil blive afgivet på perle chips er nødvendig.
9. Lige før de 30 min afkøle har afsluttet, skal du åbne sølv perle chip packs. Fjern chips fra deres klare plast ærmer. Uden at røre perlerne placere hver perle chip på en hyb kammer indsætte, orientere chippenstregkode med stregkode symbol ætset ind indsatsen øverste overflade.
10. Skræl og kassér låget af prøven pladen. Tage 15 pi prøve fra prøven pladen og langsomt dispensere på indløbet til array (se figur 3). Skal tages ekstraordinære omhu for at placere den korrekte prøve på den korrekte perle chip i den korrekte position, der matcher perlen chip rækkefølge optaget tidligere. En multikanalpipette kan anvendes til at dispensere væske på de chips, men omtanke skal tages for at aspirere kun antallet af prøver, der kan sikkert anbringes på perlen chip, som antallet af rækker på en plade ikke altid overens med antallet af rækker på en chip.
11. Når hver prøve er blevet placeret på sin tilsvarende array, visuelt inspicere chip til bobler eller regioner, der ikke er belagt i væske. Hvis der findes disse problemer Vip forsigtigt indsatsen. Om nødvendigt kan der tilsættes mere væske til array. Vær omhyggelig med at tilføje den korrekte DNA-prøve.
12. Åbn hyb kammer end placere skærene over befugtningsfunktionerne reservoirer. Stregkoden af ​​chippen skal placeres over stregkoden ætset ind i hyb bunddel. Sæt dækslet hyb kammer og luk alle fire hægter ved at lukke hægter på diagonalt modsatte sider først.
13. Inkubér hyb kammer i ovnen i 16-24 timer. Pas på ikke at vippe kamrene, når du flytter dem.
14. Hvis mere end én plade skal behandles, tilbage til trin 6.2. Forarbejdning mere end 24 perle chips i dag ikke anbefales for at både at minimere sandsynligheden for menneskelige fejl, når du håndterer en stor mængde af forbrugsstoffer eller chips og for at minimere mængden af ​​tid, der kræves til at behandle chips i fremtidige tiltag, som pleje skal skal træffes for at begrænse deres eksponering for luft så meget som muligt. En flaske XC4 er tilstrækkelig til op til 24 perle chips.

Dag tre

7.. Farvning Forberedelse

1. Fjern Hyb kamre fra ovnen, og der inkuberes ved stuetemperatur temperature i 25 min. Hvis forarbejdning mere end to Hyb kamre, forskyde deres dobbelte fjernelse hver 10 min. For at holde chips fra tørring, endnu ikke åbne Hyb kamre.
2. Mens Hyb kamre er køling, fjerne rør af XC1, XC2, TEM, STM og ATM fra "Post-1" -20 ° C box og sæt på bænken til at tø. Tag en flaske RA1 fra "Post-2"-boksen ved -20 ° C (eller 4 ° C, hvis genbruge reagenset fra den foregående dag) og tøbrud i et vandbad ved stuetemperatur. Optø et rør af 95% formamid samt. Til 8 perle chips forarbejdede, to rør af hver reagens, 10 ml RA1, 15 ml formamid og 150 ml XC3 (fundet i et rum-temperatur, firma leveret boks) vil være påkrævet.
3. For hver chip behandlet, vil et glas dias, én plast gennemstrømning tandbøjle, to metalhægter, og en plastikafstandsstykket være påkrævet. For plastklemmeskiven, kun bruge den klare én, adskille og kassere den uigennemsigtige spacer. Derudover to perle chip vask retter ogen perle spånbakke vil være behov for, sammen med en væske samling station og én plast montage bar.
4. Rengør objektglas ved at sprøjte dem med ethanol og tørre dem tørre.
5. Tænd for varmt vandbad, der er knyttet til gennemstrømningskammeret rack og sæt den til 44 ° C. Ryst forsigtigt kammeret rack at løsne eventuelle bobler.
6. Når hyb kammer er afkølet i 25 minutter, fylde en vask skål med PB1 (ca. 200 ml). PB1 kan findes i "Post-4" stuetemperatur kassen.
7. Åbn en hyb kammer. Fjern låget segl fra en perle chip ved at gribe forseglingen i det ene hjørne og forsigtigt peeling diagonalt (se figur 4). Når forseglingen er fjernet, anbringes straks chip i en perle chip bakke og nedsænkes i PB1 uden at røre perlerne. Gentag indtil bakken er fyldt med perle chips, pas på ikke at lade nogen chip tørre.
8. Omryst forsigtigt bakken for at fjerne eventuelle bobler og lade chips neddykket i 1 min.Fyld en anden vask skål med PB1. Ryst bakken igen.
9. Flyt bakke perle chips i den anden vask parabol. Ryst forsigtigt, og lad trække i 1 min, så agitere igen.
10. I det flydende gennemstrømning samling station, skal du placere fire sorte plastik gennemstrømning seler i rillerne. Fyld station med PB1 indtil væsken næsten når højden af ​​de otte montage beslag (ca. 150 ml).
11. Fjern en perle chip fra bakken, og læg det i forsamlingen station på en plast gennemstrømning tandbøjle. Chippen stregkode bør tilpasses over stregkoden symbol ætset ind i forsamlingen station. Gentag for de andre tre chips, der kan passe ind i forsamlingen station.
12. Placer en klar plast spacer på toppen af ​​en perle chip. De ydre kanter af spacer bør omgive beslagene inden forsamlingen station. Gentag for de andre chips nedsænket i PB1.
13. Placer plastik montage bar i forsamlingen station ved at montere det over rillerne. Forsigtigt placere et objektglas på toppen af ​​plastikafstandsstykket ved at skubbe bagenden af ​​slæden mod samlingen bar og langsomt sænker den forreste i væsken. Den rille på toppen af ​​slæden skal vende nedad, direkte over stregkoden af ​​chippen, hvilket efterlader et mellemrum mellem vulsten chip og slæden stregkoden ende. Gentag for de andre chips nedsænket i PB1. For en komplet gennemstrømning montageskitse, se figur 5.
14. Check for bobler mellem chippen og dias. Hvis bobler, blidt hæve slide på stregkoden ende og prøv igen. Vedvarende bobler kan tørres fra glasset med en papir laboratorium håndklæde (Kimwipe).
15. Snap to metalclips omkring objektglas, den ene mod stregkoden ende og en bagud. Kanterne af hægter bør gribe plast gennemstrømning tandbøjle under chippen. Gentag for hver chip nedsænket i PB1.
16. Fjern de afsluttede gennemstrømning forsamlinger og placere vandret på bench. Pas på ikke at tippe forsamlingen lodret, så væsken under objektglasset til at flygte. Hvis flere chips venter i vask bakken, kan de samles under samme PB1. Hvis andre chips venter i deres oprindelige Hyb kamre, kasseres alt væske i forsamlingen station og vaske tallerkener, og vende tilbage til trin 7.6.
17. Når alle perle chips er i deres gennemstrømning forsamlinger, tage et par kirurgiske saks og klippe begge ender af spacer slukket, så tæt på objektglasset som muligt.

8.. Farvning og Extension

1. Kontroller, at gennemstrømningskammeret rack har nået 44 ° C i flere positioner med en temperaturføler. Hvis temperaturen er forskudt med mere end en halv grad justere temperaturen af ​​vandbadet.
2. Placer en perle chip gennemstrømning montage på kammeret rack ved at skyde samlingen ned og påsætte bøjlen foroven. Bagsiden af ​​perlen chip skal røre kammeret rack. Den glass slide bør udad med rillen i toppen for at danne et reagens reservoiret. Gentag for hver perle chip montage.
3. Ved hjælp af en 200 gl pipette tilsættes 150 ul RA1to gennemstrømning forsamlinger ved at dosere væsken i glasset reservoiret. Inkuber i 30 sek. Gentag 5x.
4. Ved hjælp af en 1.000 gl pipette tilsættes 450 ul XC1to gennemstrømning forsamlinger ved at dosere væsken i glasset reservoiret. Inkuber i 10 min.
5. Tilføj 450 pi XC2 til gennemstrømning forsamlinger ved at dosere væsken i glasset reservoiret. Inkuber i 10 min.
6. Tilsæt 200 ul TEM til gennemstrømning forsamlinger ved at dosere væsken i glasset reservoiret. Inkuber i 15 minutter.
7. Tilføj 450 pi 95% formamid / EDTA-mix til gennemstrømning forsamlinger ved at dosere væsken i glasset reservoiret. Der inkuberes i 1 min. Gentag 1x.
8. Inkubér gennemstrømning forsamlinger i 5 min.
9. Indstil varmt vandbad til den temperatur leksisteret på rørene af STM (eller 37 ° C, hvis der ikke er vist). Sørg for, at hver STM rør har samme temperatur opført.
10. Tilføj 450 pi XC3 til gennemstrømning forsamlinger. Der inkuberes i 1 min. Gentag 1x.
11. Når det varme vandbad temperatur har nået den ønskede temperatur, tilsættes 250 μLSTM til gennemstrømning forsamlinger ved at dosere væsken i glasset reservoiret. Inkuber i 10 min.
12. Tilføj 450 pi XC3 til gennemstrømning forsamlinger ved at dosere væsken i glasset reservoiret. Der inkuberes i 1 min. Gentag 1x.
13. Inkubér gennemstrømning forsamlinger i 5 min.
14. Tilsæt 250 ul ATM til gennemstrømning forsamlinger ved at dosere væsken i glasset reservoiret. Inkuber i 10 min.
15. Tilføj 450 pi XC3 til gennemstrømning forsamlinger ved at dosere væsken i glasset reservoiret. Der inkuberes i 1 min. Gentag 1x.
16. Inkubér gennemstrømning forsamlinger i 5 min.
17. Tilsæt 250 ul STM til gennemstrømningsamlinger ved dispensering af væsken i glasset reservoiret. Inkuber i 10 min.
18. Add4 50 gl XC3 til gennemstrømning forsamlinger ved at dosere væsken i glasset reservoiret. Der inkuberes i 1 min. Gentag 1x.
19. Inkubér gennemstrømning forsamlinger i 5 min.
20. Gentag trin 8,14-8,19 1x.
21. Fjern gennemstrømning forsamlinger fra kammeret rack og slukke for vandbad.

9.. Vask og Sealing

1. Fyld en farvning perle chip vask fad med PB1 (ca. 315 ml). To lodrette vask retter og en lodret perle spånbakke vil være behov for, sammen med mindst en vakuummanifold.
2. Skil en gennemstrømnings-samling ved at indsætte en tynd metalstang mellem hægter og bøjlen og derefter vippe. Braklægning objektglasset og fjerne perlen chip. Umiddelbart placere perlen chip i lodret perle spånbakke og dykke i PB1. Gentag for hver gennemstrømning samling, der tager sig til ansigt each perle chip i samme retning og minimere deres eksponering for luft.
3. Ryst forsigtigt perlen spånbakke at fjerne bobler. Inkubér nedsænkede perle chips i PB1 i 5 min. Fyld den anden lodrette vask skål med XC4 forberedt den foregående dag. Ryst perlen spånbakke igen.
4. Flyt perle spånbakke til vask fad fyldt med XC4. Omryst forsigtigt bakken for at fjerne bobler. Inkuber i 5 minutter og omrør igen.
5. I en glidende bevægelse, trække perlen spånbakke fra vask skålen og sæt på et reagensglas rack, så perler på hver perle chip ansigt opad. Med selvlåsende pincet skubbe en perle chip ud af bakken, og læg på et reagensglas rack. Gentag for hver perle chip.
6. Overføre forsigtigt reagensglasstativ af chips til vakuum. Luk og tænd for vakuum, der sikrer en ordentlig forsegling. Inkuber i 50-55 min. Hvis det er nødvendigt, varme op scanneren under inkubation.

10.. Scanning

1. Turn af for vakuumet og langsomt vende trykket til atmosfærisk. Kontroller, at perle chips er tørre. Hvis det er nødvendigt, tørre kanter og bunden af ​​chip med en køkkenrulle til at fjerne enhver væske eller snavs.
2. Aktiver scanning software og flytte perle chips til scanning bakke. Hent chippen afkode de filer (dmaps) ved at aktivere Decode File Client software og indtaste de ønskede perle chip stregkoder, sammen med deres tilsvarende box-id'er. Uscannet perle chips kan sikkert opbevares i et tørt, mørkt område i op til 72 timer.
3. Når chips er placeret korrekt i bakken, og afkode de filer er anerkendt af softwaren, starte scanning.

Representative Results

En korrekt forarbejdede perle chip skal vise lyse og tydelige røde og grønne laser-lys intensiteter, mens den scanner. I figur 6, viser iScan scanning software en standard genomisk DNA-prøve med succes hybridiseret til en brugerdefineret panel SNP genotypebestemmelse array. De mærkede nukleotider, der var knyttet i den forlængede og pletter trin fluorescerer under lysene i de to lasere. Da disse nukleotider selektivt udvide perlens oligonukleotidkæde hybridiseret til fragmenterede DNA-streng, og som oligonucleotid kæder er designet til at afslutte på stedet for varianten, kan farven og styrken af ​​det resulterende signal anvendes til at bestemme de alleler var til stede på SNP-stedet.

En bruger-genereret prøve plade, der matcher prøve-id'er og kliniske oplysninger til chipID og position, og en række specifikke SNP manifest, der fås direkte fra virksomheden, er begge nødvendige for at importere SCAnner output filer i GenomeStudio analyse software. Eksempel prøveark kan findes på selskabets hjemmeside. Når GenomeStudio projektet er bygget, kan genotyper fås fra de resulterende intensitet klynger automatisk genereret af softwaren. Selvom der findes flere visningsmuligheder, standardvisningen, Norm-R (en normaliseret intensitet værdi) vs Norm-Theta (en allel intensitet ratio), er ofte den letteste plot at differentiere tre forskellige klynger. De fleste SNPs bør udvise en, to eller tre klynger, afhængigt af den mindre allel frekvens.

De tre klynger repræsenterer prøver demonstrerer AA, AB, eller BB alleler (se figur 7). Disse klynger kan tildeles genotyper enten ved at importere en standard klyngedannelse position skabelon direkte fra virksomheden, ved at vælge "Cluster All SNPs" fra værktøjslinjen Analyse af softwaren eller ved at klikke og trække de farvede cirkler på intensiteten grunde til manuelt at EDI t opkald. Farven af ​​prøven på intensiteten plot (rød, lilla eller blå) angiver opkaldet (AA, AB, eller BB, henholdsvis), sort angiver ingen opkald. Ved at rulle gennem SNPs opført i ruden Fuld Data for software, kan klyngedannelse for hver SNP ses eller mindes. Når klyngerne er tildelt tilfredsstillende opkald, viser den fulde data rude af softwaren genotyperne for hver enkelt prøve ved hver enkelt SNP. Kolonnevælgeren option over bordet kan skifte dataformater.

Data kan eksporteres enten gennem værktøjslinjen Analyse eller direkte fra Full data tabel for dybdegående analyse.

Figur 1. Oversigt - Infinium Assay-protokollen.683/50683fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.

Figur 2. Komplet Hyb Chamber base og mat, plus låg. ^[12] Klik her for at se større billede .

Figur 3 Loading en Beadchip -.. Doser prøven på indløbsportene ^[12] Klik her for at se større billede.

Figur 4 Fjernelse af Beadchip Coverseal -.. Tag fat forseglingen på hjørnet og forsigtigt skræl diagonalt ^[12] Klik her for at se større billede .

Figur 5. Komplet Beadchip Flow-through forsamling - Den BeadChip er adskilt fra en glasplade med en spacer og bundet med hægter.> Klik her for at se større billede.

Figur 6. Vellykket BeadChip Scan - A) BeadChip scannes med både en rød og grøn laser scanningssoftwaren viser både samtidigt. Sektioner passerer intensitet QC vil fremhæve grøn på BeadChip displayet til venstre. Sektioner svigtende intensitet QC vil fremhæve rødt på BeadChip display. B) Når scanningen er færdig, vil softwaren overlejrer de røde og grønne skærme. En indzoomet billede vises. Farven og intensiteten af hver enkelt perle indikerer allel tilstede. Klik her for at se større billede .

Figur 7. SNP NORM-R vs NORM-Theta Cluster Profiler - A) Et gyldigt SNP med tre forskellige klynger, der repræsenterer AA, AB og BB genotyper, farvet rød, lilla og blå B) En SNP kræver redigering.. Den midterste klynge, som bør være homozygote AB er venstre un-kaldes. BB klynge er fejlagtigt kaldet AB. C) En dårlig udførelse SNP. Ingen genotyper kan fås fra denne intensitet plot, som der ikke findes adskilte klynger. Klik her for at se større billede .

Discussion

Storstilet genotypebestemmelse applikationer er blevet brugt til bedre at forstå den genetiske mekanisme bag mange menneskelige sygdomme. Opdagelsen af ​​nogen væsentlig variant gennem en genom-dækkende forening analyse kan afmærke en kandidat region for yderligere undersøgelse. Desuden genotype data er et godt redskab til kvalitetskontrol på sekventering projekter.

For at maksimere prøve gennemløb, kan flere prøveplader blive forstærket og gemt i deres fragmenterede, resuspenderet stater. Otte pladerne kan forstærkes på en enkelt dag, der kombinerer den første 24 timers af protokollen for flere partier og give nok materiale til ~ 2-8 dage af chip-bearbejdning. Hvis forstærkede plader oplagret på forhånd, og hvis nye prøver hybridiseres til chips straks efter scanningen begynder på tidligere løb, kan behandlingen køre kontinuerligt uden behov for at holde pause for yderligere prøveforberedelse. Derfor vil selvom prøverne tage tre dage at gennemgå den fuldstændigeassay kan data genereres dagligt. Assuming24 chips behandles hver dag, en 5 dages arbejdsuge giver mulighed for mere end en 1.000 DNA-prøver, der skal køres på en 12-prøve perle chip. Hvis nogen skridt eller reagens mislykkedes dog muligvis flere partier være i risiko for dårlige resultater, før nogen korrektion kan anvendes. Fejl kan slippe varsel, indtil arrays scannes eller analyseres, og derfor hvis gennemløb er maksimeret, hundredvis af prøver i forskellige stadier af protokollen måske allerede har modtaget den samme defekt behandling efter opdagelsen. Som mistede reagenser og data ikke kan inddrives, skal brugeren afveje disse risici i forhold til behovet for en hurtigere arbejdsgang.

Den GenomeStudio analyse software er den første chance for virkeligt at måle succesen af ​​genotypebestemmelse processen. Hvis Norm-R vs Norm-Theta intensitet plots er korrekt grupperet, skal den gennemsnitlige takst (procent af samlet SNPs succes indtastes) af prøverne nærmer 99%, selv om denne værdi varierer SLIghtly afhængig matrix type. Dataene fra en prøve med en opfordring lavere end 85-90% er ikke troværdige og bør kasseres. For kvalitetskontrol formål skal resultaterne ses i forhold til alle tidligere kendte genotyper muligt. Hvis der ikke findes sådanne oplysninger, forsætlig prøve dobbeltarbejde er et nyttigt redskab i at kontrollere plade eller array-placeringer. Disse to eksemplarer par bør placeres på separate chips, plader, batches, eller projekter, deres genotyper tjekket ved generation. Mens specifikke QC begrænsninger varierer efter investigators præference er almindelige SNP begrænsninger baseret på stikprøve opkald succes, Hardy-Weinberg ligevægt, eller missingness mellem cases og kontroller, mens de fælles prøve begrænsninger er baseret på takster, mendelske uoverensstemmelser eller krydshenvisninger X-kromosom heterozygositet kliniske køn data ^[13].

Opstår der problemer, Kontrolelementer Dashboard, der findes i analysen suite, kan indsendes tilselskab med henblik på at fastslå årsagen. Disse kontroller kan ofte indsnævre problemet til den mest sandsynlige trin eller reagens fiasko. Hvis der SNPs af interesse findes gennem en Infinium genotypebestemmelse eksperiment, deres intensitet plots være dobbelt-tjekket i GenomeStudio for klyngedannelse fejl, før yderligere forskning gennemføres.

En mislykket Infinium genotypebestemmelse eksperiment skyldes sandsynligvis forarbejdning fejl menneskers eller dårlig kvalitet input DNA. Prøve kvantificering skal være korrekte og præcise. For de bedste resultater, eventuelle reagenser tilsættes en stikprøve eller chip skal hældes på lydstyrken sat af protokollen. Pipetter skal være behørigt kalibreret. Reagenserne bør ikke løbe efter udløbet og bør ikke genfryses Optøede, bortset fra RA1 reagens. For at minimere eventuelle farvning og udvidelse fejlene bør formamid / EDTA-blanding fremstilles frisk hver måned. Alle -20 ° C reagenser skal opbevares i kun manuel afrimning frysere. Alt laboratorieudstyr anvendt i staining bør udvidelse, og vaske dele af protokollen skal skylles grundigt med vand og et mildt rengøringsmiddel straks efter ude af brug. Befugtningsopløsningen reservoirer i hyb kammer skal skrubbes med et reagensglas børste og et mildt rengøringsmiddel. De objektglas skal vaskes med 10% blegemiddel, efter instruks fra deres brugermanualer, en gang om ugen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumable or Equipment	Manufacturer	Part Number	Minimum Required for 96 Samples
0.8 ml Deep Well Plate	Thermo Scientific	AB-0765	1
Plate Mats	Thermo Scientific	AB-0674	2
Reagent Basin	Fisher Scientific	13-681-502	9
Heat-seal Sheets	Thermo Scientific	AB-0559	1
Flow-through Spacer	Fisher Scientific	NC9563984	6
Pipette tips - 200 μl	Rainin	GP-L200F	192
Pipette tips - 10 μl	Rainin	GP-L10F	16
Pipette tips - 1,000 μl	Rainin	GP-L1000F	16
DNA Suspension Buffer	Teknova	T0220	0.5 ml
0.1 N NaOH	Fisher Scientific	AC12419-0010	0.5 ml
Isopropanol (HPLC grade)	Fisher Scientific	A451	15 ml
Ethanol (200-proof)	Sigma-Aldrich	459836	330 ml
Formamide (100%)	Thomas Scientific	C001K38	15 ml
EDTA (0.5 M)	Amresco	E177	0.2 ml
10 μl 8-channel Pipette	Rainin	L8-10XLS	1
200 μl 8-channel Pipette	Rainin	L8-200XLS	2
1,000 μl Single-channel Pipette	Rainin	L-1000XLS	1
Microplate Shaker	VWR	13500-890	1
Refrigerated Microplate Centrifuge	VWR	BK369434	1
Hybridization Oven	Illumina	SE-901-1001	1
Hybex Microsample Incubator	SciGene	1057-30-0	1
Hybex MIDI Heat Block Insert	Illumina	BD-60-601	1
Heat Sealer	Thermo Scientific	AB-0384	1
Hyb Chamber w/ Insert and Mat	Illumina	BD-60-402	2
Surgical Scissors	Fisher Scientific	13-804-20	1
Flow Through Assembly Parts	Illumina	WG-10-202	8
Wash Rack and Dish	Illumina	BD-60-450	1
Genepaint Chamber Rack	Tecan	760-800	1
Temperature Probe	Illumina	A1-99-109	1
Staining Rack and Dish	Illumina	WG-10-207	1
Self-Closing Tweezers	Ted Pella, Inc	5374-NM	1
Vacuum Manifold	Ted Pella, Inc	2240	1
iScan or HiScan	Illumina	-	1