Summary
Ett protokoll beskrivs som använder Illumina s Infinium analyser att utföra storskalig genotypning. Dessa analyser kan tillförlitligt genotyp miljoner SNP över hundratals enskilda DNA-prov i tre dagar. En gång skapats kan dessa genotyper användas för att kontrollera för föreningar med en mängd olika sjukdomar eller fenotyper.
Abstract
Genotypning varianter i det mänskliga genomet har visat sig vara en effektiv metod för att identifiera genetiska associationer med fenotyper. Fördelningen av varianter inom familjer eller populationer kan underlätta identifiering av de genetiska faktorerna till sjukdom. Illumina s panel av genotypning BeadChips låter utredare till genotyp tusentals eller miljontals single nucleotide polymorphisms (SNP), eller för att analysera andra genomiska varianter, till exempel antal kopior, över ett stort antal DNA-prover. Dessa SNP kan spridas över hela genomet eller riktade i specifika områden för att maximera potentialen upptäckt. Den Infinium analysen har optimerats för att snabbt ge hög kvalitet, korrekta resultat. Med rätt inställning, kan en enda tekniker bearbeta från några hundra till över tusen DNA-prov per vecka, beroende på vilken typ av matris. Denna analys guidar användaren genom varje steg, med början med iskt DNA och slutar med skanning av arrayen. Använda propriety Reagents, prover förstärks, fragmenterad, fälls, suspenderas, hybridiserade till chip, förlängas med en enda bas, färgas, och skannas på antingen en iScan eller Hi Scan högupplösta optiska bildsystem. En övernattning steg krävs för att förstärka DNA. DNA denatureras och isotermt förstärks av hel-genom förstärkning, och därför är ingen PCR behövs. Proverna hybridiseras till uppsättningarna under en andra över natten steg. Genom den tredje dagen, proverna är redo att skannas och analyseras. Amplified DNA kan lagrade i stora mängder, vilket gör pärla arrayer som ska behandlas varje dag i veckan och därmed maximera genomströmningen.
Introduction
Skriva single nucleotide polymorphisms (SNP) är en viktig metod för att identifiera riskvarianter i samband med sjukdom. Historiskt sett har omfattningen av genotypning experiment begränsats av tillgänglig teknik. Gelelektrofores-baserade genotyping metoder är begränsade i samplings-och SNP-throughput [1]. Att utveckla dessa analyser kan ofta vara arbetsintensiv, att förlita sig på smink och strukturen i regionen som omger varianten för optimering [1]. TaqMan genotypning analyser, som utvecklats av Life Technologies, kan köra ett stort antal prover snabbt och med minimal tekniker engagemang [2], men SNP-multiplexering begränsningar fortsätter att begränsa det totala antalet genotyper till väl under en miljon per dag [3,4 ]. Sequenom s IPLEX plattform kan också köra många prover på en gång, men som färre än hundra SNP kan hopmultiplexerade, är genomströmningen jämförelsevis låg total [5]. Beckman Coulter s SNP stream-teknikkan teoretiskt producera över tre miljoner genotyper per dag, men den här teknikens gränser projektområde till maximalt bara fyrtioåtta SNP per reaktion [4,6]. Medan Goldengate-analysen kan behandla nästan tvåhundra DNA-prover varje dag på hundratals eller tusentals SNP per prov, inte konkurrera med avancerade, ultra-high-throughput tekniker priset per genotyp när du skriver över tre tusen SNP på en gång [4,7 ]. För att behandla flera miljoner genotyper per dag, den omfattning som krävs för stora genomet hela föreningen studier har array-hybridiseringsanalyser blivit det mest kostnadseffektiva alternativet på marknaden.
Affymetrixs linje hybridisering matriser och Illumina linje Infinium-baserade matriser tillåter potentiellt hundratals prover som skall skrivas på hundratusentals eller miljontals SNP parallellt [4,8]. Dessa SNP kan vara utspridda över hela genomet, lokaliserade i områden av intresse, såsom exomes, eller anpassas till användarens önskemål. Dessa matriser har fördelen av att inte bara kunna korrekt genotyp en miljon SNP per prov på en gång, men också för att mäta antalet exemplar variation, potentiellt avtäckningen kromosomavvikelser. Infinium-inriktade OMNI BeadChip arrayer närvarande har förmågan att genotypa upp till nästan fem miljoner markörer per prov, inklusive en halv miljon unika loci, på upp till nästan hundra prover per dag.
Eftersom de flesta sjukdomar har en genetisk komponent, kan dessa storskaliga försök vara avgörande för att hitta gener som är förknippade med sjukdomen. Hög kapacitet genotypning möjliggör effektiv genotyp generation i prov sätter tillräckligt stor för att på ett övertygande sätt påvisa genetisk association vid lägre smärre allelfrekvenser. Hel-genom genotypning projekt kan användas för att lokalisera områden med statistiskt signifikant fall-kontroll allelfrekvens eller kopiera sifferskillnader [9,10,11]. Enligt National Human Genome Research Institute, genomet hela föreningen studier ledde till 1,490 separata publikationer mellan November 25, 2008 och jan 25, 2013, till följd av upptäckten av 8283 SNP med ett p-värde mindre än 1 x 10 -5 (se http:// www.genome.gov/gwastudies/). Dessa studier, som forskat villkor som sträcker sig från höjd till testikelcancer, dragit nytta av bred ansats ges av en genomet hela analysen. I fall som dessa, kanske hela regioner av intresse ha undgått varsel hade omfattningen av typning varit alltför restriktiv. Således, för storskalig förening analyser, är en genomet hela genotypning teknik tekniken med valet.
Olika versioner av Infinium analysen finns, var och en avsedd för specifika typer av arrayer. Den InfiniumUltra analysen diskuteras ingående nedan, är lämplig för många 12 - eller 24-prov array chips. Dessa genotyp ofta över hundra tusen SNP per DNA-prov och fokusera på targeted regioner, till exempel på exome eller anpassade paneler. Andra analys versioner kan krävas för andra chiptyper, såsom hel-genomet genotypning arrayer. Men som alla Infinium analyser har en gemensam grund och främst skiljer sig endast genom reagensnamn, reagensvolymer, eller den exakta färgningsreagens förfarande, tekniker fulländat på en analys version kan ofta vara allmänt tillämpas. Andra matriser, såsom metylering arrayer, kan använda en nästan identiskt protokoll, liksom. Försiktighet måste vidtas för att endast använda den version av analysen som krävs för chip typ används. Några typer, såsom sådana som mäter genuttryck nivå, kan kräva användningen av en nonInfinium protokoll.
Proverna skall behandlas i omgångar. Till exempel, med InfiniumUltra analysen prehybridisering reagensrören innehåller tillräckligt med volym för att köra 96 prover, och rören kan inte frysas. Därför måste prover köras i partier om 96 prover åt gången. Proverna kommer att förstärkas på granarnat dag. Efter ca 1 h av benchwork måste proverna upphettas i en konvektionsugn under 20-24 timmar. Följande dag kommer nästan 4 tim att spend fragmentering, utfällning och återsuspendering av prover, vid vilken punkt proverna kan antingen frysas för framtida användning eller hybridiserade till chipet. Laddar marker tar nästan två timmar, varefter prover kommer att hybridiseras över natten till 16-24 timmar. På den tredje dagen, tar färgning och förlängningssteg ~ 4 tim. En ytterligare timme kommer att spend tvättning, beläggning och torkning av chipsen. Slutligen är de arrayer skannas, vilket kan ta 15-60 min / chip, beroende på vilken typ som används.
Standardlaboratorie säkerhet och renlighet säkerhetsåtgärder gäller. Även förstärkningen inte PCR-baserad, separata arbetsstationer för pre-och postamplification förfaranden är nödvändiga för att minimera risken för kontaminering. Det identifieringsnummer för varje sats-levereras reagens som används måste vara inloggad för ett spårningsblad. Reagents ska tinas omedelbart före användning och inverterad flera gånger innan dispensering. Den DNA som skall skrivas måste vara av hög kvalitet genom-DNA (260/280 absorbansförhållande av 1,6 till 2,0, 260/230 absorbansförhållande av under 3,0), isoleras enligt standardmetoder och kvantifierades med en fluorometer. Nedbrytning av DNA är ofta en bidragande faktor i låg kvalitet analysresultat. Normalt är 200 ng av DNA som krävs, även om detta belopp kan variera för vissa chiptyper. En Tecan vätskehanteringsrobot kan automatisera många steg i protokollet och minimera den mänskliga faktorn som en faktor.
Protocol
Dag ett
1. Framställning
- Dispensera 200 ng av DNA i en djupbrunns, 96-provplattan. Minst 96 prover (fullständiga plattor) måste vara pläterad för att säkerställa att inget reagens kommer att slösas bort. Märk plattan med en streckkod klistermärke levereras av satsen och centrifugera det.
- För att normalisera volymer lämnar proverna i en låda eller dragskåp över natten för att förånga vätskan. Täck plattan löst med ett lock eller en pappershandduk för att hålla ute damm.
2. Amplifiering
VARNING: prover bör inte genomgå förstärkning om inte 4 tim kommer att finnas på följande dag för splittrings, nederbörd, och resuspension steg.
- Ta företaget levererad låda eller förpackning av rör märkta "Pre" från -20 ° C frys (en tub MA1, MA2, och MSM är tillräcklig för varje uppsättning av 96 prover). Ställ rör av MA2 och MSM på bänken för att tina. Slå på ordentligt kalibreradugn och inställd på 37 ° C.
- Med hjälp av ett reagens handfat och en 10 | il, 8-kanals-pipett och dispensera 4 pl av DNA Resuspension Buffer i varje brunn för att rehydrera proverna. Det är inte nödvändigt att göra sig av pipettspetsar mellan varje kolonn om man är försiktig att inte röra vätska.
- Med ett 8-kanals-pipett och dispensera 20 | il av MA1 i varje brunn i plattan. För varje ny reagens, använd en ny reagens bassäng. Täck plattan med en återanvändbar tätning, puls-centrifug, och skaka i 1 min vid 1.600 rpm på en mikro shaker.
- 2,4) Inkubera vid rumstemperatur under åtminstone 30 min.
- Dispensera 4 | il av 0,1 N NaOH i varje brunn i plattan. Täck plattan med återanvändbara tätnings, puls-centrifug, och skaka i 1 min vid 1.600 rpm.
- Inkubera vid rumstemperatur i 10 min.
- Fördela 34 l av MA2 i varje brunn i plattan.
- Dispensera 38 pl av MSM i varje brunn i plattan. Täck plattan medåteranvändbar tätning, puls-centrifug, och skaka i 1 min vid 1.600 rpm.
- Ställ i ugnen i 20-24 timmar.
Dag två
3. Fragmentering
- Avlägsna FMS rören från "Post-1" -20 ° C lådan (ett rör är tillräcklig för varje uppsättning av 96 prover). Tina på bänk eller i ett rum-temperatur vattenbad. Efter att du satt MIDI-platta insatsen i en bordsskiva mikroprov inkubationssystemet, slå på värmeblocket och satt till 37 ° C.
- När rören tinas, ta bort provplatta från ugnen och puls-centrifug. Dispensera 25 ul av FMS i varje brunn av DNA-plattan. Sätt tillbaka locket, puls-centrifug, och virveln vid 1.600 rpm i 1 minut.
- Inkubera plattan i värmeblock under en timme.
4. Utfällning
- Avlägsna PM1 röret från "Post-3" 4 ° C låda eller packa och värmas till rumstemperatur (ett rör är tillräcklig för varje uppsättning av 96 prover). Ta bort plattan från värmeblocketk och puls-centrifug.
- Dispensera 50 pl av PM1 i varje brunn i plattan. Sätt tillbaka locket, puls-centrifug, och virveln vid 1.600 rpm i 1 minut.
- Inkubera plattan i värmeblock i 5 min.
- Ta bort plattan från värmeblock, stänger av den och kasta locket plattan. Dispensera 155 ul av 100% isopropanol i varje brunn i plattan. Täck ordentligt med ett nytt lock och vänd plattan flera gånger för att blanda.
- Placera plattan i 4 ° C i minst 30 min. Slå på kyld centrifug och inställd på 4 ° C för att svalna.
- Balans plattan och centrifugera vid 4 ° C under 20 min vid 3000 x g..
- Inspektera botten av plattan utan att invertera den och bekräfta proven utfälldes i en blå pellet. Om inga pellets kan ses, centrifugera igen. Få pappershanddukar.
- Kasta bort locket och snabbt ta bort vätskan genom att vända plattan och knacka den med kraft på bänk täckt av pappershanddukar. När plattan är inverted, se till att inte återgå det medan någon vätska kvar. Upprepade knacka plattan mot bänk tills all vätska avlägsnas.
- Placera plattan på ett provrörsställ, inverteras, för att torka. Inkubera vid rumstemperatur under 1 timme.
5. Resuspension
- Avlägsna RA1 från "Post-2" -20 ° C låda och tina i rumstemperatur vattenbad. Sätt på ugnen och ställ in den på 48 ° C.
- När tinats, dosera 23 l av RA1 till varje brunn i provplattan. Häll inte hela flaska RA1 i bassängen, spara 30 ml för senare. Om proverna kommer att hybridiseras på de arrayer senare samma dag, placera RA1 i en 4 ° C svalare. Om proverna kommer att köras vid ett senare tillfälle, märka flaskan och frysas i RA1.
- Värmeförseglings ett nytt locket på plattan. Puls-centrifug plattan och placera den i ugnen i 1 timme.
- Ta ut plåten ur ugnen och skaka vid 1.800 rpm i 1 minut.
Proverna kan säkert vara hELD i detta skede för upp till en vecka. Plattorna kan vara lagrade, och prover kan omorganiseras för att förbereda pärlan chip ansökan, om det behövs. Om du fortsätter med proceduren, lämna plattan vid rumstemperatur och slå på värmeblocket. Annars lagrar plattan vid -20 ° C.
6. Hybridisering
VARNING: Prov bör inte genomgå hybridisering om 5,5 tim finns på följande dag för färgning och tvätta steg.
- Slå på värmeblocket och ställ in den på 95 ° C. Sätt på ugnen och ställ in den på 48 ° C.
- När temperaturen har stabiliserats, inkubera plattan på värmeblock under 20 min.
- Medan plattan är denaturering, ta bort rutan för pärla chips från 4 ° C och ställ in den på bänken. Ta en flaska XC4 (från rumstemperatur kit) och tillsätt 330 ml 100% etanol. Skaka väl och inkubera vid rumstemperatur över natten. Förbered formamid / EDTA-blandning (95% formamid, 0,2%EDTA (0,5 M), 4,8% H2O räknat på volym) och frysa i separata 15 ml-inkrement. Överskott formamid kan lagrade.
- Ta provplattan från värmeblocket. Inkubera vid rumstemperatur i 30 min.
- Medan plattan kylning, förbereda Hyb kammaren. En kammare kommer att behövas för varje fyra pärla marker behandlas.
Placera en gummimatta på toppen av Hyb kammarbasen, rikta den tjockare hålet med framsidan av basen. Streckkods symbol etsad i basen ska fortfarande vara synligt (se figur 2). - Med hjälp av en 1000 l pipett, dispensera 400 l av PB2 i var och en av de åtta befuktning reservoarer ristade in i basen. PB2 finns i "Post-3" låda eller förpackning. Placera locket på Hyb kammaren på basen och knäppa båda ändar genom att stänga två spännen på diagonalt motsatta sidor först.
- Ta bort de individuella silver förpackningar av bead chips från sina respektive boxar, men, i syfte att minimera de chips "expoSe till att luft och ljus, men inte öppna dem. Försiktigt skanna streckkoder i marker och spela i vilken ordning de kommer att lastas på en spårning blad, tillsammans med box-ID: n som de kom. En grundlig förståelse av var varje enskild DNA-prov kommer att fördelas på pärla chips är nödvändig.
- Ta bort de individuella silver förpackningar med pärlor marker från sina respektive lådor, men, för att minimera markerna utsätts för luft och ljus, men inte öppna dem. Försiktigt skanna streckkoder i marker och spela i vilken ordning de kommer att lastas på en spårning blad, tillsammans med box-ID: n som de kom. En grundlig förståelse av var varje enskild DNA-prov kommer att fördelas på pärla chips är nödvändig.
- Strax innan 30 minuter svalna är klar öppnar silver pärla chip förpackningar. Ta bort marker från sina klara plasthylsor. Utan att röra kulorna, placera varje pärla chip på en Hyb kammarinsats, orientera chipetstreckkod med streckkodssymbolen etsad i insatsens övre yta.
- Skala av och kasta bort locket på provplattan. Ta 15 l av prov från provplattan och långsamt dosera på inloppet till matrisen (se figur 3). Extra försiktighet måste vidtas för att placera rätt provet på rätt pärla chip i rätt läge, matchar pärlan chip ordning spelats in tidigare. En flerkanalig pipett kan användas för att dosera vätska på markerna, men förtänksamhet måste vidtas för att aspirera bara antalet prover som säkert kan placeras på pärlan chip, eftersom antalet rader på en platta inte alltid matchar antalet rader på ett chip.
- När alla prov har placerats på dess motsvarande array, visuellt inspektera chip för bubblor eller regioner som inte belagda i vätska. Om det finns dessa problem, försiktigt klippa insatsen. Om nödvändigt kan mer vätska tillsättas till matrisen. Var noga med att lägga in rätt DNA-prov.
- Öppna Hyb kammar end placera insatserna över befuktnings reservoarer. Streckkoden av chipset ska placeras över streckkoden etsas in i Hyb kammaren bas. Sätt tillbaka Hyb kammarlocket och stäng alla fyra spännen genom att stänga klämmor på diagonalt motsatta sidor först.
- Inkubera Hyb kammaren i ugnen under 16-24 timmar. Se till att inte luta kamrarna när du flyttar dem.
- Om mer än en platta som ska bearbetas, gå tillbaka till steg 6.2. Behandling mer än 24 pärla chips i en dag rekommenderas inte för att både minimera risken för mänskliga fel vid hantering av en stor mängd förbrukningsvaror eller chips och för att minimera den tid som krävs för att bearbeta de marker i framtida åtgärder, som man måste vidtas för att begränsa sin exponering för luft så mycket som möjligt. En flaska XC4 räcker för upp till 24 pärla chips.
Dag tre
7. Färgnings Framställning
- Ta bort HYB kamrarna från ugnen och inkubera vid rums temperature för 25 min. Om behandling mer än två HYB kammare, sprida sina dubbla avlägsna varje 10 min. För att hålla markerna från att torka, men inte öppna HYB kamrarna.
- Medan HYB kamrarna kyla, ta bort rör av XC1, XC2, TEM, STM, och ATM på "Post-1" -20 ° C box och ställa på bänken för att tina. Ta en flaska RA1 från "Post-2"-rutan vid -20 ° C (eller 4 ° C om återanvändning av reagens från föregående dag) och tina i ett vattenbad av rumstemperatur. Tina ett rör med 95% formamid också. För 8 pärla chips bearbetade, två tuber av varje reagens, 10 ml RA1, 15 ml formamid, och 150 ml XC3 (finns i ett rum-temperatur, företags medföljande låda) kommer att krävas.
- För varje chip bearbetas, kommer en glasskiva, en plastgenomströmnings stag, två metallspännen, samt en plastdistans krävas. För plastmellanlägget, använd endast den klara en, separera och kassera ogenomskinlig distans. Dessutom två pärlor chip tvätta rätter ochen pärla chip fack kommer att behövas, tillsammans med en flytande monteringsstation och en plast montering bar.
- Rengör glasskivor genom att spraya dem med etanol och torka dem torra.
- Slå på hett vattenbad som är ansluten till genomströmningskammare rack och ställ in den på 44 ° C. Skaka försiktigt kammar rack för att få bort eventuella bubblor.
- När Hyb kammaren har svalnat i 25 minuter, fylla en tvättskål med PB1 (ca 200 ml). PB1 kan hittas i "Post-4" rumstemperatur låda.
- Öppna en hyb kammare. Ta bort täcktätningen från en pärla chip genom att ta tag i tätningen på ett hörn och försiktigt skalar diagonalt (se Figur 4). När förseglingen tas bort, omedelbart placera chipet i en pärla chip bricka och dränka i PB1 utan att röra kulorna. Upprepa tills facket fylls med pärla chips, noga med att inte låta någon chip torka.
- Skaka försiktigt facket för att avlägsna eventuella bubblor och lämna markerna under vatten i 1 min.Fyll en andra tvättskål med PB1. Skaka kassetten igen.
- Flytta bricka med pärla marker i andra tvättskål. Skaka försiktigt och låt dra i 1 minut, sedan skaka igen.
- I vätskegenomströmningsmonteringsstation, placera fyra svarta plastgenomflödes hängslen i spåren. Fyll stationen med PB1 tills vätskan nästan når höjden av de åtta monteringsfästen (ca 150 ml).
- Ta bort en pärla chip från magasinet och placera det i monteringsstationen på en plastgenomströmnings stag. Chipet streckkod bör anpassas över streckkoden symbolen etsas in i monteringsstationen. Upprepa för de andra tre marker som kan passa i monteringsstationen.
- Placera en klar plast spacer på toppen av en vulst chip. De yttre kanterna hos distansorganet ska omge konsolerna inom monteringsstationen. Upprepa för de andra marker nedsänkta i PB1.
- Placera plastmonterings bar i monteringsstationen genom att montera den över spåren. Placera försiktigt en glasskiva ovanpå plastmellanlägget genom att skjuta den bakre änden av sliden mot skenan och långsamt sänka den främre i vätskan. Spåret på toppen av bilden ska vara riktad nedåt, direkt ovanför streckkoden på chipet, lämnar en lucka mellan pärlan chip och sliden vid streckkoden slut. Upprepa för de andra marker nedsänkta i PB1. För en komplett genomströmningsmonteringsdiagram, se figur 5.
- Kontrollera om bubblor mellan chipet och bild. Om det bubblar försiktigt höja bilden vid streckkoden slutet och försök igen. Ihållande bubblor kan torkas ur glaset med en papperslaboratorium handduk (Kimwipe).
- Snäpp två metallklämmor runt glasskiva, en mot streckkoden ände och en bakåt. Kanterna på spännena bör gripa plastgenomströmnings stag under chipet. Upprepa för varje chip nedsänkt i PB1.
- Ta bort de genomförda genomflödes församlingar och placera vågrätt på bench. Se till att inte tippa montering vertikalt, så att vätskan under glasskiva att fly. Om fler marker väntar i tvättfacket, kan de monteras under samma PB1. Om andra marker väntar på sina ursprungliga HYB kammare, kasta all vätska i monteringsstationen och diska, och gå tillbaka till steg 7,6.
- När alla bead chips är i sina genomflödesanordningar, ta ett par av kirurgiska saxar och skär båda ändarna av distansorganet av, så nära till objektglaset som möjligt.
8. Färgning och Extension
- Verifiera att genomströmningskammare rack har nått 44 ° C i flera positioner med en temperatursond. Om temperaturen är av med mer än en halv grad, justera temperaturen i vattenbadet.
- Placera en pärla chip genomströmnings montering på kammaren rack genom att skjuta montering nedåt och haka av staget i toppen. Baksidan av pärlan chip ska röra vid kammar racket. Det glass diabild ska vara vänd ut, med spåret på toppen för att bilda en reagensbehållare. Upprepa för varje pärla chip montering.
- Med användning av en 200 | il pipett 150 pl RA1to genomströmning aggregaten genom att dispensera vätskan i glasbehållaren. Inkubera under 30 sek. Upprepa 5x.
- Med hjälp av en 1000 l pipett, tillsätt 450 l XC1to de genomflödes församlingar genom att fördela vätskan i glasbehållaren. Inkubera under 10 min.
- Lägg till 450 l XC2 till genomflödes församlingar genom att fördela vätskan i glasbehållaren. Inkubera under 10 min.
- Tillsätt 200 l TEM till genomflödes församlingar genom att fördela vätskan i glasbehållaren. Inkubera under 15 min.
- Lägg till 450 l 95% formamid / EDTA-mix till genomflödes församlingar genom att fördela vätskan i glasbehållaren. Inkubera under 1 min. Upprepa 1x.
- Inkubera genomflödesanordningar för 5 min.
- Ställ in det varma vattenbadet till den temperatur listed på rören hos STM (eller 37 ° C om ingen är visad). Se till att varje STM rör har samma temperatur listade.
- Lägg till 450 l XC3 till genomflödes församlingar. Inkubera under 1 min. Upprepa 1x.
- När det varma vattenbadet temperaturen har nått den önskade temperaturen, tillsätt 250 μLSTM till de genomflödesaggregaten genom dispensering av vätska i glasbehållaren. Inkubera under 10 min.
- Lägg till 450 l XC3 till genomflödes församlingar genom att fördela vätskan i glasbehållaren. Inkubera under 1 min. Upprepa 1x.
- Inkubera genomflödesanordningar för 5 min.
- Addera 250 pl ATM att genomflödet aggregaten genom dispensering av vätska i glasbehållaren. Inkubera under 10 min.
- Lägg till 450 l XC3 till genomflödes församlingar genom att fördela vätskan i glasbehållaren. Inkubera under 1 min. Upprepa 1x.
- Inkubera genomflödesanordningar för 5 min.
- Tillsätt 250 l STM till genomströmningaggregaten efter dispensering av vätska i glasbehållaren. Inkubera under 10 min.
- ADD 4 50 jil XC3 till de genomflödesaggregaten genom dispensering av vätska i glasbehållaren. Inkubera under 1 min. Upprepa 1x.
- Inkubera genomflödesanordningar för 5 min.
- Upprepa steg från 8,14 till 8,19 1x.
- Avlägsna genomflödes församlingar från kammaren rack och stänga av vattenbadet.
9. Tvätt och Tätning
- Fyll en färgning pärla chip tvätta skålen med PB1 (ca 315 ml). Två vertikala tvätta rätter och en vertikal pärla chip fack kommer att behövas, tillsammans med åtminstone en vakuumröret.
- Demontera en genomströmningsenhet genom att föra in en tunn metallstång mellan knäppen och stag och sedan svänga. Upphäva den glasskiva och ta bort pärla chip. Placera omedelbart pärlan chip i den vertikala pärla chip bricka och dränka i PB1. Upprepa för varje genomströmnings montering, var noga med att möta each pärla chip i samma riktning och minska deras exponering för luft.
- Skaka försiktigt pärlan chip facket för att ta bort bubblor. Inkubera nedsänkta pärla marker i PB1 i 5 min. Fyll den andra vertikala tvätta skålen med XC4 förberett dagen innan. Skaka pärlan chip facket igen.
- Flytta pärlan chip facket till tvättskål fylld med XC4. Skaka försiktigt facket för att ta bort bubblor. Inkubera i 5 min och skaka igen.
- I en jämn rörelse, dra pärlan markerlådan från tvätt skålen och sätta på ett provrörsställ, så att pärlorna på varje pärla chip ansiktet uppåt. Med självlåsande pincett, skjut en pärla chip ur facket och lägg på ett provrörsställ. Upprepa för varje pärla chip.
- Försiktigt överföra provrörsställ av flis till en vakuumtorkapparat. Stäng och slå på vakuum, vilket garanterar en ordentlig tätning. Inkubera under 50-55 min. Vid behov värma upp skannern under inkubation.
10. Scanning
- Turn av vakuumet och sakta tillbaka trycket till atmosfärstryck. Kontrollera att pärla markerna är torra. Vid behov, torka av kanter och botten av chip med en pappershandduk för att avlägsna eventuell vätska eller skräp.
- Aktivera programvaran för scanning och flytta pärla chips till scanning fack. Ladda chipets avkoda filer (dmaps) genom att aktivera Decode File Client och mata in de önskade pärla chip streckkoder, tillsammans med deras motsvarande box-ID. Unscanned pärla chips kan tryggt förvaras i ett torrt, mörkt område för upp till 72 timmar.
- När markerna är korrekt placerade i facket och avkoda filerna igen av mjukvaran, starta skanningen.
Representative Results
En rätt-bearbetad pärla chip ska visa ljusa och tydliga röda och gröna laserljusintensitet under skanning. I figur 6 visar iScan scanning programvara en standard genomiskt DNA-prov med framgång hybridiseras till en anpassad panel SNP genotypning array. De märkta nukleotider som fästes under förlängningen och färgningssteg fluorescerar under ljusen i de två lasrar. Eftersom dessa nukleotider selektivt utsträcka pärlans oligonukleotidkedja hybridiseras till den fragmenterade DNA-strängen, och eftersom de oligonukleotidkedjor är utformade för att sluta vid platsen för den variant, kan färgen och intensiteten hos den resulterande signalen kan användas för att bestämma de alleler som är närvarande vid SNP-platsen.
En användargenererat prov ark, som matchar prov ID och klinisk information till chipID och position, och en rad specifika SNP manifest, som erhålls direkt från företaget, är båda nödvändiga för att importera scanner utdatafiler till GenomeStudio analysprogram. Exempel provblad finns på bolagets hemsida. När GenomeStudio projektet byggs, kan genotyper erhållas från de resulterande intensitet kluster automatiskt genereras av programvaran. Även flera visningsalternativ finns, standardvy, Norm-R (en normaliserad intensitetsvärde) vs Norm-Theta (en allel intensitetsförhållande), är ofta det enklaste tomten att skilja tre olika kluster. De flesta SNP ska visa en, två, eller tre grupper, beroende på den mindre allelfrekvens.
De tre kluster representerar prover som visar AA, AB eller BB-alleler (se Figur 7). Dessa kluster kan tilldelas genotyper antingen genom att importera en vanlig klustring läge mall direkt från företaget, genom att välja "Cluster All SNP" från Analys verktygsfältet i programvaran, eller genom att klicka och dra de färgade cirklarna på intensitets tomter att manuellt edi t samtal. Färgen på provet på intensiteten tomten (röd, lila eller blå) indikerar samtalet (AA, AB, eller BB, respektive), svart indikerar inget samtal. Genom att bläddra igenom SNP som anges i panelen Fullständig data av programvaran, kan det kluster för varje SNP ses eller återkallas. När kluster delas tillfredsställande samtal, Full datafönstret i programmet listar genotyper för varje enskilt prov vid var SNP. Kolumnväljaren alternativet ovanför tabellen kan växla dataformat.
Data kan exporteras antingen genom analys verktygsfältet eller direkt från Full datatabellen för fördjupad analys.
Figur 1. Översikt - Infinium analysprotokollet.683/50683fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Komplett Hyb Chamber bas och matta, plus lock. [12] Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3 Laddar en Beadchip -.. Fördela provet på inloppsportarna [12] Klicka här för att visa en större image.
Figur 4 Ta bort Beadchip Coverseal -.. Fatta tag i tätningen i hörnet och försiktigt dra diagonalt [12] Klicka här för att visa en större bild .
Figur 5. Komplett Beadchip Genomströmning Montering - Den BeadChip är separerad från en glasskiva med ett distansorgan och bunden med spännen.> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 6. Framgångsrika BeadChip Scan - A) BeadChip skannas med både en röd och grön laser, skanningsprogrammet visar båda samtidigt. Sektioner som passerar intensitet QC kommer att belysa grönt på BeadChip displayen till vänster. Sektioner misslyckas intensitet QC kommer att belysa rött på BeadChip displayen. B) När skanningen är klar kommer programvaran täcka över de röda och gröna skärmar. En inzoomad bild visas. Färgen och intensiteten för varje enskild kula indikerar allelen närvarande. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 7. SNP NORM-R vs NORM-theta klusterprofiler - A) Ett giltigt SNP med tre olika kluster som representerar AA, AB och BB genotyper, färgad röd, lila och blått B) En SNP som kräver redigering.. Mitten kluster, som bör vara homozygot AB, är kvar un-heter. Den BB-klustret är felaktigt kallas AB. C) En dålig prestanda SNP. Inga genotyper kan erhållas från denna intensitet tomt, eftersom inga tydliga kluster finns. Klicka här för att visa en större bild .
Discussion
Storskaliga genotypning ansökningar har använts för att bättre förstå den genetiska mekanismen bakom många mänskliga sjukdomar. Upptäckten av betydande variant genom en genomet hela föreningen analys kan flagga en kandidatregion för vidare studier. Dessutom är genotypen uppgifter ett bra verktyg för kvalitetskontroll på sekvenseringsprojekt.
För att maximera provkapacitet kan flera provplattor förstärkas och lagras i deras splittrade, utspätt stater. Åtta plattor kan förstärkas på en enda dag, kombinerar de första 24 timmar av protokollet för flera partier och ge tillräckligt med material för ~ 2-8 dagar av chip-bearbetning. Om förstärkta plattor är lagrade i förväg, och om nya prover hybridiseras till chips direkt efter skanningen börjar på föregående körning, kan behandling köras kontinuerligt utan att behöva stanna upp ytterligare provberedning. Därför kommer though prover tar tre dagar för att genomgå en fullständigAnalysen kan data genereras dagligen. Assuming24 chips behandlas varje dag, gör att en 5 dagars arbetsvecka för över 1.000 DNA-prov som ska köras på en 12-prov pärla chip. Om något steg eller reagens har misslyckats, kan dock flera partier vara i riskzonen för dåliga resultat innan någon korrigering kan tillämpas. Fel kan undgå varsel tills arrayer skannas eller analyseras, alltså, om genomströmningen är maximerad, hundratals prover i olika skeden av protokollet kanske redan har fått samma defekt behandling vid upptäckt. Som förlorade reagenser och data inte kan återställas, måste användaren väga dessa risker mot behovet av ett snabbare arbetsflöde.
Den GenomeStudio analysprogram är det första chansen att verkligen mäta framgången för genotypning processen. Om Norm-R vs Norm-Theta intensitet tomter är korrekt klustrade, bör den genomsnittliga samtalshastighet (procent av totala SNP framgångsrikt skrivit) av proven närmar sig 99%, men detta värde varierar slightly beroende på array typ. Data från varje prov med ett samtal som är lägre än 85-90% är inte pålitliga och bör kasseras. För kvalitetskontroll, bör resultaten jämföras med de tidigare kända genotyper när det är möjligt. Om ingen sådan information finns, är avsiktligt prov dubbel ett användbart verktyg för att verifiera plåt eller array placeringar. Dessa dubbla par bör placeras på separata chips, tallrikar, partier, eller projekt, deras genotyper kontrolleras efter generation. Medan specifika QC begränsningar varierar beroende på utredarens önskemål, är vanliga SNP begränsningar baserade på provsamtal framgång, Hardy-Weinberg jämvikt, eller missingness mellan fall och kontroller, medan vanliga begränsningar prov baseras på samtalspriser, Mendels inkonsekvenser eller korsreferenser av X-kromosomen heterozygositet till kliniska data köns [13].
Om något problem uppstår, Kontroller Dashboard, framgår av analysen svit, kan lämnas in tillföretag för att fastställa orsaken. Dessa kontroller kan ofta begränsa frågan till den sann steget eller reagensfel. Om några SNP intressepunkter hittas genom en Infinium genotypning experiment, bör deras intensitet tomter vara dubbelkollade i GenomeStudio för klustring fel innan ytterligare forskning bedrivs.
En misslyckad Infinium genotypning experiment är sannolikt på grund av den mänskliga hanteringsfel eller dålig kvalitet input-DNA. Prov kvantifiering måste vara exakt och precis. För bästa resultat, alla reagenser läggs till varje prov eller chip måste dispens med den volym som fastställs i protokollet. Pipetter skall vara rätt kalibrerad. Reagens ska inte köras efter utgångsdatum och bör inte frysas om efter upptining, spara för RA1 reagens. För att minimera eventuella färgning och förlängnings fel, bör det formamid / EDTA-blandning beredas på nytt varje månad. Alla -20 ° C reagenser skall förvaras i bara manuell avfrostning frysar. Alla laboratorieutrustning som används i staining bör förlängning, och tvätta delar av protokollet sköljas noggrant med vatten och milt rengöringsmedel omedelbart efter glömska. Befuktnings reservoarer i Hyb kammaren skall avlägsnas med ett provrör borste och milt rengöringsmedel. De glas bör tvättas med 10% blekmedel, enligt instruktioner från sina handböcker, en gång i veckan.
Disclosures
Författarna till den här artikeln har inga konkurrerande ekonomiska intressen att lämna ut.
Acknowledgments
Finansieringen för detta arbete har tillhandahållits av NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959, och NIH R56 AI063274
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumable or Equipment | Manufacturer | Part Number | Minimum Required for 96 Samples |
| 0.8 ml Deep Well Plate | Thermo Scientific | AB-0765 | 1 |
| Plate Mats | Thermo Scientific | AB-0674 | 2 |
| Reagent Basin | Fisher Scientific | 13-681-502 | 9 |
| Heat-seal Sheets | Thermo Scientific | AB-0559 | 1 |
| Flow-through Spacer | Fisher Scientific | NC9563984 | 6 |
| Pipette tips - 200 μl | Rainin | GP-L200F | 192 |
| Pipette tips - 10 μl | Rainin | GP-L10F | 16 |
| Pipette tips - 1,000 μl | Rainin | GP-L1000F | 16 |
| DNA Suspension Buffer | Teknova | T0220 | 0.5 ml |
| 0.1 N NaOH | Fisher Scientific | AC12419-0010 | 0.5 ml |
| Isopropanol (HPLC grade) | Fisher Scientific | A451 | 15 ml |
| Ethanol (200-proof) | Sigma-Aldrich | 459836 | 330 ml |
| Formamide (100%) | Thomas Scientific | C001K38 | 15 ml |
| EDTA (0.5 M) | Amresco | E177 | 0.2 ml |
| 10 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-10XLS | 1 |
| 200 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-200XLS | 2 |
| 1,000 μl Single-channel Pipette | Rainin | L-1000XLS | 1 |
| Microplate Shaker | VWR | 13500-890 | 1 |
| Refrigerated Microplate Centrifuge | VWR | BK369434 | 1 |
| Hybridization Oven | Illumina | SE-901-1001 | 1 |
| Hybex Microsample Incubator | SciGene | 1057-30-0 | 1 |
| Hybex MIDI Heat Block Insert | Illumina | BD-60-601 | 1 |
| Heat Sealer | Thermo Scientific | AB-0384 | 1 |
| Hyb Chamber w/ Insert and Mat | Illumina | BD-60-402 | 2 |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 13-804-20 | 1 |
| Flow Through Assembly Parts | Illumina | WG-10-202 | 8 |
| Wash Rack and Dish | Illumina | BD-60-450 | 1 |
| Genepaint Chamber Rack | Tecan | 760-800 | 1 |
| Temperature Probe | Illumina | A1-99-109 | 1 |
| Staining Rack and Dish | Illumina | WG-10-207 | 1 |
| Self-Closing Tweezers | Ted Pella, Inc | 5374-NM | 1 |
| Vacuum Manifold | Ted Pella, Inc | 2240 | 1 |
| iScan or HiScan | Illumina | - | 1 |
References
- Shi, M. M. Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies. Clin. Chem. 47 (2), 164-172 (2001).
- Livak, K. J. SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction. Methods Mol. Biol. 212, 129-148 (2003).
- Seeb, J. E., Pascal, C. E., Ramakrishnan, R., Seeb, L. W. SNP genotyping by the 5'-nuclease reaction: advances in high throughput genotyping with non-model organisms. Methods in Mol. Biol. 578, 277-292 (2009).
- Bayés, M., Gut, I. G. Overview of Genotyping. Molecular Analysis and Genome Discovery. ed, , 2nd, John Wiley & Sons, Ltd. Chichester, UK. 1-23 (2011).
- Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-Nucleotide Polymorphisms for High-Throughput Genotyping of Anopheles arabiensis in East and Southern Africa. J. Med. Entomol. 49 (2), 307-315 (2012).
- Liu, Z. SNP Genotyping Platforms. Next generation sequencing and whole genome selection in aquaculture. , Wiley-Blackwell. 123-132 (2011).
- Shen, R., Fan, J. B., et al. High-throughput SNP genotyping on universal bead arrays. Mutat. Res./Fundam and Mol. Mech. of Mutagenesis. 573 (1), 70-82 (2005).
- Ragoussis, J. Genotyping technologies for all. Drug Discov. Today: Technol. 3 (2), 115-122 (2006).
- Wu, C. C., Shete, S., Jo, E. J., et al. Whole-Genome Detection of Disease-Associated Deletions or Excess Homozygosity in a Case-Control Study of Rheumatoid Arthritis. Hum. Mol. Genet. , (2012).
- Green, E. K., Hamshere, M., Forty, L., et al. Replication of bipolar disorder susceptibility alleles and identification of two novel genome-wide significant associations in a new bipolar disorder case-control sample. Mol. Psychiatry. , (2012).
- Shete, S., Hosking, F. J., Robertson, L. B., et al. Genome-wide association study identifies five susceptibility loci for glioma. Nat. Genet. 41 (8), 899-904 (2009).
- Inc Illumina. Infinium HD Ultra User Guide 11328087 RevB-1. , 15-101 (2009).
- Turner, S., Armstrong, L. orenL., Yuki Bradford,, et al. Quality Control Procedures for Genome Wide Association Studies. Curr Protoc Hum Genet. , 1-19 (2011).
