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Biology

बड़े पैमाने पर SNP जीनोटाइपिंग अनुप्रयोगों के लिए इंफिनियम परख

Published: November 19, 2013 doi: 10.3791/50683
Automatic Translation
1, 1, 1
1Arthritis and Clinical Immunology, Oklahoma Medical Research Foundation

Summary

एक प्रोटोकॉल बड़े पैमाने पर जीनोटाइपिंग प्रदर्शन करने Illumina के इंफिनियम assays का उपयोग करता है वर्णन किया गया है. ये assays मज़बूती से तीन दिनों में व्यक्ति के डीएनए नमूने के सैकड़ों भर SNPs के लाखों जीनोटाइप कर सकते हैं. एक बार उत्पन्न, इन जीनोटाइप विभिन्न रोगों या phenotypes की एक किस्म के साथ संगठनों के लिए जाँच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

मानव जीनोम में जीनोटाइपिंग वेरिएंट phenotypes साथ आनुवंशिक संघों की पहचान करने के लिए एक कारगर तरीका साबित हो गया है. परिवारों या आबादी के भीतर वेरिएंट का वितरण रोग के आनुवांशिक कारकों की पहचान की सुविधा कर सकते हैं. जीनोटाइपिंग BeadChips की Illumina के पैनल जांचकर्ताओं हजारों या एकल nucleotide बहुरूपताओं के लाखों (SNPs) जीनोटाइप या डीएनए के नमूने की एक बड़ी संख्या में ऐसे प्रतिलिपि संख्या के रूप में अन्य जीनोमिक वेरिएंट, विश्लेषण करने की अनुमति देता है. इन SNPs जीनोम भर में फैल या संभावित खोज को अधिकतम करने के क्रम में विशिष्ट क्षेत्रों में लक्षित किया जा सकता है. इंफिनियम परख जल्दी से उच्च गुणवत्ता, सटीक परिणाम के लिए अनुकूलित किया गया है. उचित स्थापना के साथ, एक ही तकनीशियन सरणी के प्रकार के आधार पर, प्रति सप्ताह एक हजार से अधिक डीएनए नमूनों के लिए कुछ सौ से प्रक्रिया कर सकते हैं. यह परख जीनोमिक डीएनए के साथ शुरू करने और सरणी की स्कैनिंग के साथ समाप्त, हर कदम के माध्यम से गाइड प्रयोक्ताओं. मर्यादा Reage का प्रयोगएनटीएस, नमूने परिलक्षित कर रहे हैं, खंडित, उपजी resuspended, दाग एक एकल आधार, द्वारा बढ़ाया चिप, संकरित, और एक iscan या हाय स्कैन उच्च संकल्प ऑप्टिकल इमेजिंग प्रणाली या तो पर स्कैन किया. एक रातोंरात कदम डीएनए बढ़ाना आवश्यक है. डीएनए विकृत और isothermally पूरे जीनोम प्रवर्धन से परिलक्षित होता है, इसलिए कोई पीसीआर की आवश्यकता है. नमूने एक दूसरे रातोंरात चरण के दौरान सरणियों संकरित कर रहे हैं. तीसरे दिन के नमूने, और स्कैन का विश्लेषण करने के लिए तैयार हैं. प्रवर्धित डीएनए मनका सरणियों जिससे throughput को अधिकतम, सप्ताह के प्रत्येक दिन संसाधित करने की अनुमति देता है, बड़ी मात्रा में खरीदकर भंडार हो सकता है.

Introduction

एकल nucleotide बहुरूपताओं (SNPs) लिखकर रोग के साथ जुड़े जोखिम वेरिएंट की पहचान करने का एक महत्वपूर्ण तरीका है. ऐतिहासिक, जीनोटाइपिंग प्रयोगों की गुंजाइश उपलब्ध तकनीक के द्वारा ही सीमित कर दिया गया है. जेल वैद्युतकणसंचलन आधारित जीनोटाइपिंग तरीकों नमूना और SNP-throughput में सीमित कर रहे हैं [1]. इन assays का विकास अक्सर अनुकूलन के लिए संस्करण आसपास के क्षेत्र के मेकअप और संरचना पर निर्भर है, श्रम प्रधान हो सकता है [1]. जीवन टेक्नोलॉजीज द्वारा विकसित TaqMan जीनोटाइपिंग assays, जल्दी और कम से कम तकनीशियन की भागीदारी के साथ नमूने की एक बड़ी संख्या को चला सकते हैं [2], लेकिन SNP-बहुसंकेतन प्रतिबंध प्रति दिन अच्छी तरह के तहत एक लाख [3,4 करने के जीनोटाइप की कुल संख्या को सीमित करने के लिए जारी ]. कम से कम एक सौ SNPs एक साथ मल्टिप्लेक्स जा सकता है के रूप में Sequenom के IPLEX मंच भी, एक ही बार में कई नमूने चलाते हैं, लेकिन हो सकता है, throughput के समग्र तुलनात्मक रूप से कम है [5]. Beckman कल्टर SNP धारा प्रौद्योगिकीसैद्धांतिक रूप से प्रति दिन तीन लाख से अधिक जीनोटाइप उपज सकता है, लेकिन प्रतिक्रिया प्रति केवल अड़तालीस SNPs की एक अधिकतम करने के लिए इस तकनीक सीमा परियोजना रेंज [4,6]. Goldengate परख नमूना प्रति SNPs के सैकड़ों या हजारों पर प्रत्येक दिन लगभग दो सौ डीएनए नमूने की प्रक्रिया कर सकते हैं जबकि एक बार [4,7 पर तीन हजार SNPs जब टाइपिंग, जीनोटाइप प्रति कीमत उन्नत, अल्ट्रा उच्च throughput तकनीक के साथ प्रतिस्पर्धी नहीं है ]. प्रति दिन कई लाख जीनोटाइप संसाधित करने के लिए, बड़े जीनोम चौड़ा संघ अध्ययन के लिए आवश्यक पैमाने पर, सरणी संकरण assays के बाजार पर सबसे अधिक लागत प्रभावी विकल्प बन गए हैं.

संकरण सरणियों की Affymetrix की लाइन और इंफिनियम आधारित सरणियों की Illumina की लाइन के नमूनों की संभावित सैकड़ों समानांतर [4,8] में SNPs के हजारों या लाखों लोगों के सैकड़ों पर टाइप करने की अनुमति दे. इन SNPs ऐसे पूर्व के रूप में हितों के क्षेत्रों में स्थानीय, पूरे जीनोम भर में बिखरे हुए किया जा सकता हैomes, या उपयोगकर्ता के वरीयता के लिए अनुकूलित. ये सरणियों सही पर एक बार नमूना प्रति एक लाख SNPs जीनोटाइप, लेकिन यह भी संभावित अनावरण गुणसूत्र असामान्यताओं प्रतिलिपि संख्या परिवर्तन को मापने के लिए सक्षम होने के लिए न केवल का लाभ उठा रहे हैं. इंफिनियम गठबंधन ओमनी BeadChip सरणियों वर्तमान में प्रत्येक दिन करीब एक सौ नमूनों को पर, पांच लाख कस्टम स्थलों सहित नमूना प्रति लगभग पांच लाख मार्कर, अप करने के लिए जीनोटाइप करने की क्षमता है.

ज्यादातर बीमारियों एक आनुवंशिक घटक है, इन बड़े पैमाने पर प्रयोग रोग के साथ जुड़े जीन खोजने में महत्वपूर्ण हो सकता है. उच्च throughput जीनोटाइपिंग नमूने में कुशल जीनोटाइप पीढ़ी के लिए अनुमति देता है आसानी से कम मामूली एलील आवृत्तियों पर आनुवंशिक एसोसिएशन का पता लगाने के लिए काफी बड़े खेलें. पूरे जीनोम जीनोटाइपिंग परियोजनाओं सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मामला नियंत्रण एलील की आवृत्ति या प्रतिलिपि संख्या मतभेदों के साथ क्षेत्रों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है [9,10,11]. राष्ट्रीय मानव जीई के अनुसारनोम अनुसंधान संस्थान, जीनोम चौड़ा संघ अध्ययन एक पी मूल्य कम से कम 1 एक्स 10 -5 साथ 8283 SNPs की खोज से stemming, 25 नवंबर, 2008 और 25 जनवरी 2013 के बीच 1,490 अलग प्रकाशनों के लिए नेतृत्व (http:// देखना ऊंचाई से एक जीनोम चौड़ा विश्लेषण द्वारा सकती व्यापक दृष्टिकोण से लाभान्वित वृषण कैंसर, को लेकर स्थिति शोध किया जो www.genome.gov/gwastudies/). ये अध्ययन. टाइपिंग की गुंजाइश भी प्रतिबंधात्मक हो गया था जैसे कि इन मामलों में, ब्याज की संपूर्ण क्षेत्रों नोटिस बच सकता. बड़े पैमाने पर एसोसिएशन विश्लेषण के लिए इस प्रकार, एक जीनोम चौड़ा जीनोटाइपिंग तकनीक पसंद की तकनीक है.

इंफिनियम परख के विभिन्न संस्करणों के प्रत्येक सरणियों के विशिष्ट प्रकार के साथ उपयोग के लिए करना, मौजूद हैं. या 24 नमूना सरणी चिप्स - नीचे गहराई में चर्चा की InfiniumUltra परख,, कई 12 के लिए उपयुक्त है. ये अक्सर डीएनए नमूना प्रति हजार एक सौ से अधिक SNPs जीनोटाइप और टी पर ध्यान केंद्रितऐसे exome या कस्टम पैनलों को argeted क्षेत्रों,. अन्य परख संस्करणों में इस तरह के पूरे जीनोम जीनोटाइपिंग सरणियों के रूप में अन्य चिप प्रकार, के लिए आवश्यक हो सकता है. सभी इंफिनियम assays के एक आम आधार का हिस्सा है और मुख्य रूप से केवल अभिकर्मक के नाम, अभिकर्मक की मात्रा, या सटीक धुंधला अभिकर्मक प्रक्रिया से अलग लेकिन, जैसा कि एक परख संस्करण पर सिद्ध तकनीक अक्सर समान रूप से लागू किया जा सकता है. ऐसे मेथिलिकरण सरणियों के रूप में अन्य सरणियों,,, साथ ही लगभग एक समान प्रोटोकॉल का उपयोग हो सकता है. केयर चिप प्रकार उपयोग में लिए आवश्यक परख के संस्करण का उपयोग केवल के लिए लिया जाना चाहिए. इस तरह के जीन अभिव्यक्ति के स्तर को मापने वाले के रूप में कुछ प्रकार, एक nonInfinium प्रोटोकॉल के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है.

नमूने बैचों में संसाधित किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, InfiniumUltra परख के साथ, prehybridization अभिकर्मक ट्यूबों 96 नमूने को चलाने के लिए पर्याप्त मात्रा में होते हैं, और ट्यूब refrozen नहीं किया जा सकता. इसलिए, नमूने एक समय में 96 नमूनों के बैच में चलाया जाना आवश्यक है. नमूने एफआइआर पर परिलक्षित होगाटी दिन. Benchwork के लगभग 1 घंटे बाद, नमूने 20-24 घंटे के लिए एक संवहन ओवन में गर्म किया जाना चाहिए. अगले दिन, लगभग 4 घंटा precipitating, और नमूने भविष्य में उपयोग के लिए जमे हुए या चिप संकरित किया जा सकता है या तो जो बात नमूने, resuspending, fragmenting खर्च किया जाएगा. चिप्स लोड हो रहा नमूने 16-24 घंटे के लिए रात भर संकरित किया जाएगा, जिसके बाद लगभग 2 घंटे लगते हैं. तीसरे दिन, धुंधला हो जाना और विस्तार कदम ~ 4 घंटा लेता है. एक और घंटे धोने, कोटिंग, और चिप्स सुखाने खर्च किया जाएगा. अंत में, सरणियों का इस्तेमाल किया प्रकार के आधार पर 15-60 मिनट / चिप से लग सकता है, जो स्कैन कर रहे हैं.

मानक प्रयोगशाला सुरक्षा और सफाई सावधानियों लागू होते हैं. प्रवर्धन पीसीआर आधारित नहीं है, पूर्व और postamplification प्रक्रियाओं के लिए अलग कार्यस्थानों संदूषण की संभावना को कम करने के लिए आवश्यक हैं. प्रयोग में हर किट की आपूर्ति की अभिकर्मक की पहचान संख्या एक ट्रैकिंग शीट पर लॉग इन करना होगा. Reageएनटीएस वितरण से पहले कई बार उपयोग करने से पहले तुरंत thawed और उल्टे जाना चाहिए. टाइप किया जा करने के लिए डीएनए मानक तरीकों से अलग है और एक fluorometer साथ मात्रा उच्च गुणवत्ता जीनोमिक डीएनए (260/280 1.6-2.0 के absorbance अनुपात, 3.0 से नीचे के 260/230 absorbance के अनुपात), होना चाहिए. डीएनए की गिरावट अक्सर कम गुणवत्ता परख परिणामों में एक योगदान कारक है. यह राशि कुछ चिप प्रकार के लिए भिन्न हो सकते हैं, हालांकि आमतौर पर, डीएनए के 200 एनजी, आवश्यक है. एक Tecan तरल से निपटने रोबोट प्रोटोकॉल के कई चरणों को स्वचालित और एक कारक के रूप में मानव त्रुटि को कम कर सकते हैं.

Protocol

एक दिन

1. तैयारी

  1. एक गहरे अच्छी तरह से, 96 नमूना थाली में डीएनए के 200 एनजी बांटना. कम से कम 96 नमूने (फुल प्लेट) कोई अभिकर्मक बर्बाद हो जाएगा सुनिश्चित करने के लिए चढ़ाया जाना चाहिए. किट द्वारा आपूर्ति की एक बारकोड स्टीकर के साथ थाली लेबल और यह अपकेंद्रित्र.
  2. मात्रा मानक के अनुसार एक दराज में नमूने छोड़ने के लिए या तरल लुप्त हो जाना हुड रातोंरात धूआं करने के क्रम में. धूल बाहर रखने के लिए एक ढक्कन या कागज तौलिया के साथ शिथिल प्लेट कवर.

2. प्रवर्धन

चेतावनी: 4 घंटा विखंडन, वर्षा, और मेजबान चरणों के लिए अगले दिन पर उपलब्ध हो जाएगा, जब तक नमूने प्रवर्धन नहीं गुजरना चाहिए.

  1. -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर (MA1, MA2, और एमएसएम के एक ट्यूब में 96 नमूनों में से प्रत्येक सेट के लिए पर्याप्त है) से "पूर्व" लेबल ट्यूब की कंपनी की आपूर्ति बॉक्स या पैक निकालें. पिघलना करने के लिए बेंच पर MA2 और एमएसएम के ट्यूब सेट करें. ठीक से calibrated चालू करेंओवन और 37 डिग्री करने के लिए सेट सी.
  2. एक अभिकर्मक बेसिन और एक 10 μl, 8 चैनल विंदुक का प्रयोग, नमूने rehydrate करने के लिए प्रत्येक कुएं में डीएनए मेजबान बफर के 4 μl बांटना. देखभाल तरल छू नहीं लिया जाता है, तो यह प्रत्येक स्तंभ के बीच विंदुक युक्तियाँ त्यागने के लिए आवश्यक नहीं है.
  3. एक 8 चैनल विंदुक के साथ, थाली के प्रत्येक कुएं में MA1 के 20 μl बांटना. प्रत्येक नया अभिकर्मक के लिए, एक ताजा अभिकर्मक बेसिन का उपयोग करें. एक microplate प्रकार के बरतन पर 1,600 rpm पर 1 मिनट के लिए एक पुन: प्रयोज्य मुहर, पल्स अपकेंद्रित्र, और भंवर के साथ प्लेट कवर.
  4. 2.4) में कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  5. थाली के प्रत्येक कुएं में 0.1 एन NaOH के 4 μl बांटना. 1,600 rpm पर 1 मिनट के लिए पुन: प्रयोज्य मुहर, पल्स अपकेंद्रित्र, और भंवर के साथ प्लेट कवर.
  6. 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  7. थाली के प्रत्येक कुएं में MA2 के 34 μl बांटना.
  8. थाली के प्रत्येक कुएं में एमएसएम के 38 μl बांटना. साथ प्लेट कवरपुन: प्रयोज्य मुहर, पल्स अपकेंद्रित्र, और 1600 rpm पर 1 मिनट के लिए भंवर.
  9. 20-24 घंटे के लिए ओवन में रखें.

दो दिन

3. विखंडन

  1. "डाक -1" से एफएमएस ट्यूबों निकालें -20 डिग्री सेल्सियस बॉक्स (एक ट्यूब में 96 नमूनों में से प्रत्येक सेट के लिए पर्याप्त है). बेंच पर या एक कमरे के तापमान नहाने के पानी में गला लें. एक tabletop microsample ऊष्मायन प्रणाली में मिडी प्लेट डालने डालने के बाद, गर्मी ब्लॉक पर बारी और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट
  2. ट्यूब thawed हैं एक बार, ओवन और पल्स अपकेंद्रित्र से नमूना प्लेट हटा दें. डीएनए थाली के प्रत्येक कुएं में एफएमएस के 25 μl बांटना. 1 मिनट के लिए 1600 rpm पर ढक्कन, पल्स अपकेंद्रित्र, और भंवर बदलें.
  3. 1 घंटे के लिए गर्मी ब्लॉक में थाली सेते हैं.

4. तेज़ी

  1. 4 डिग्री सेल्सियस बॉक्स "के बाद 3" से PM1 ट्यूब निकालें या पैक और कमरे के तापमान को गर्म (एक ट्यूब में 96 नमूनों में से प्रत्येक सेट के लिए पर्याप्त है). गर्मी गुट से थाली निकालेंकश्मीर और पल्स अपकेंद्रित्र.
  2. थाली के प्रत्येक कुएं में PM1 के 50 μl बांटना. 1 मिनट के लिए 1600 rpm पर ढक्कन, पल्स अपकेंद्रित्र, और भंवर बदलें.
  3. 5 मिनट के लिए गर्मी ब्लॉक में थाली सेते हैं.
  4. , गर्मी ब्लॉक से थाली हटाने के लिए इसे बंद कर देते हैं, और थाली ढक्कन त्यागें. थाली के प्रत्येक कुएं में 100% isopropanol के 155 μl बांटना. एक नए ढक्कन के साथ कवर कसकर और मैन्युअल मिश्रण को थाली कई बार पलटना.
  5. 30 मिनट की एक न्यूनतम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में थाली प्लेस. प्रशीतित अपकेंद्रित्र को चालू करें और शांत करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित किया है.
  6. 3000 x जी पर 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर थाली और अपकेंद्रित्र शेष.
  7. यह inverting बिना प्लेट के नीचे का निरीक्षण किया और नमूने एक नीली गोली में उपजी हैं पुष्टि करें. कोई छर्रों फिर, अपकेंद्रित्र देखा जा सकता है. कागज तौलिये करें.
  8. ढक्कन त्यागें और जल्दी से थाली inverting और कागज तौलिये में कवर benchtop पर जबरदस्ती यह दोहन से तरल हटा दें. थाली मैं एक बारकोई भी तरल बनी हुई है, जबकि nverted, यह वापस लौटने के लिए नहीं ख्याल रखना. सभी तरल निकाले जाने तक बार बार benchtop के खिलाफ प्लेट टैप करें.
  9. सूखे के लिए, उल्टे एक टेस्ट ट्यूब रैक, पर थाली सेट करें. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.

5. मेजबान

  1. "के बाद 2" से RA1 निकालें -20 सी बॉक्स और कमरे के तापमान नहाने के पानी में पिघलना °. भट्ठी पर बारी और 48 डिग्री सेल्सियस के लिए यह सेट
  2. एक बार thawed, नमूना थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए RA1 के 23 μl बांटना. बेसिन में RA1 की पूरी बोतल डालना मत करो, बाद के लिए 30 मिलीलीटर बचाने के लिए. नमूनों बाद में उस दिन सरणियों पर संकरित किया जाएगा, एक 4 डिग्री सेल्सियस कूलर में RA1 जगह है. नमूने एक बाद की तारीख में चला जाएगा, तो बोतल लेबल और RA1 फ्रिज.
  3. थाली पर एक नया ढक्कन गर्मी सील. थाली अपकेंद्रित्र पल्स और 1 घंटे के लिए ओवन में जगह है.
  4. 1 मिनट के लिए 1800 rpm पर ओवन और भंवर से थाली निकालें.
    नमूने सुरक्षित रूप से ज हो सकता हैअप करने के लिए एक सप्ताह के लिए इस स्तर पर वृद्धावस्था. प्लेट्स खरीदकर भंडार हो सकता है, और यदि आवश्यक हो तो नमूने, मनका चिप आवेदन के लिए तैयार करने के लिए पुनर्गठित किया जा सकता है. प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ने से है, कमरे के तापमान पर थाली छोड़ दो और गर्मी ब्लॉक पर बारी. अन्यथा, -20 डिग्री सेल्सियस पर थाली की दुकान

6. संकरण

चेतावनी: नमूने 5.5 घंटा धुंधला के लिए अगले दिन पर उपलब्ध हैं जब तक संकरण से गुजरना और कदम धो नहीं होना चाहिए.

  1. गर्मी ब्लॉक पर मुड़ें और 95 डिग्री सेल्सियस के लिए यह सेट भट्ठी पर बारी और 48 डिग्री सेल्सियस के लिए यह सेट
  2. तापमान स्थिर हो गया है एक बार, 20 मिनट के लिए गर्मी ब्लॉक पर थाली सेते हैं.
  3. थाली denaturing है, वहीं 4 डिग्री सेल्सियस से मनका चिप्स के बॉक्स को हटाने और बेंच पर यह निर्धारित किया है. (कमरे के तापमान किट से) XC4 की एक बोतल ले लो और 100% इथेनॉल के 330 मिलीलीटर जोड़ें. यह अच्छी तरह से हिलाएँ और रात में कमरे के तापमान पर सेते हैं. Formamide / EDTA मिक्स (95% formamide, 0.2% की तैयारीEDTA (0.5 एम), मात्रा से 4.8% एच 2 ओ) और अलग 15 मिलीलीटर की वेतन वृद्धि में फ्रीज. अतिरिक्त formamide खरीदकर भंडार हो सकता है.
  4. गर्मी ब्लॉक से नमूना थाली निकालें. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  5. प्लेट ठंडा किया जाता है, HYB कक्ष तैयार. एक कक्ष संसाधित हर चार मनका चिप्स के लिए आवश्यक हो जाएगा.
    आधार के सामने साथ मोटा छेद aligning, HYB चैम्बर आधार के शीर्ष पर एक रबर चटाई रखें. बेस में etched बारकोड प्रतीक अभी भी (देखें चित्र 2) दिखाई जानी चाहिए.
  6. एक 1000 μl विंदुक का प्रयोग, बेस में खुदी हुई आठ humidifying जलाशयों में से प्रत्येक में PB2 के 400 μl बांटना. PB2 "के बाद 3" बॉक्स या पैक में पाया जा सकता है. बेस पर HYB चैम्बर ढक्कन प्लेस और पहली तिरछे विपरीत दिशा में दो clasps बंद करके दोनों सिरों आलिंगन.
  7. चिप्स 'एक्सपो कम करने के लिए, उनके संबंधित बक्से से मनका चिप्स की व्यक्तिगत रजत पैक निकालें, लेकिनहवा और प्रकाश के लिए सुनिश्चित करें, उन्हें अभी तक नहीं खुला है. ध्यान से चिप्स के बारकोड को स्कैन और वे आए थे, जिसमें से बॉक्स आईडी के साथ साथ, एक ट्रैकिंग शीट पर लोड किया जाएगा जिस क्रम में रिकॉर्ड है. प्रत्येक व्यक्ति के डीएनए नमूने मनका चिप्स पर तिरस्कृत किया जाएगा, जहां के एक संपूर्ण समझ आवश्यक है.
  8. उनके संबंधित बक्से से मनका चिप्स की व्यक्तिगत रजत पैक निकालें, लेकिन, हवा और प्रकाश के लिए चिप्स 'जोखिम को कम करने के लिए, उन्हें अभी तक नहीं खुला है. ध्यान से चिप्स के बारकोड को स्कैन और वे आए थे, जिसमें से बॉक्स आईडी के साथ साथ, एक ट्रैकिंग शीट पर लोड किया जाएगा जिस क्रम में रिकॉर्ड है. प्रत्येक व्यक्ति के डीएनए नमूने मनका चिप्स पर तिरस्कृत किया जाएगा, जहां के एक संपूर्ण समझ आवश्यक है.
  9. 30 मिनट शांत बस से पहले चांदी मनका चिप पैक खोलने, पूरा कर लिया है. उनकी स्पष्ट प्लास्टिक आस्तीन से चिप्स निकालें. मोती को छू के बिना चिप orienting, एक HYB कक्ष डालने पर हर मनका चिप जगहडालने के ऊपर सतह में etched बारकोड प्रतीक के साथ बारकोड.
  10. छील और नमूना थाली के ढक्कन त्यागें. नमूना थाली से नमूना के 15 μl ले लो और धीरे धीरे सरणी के लिए इनलेट पर बांटना (चित्रा 3 देखें). असाधारण देखभाल पहले दर्ज मनका चिप क्रम मिलान, सही स्थिति में सही मनका चिप पर सही नमूना जगह पर ले जाया जाना चाहिए. एक multichannel विंदुक चिप्स पर तरल बांटना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन पूर्वविवेक एक थाली पर पंक्तियों की संख्या हमेशा की संख्या से मेल नहीं खाता के रूप में सुरक्षित रूप से मनका चिप पर रखा जा सकता है कि नमूनों की ही संख्या, महाप्राण लिया जाना चाहिए एक चिप पर पंक्तियों.
  11. एक बार हर नमूना अपनी इसी सरणी पर रखा गया है, नेत्रहीन तरल लेपित में नहीं बुलबुले या क्षेत्रों के लिए चिप का निरीक्षण किया. इन समस्याओं के लिए मौजूद हैं, धीरे डालने रॉक. यदि आवश्यक हो, अधिक तरल सरणी के लिए जोड़ा जा सकता है. सही डीएनए नमूना जोड़ने के लिए ध्यान रखना.
  12. HYB चैम्बर एक खुलाhumidifying जलाशयों से अधिक आवेषण जगह चाहते हैं. चिप की बारकोड HYB कक्ष बेस में etched बारकोड के ऊपर रखा जाना चाहिए. HYB चैम्बर कवर की जगह है और पहले तिरछे विपरीत दिशा में clasps बंद करके सभी चार clasps बंद करें.
  13. 16-24 घंटे के लिए ओवन में HYB चैम्बर सेते हैं. उन्हें जब चलती कक्षों झुकाव नहीं ख्याल रखना.
  14. एक से अधिक प्लेट संसाधित किया जा रहा है, 6.2 कदम पर लौटें. एक दिन में 24 से अधिक मनका चिप्स प्रक्रमण देखभाल के रूप में, उपभोग्य या चिप्स की एक बड़ी मात्रा से निपटने जब मानव त्रुटि की संभावना को कम करने के लिए दोनों और भविष्य के कदमों में चिप्स प्रक्रिया के लिए आवश्यक समय की मात्रा कम करने के लिए सिफारिश नहीं है होना चाहिए जितना संभव हो उतना हवा के लिए अपने जोखिम को सीमित करने के लिए ले जाया जा. XC4 की एक बोतल के लिए 24 मनका चिप्स के लिए पर्याप्त है.

तीन दिन

7. धुंधला तैयारी

  1. ओवन से HYB कक्षों निकालें और कमरे ते सेते25 मिनट के लिए mperature. दो से अधिक HYB कक्षों प्रसंस्करण, तो उनके दोहरे हटाने के लिए हर 10 मिनट डगमगाते. सूखने से चिप्स रखने के क्रम में, अभी तक HYB कक्षों खुला नहीं है.
  2. HYB कक्षों ठंडा कर रहे हैं, सी बॉक्स ° -20 "डाक -1" से XC1, XC2, मंदिर, एसटीएम, और एटीएम की ट्यूब को हटाने और पिघलना करने के लिए बेंच पर निर्धारित किया है. -20 डिग्री सेल्सियस पर "के बाद 2" बॉक्स से RA1 की एक बोतल ले लो और एक कमरे के तापमान नहाने के पानी में पिघलना (या 4 डिग्री सेल्सियस पिछले दिन से अभिकर्मक reusing अगर). साथ ही 95% formamide की एक ट्यूब पिघलना. , प्रत्येक अभिकर्मक की दो ट्यूब, 10 मिलीलीटर RA1, 15 मिलीलीटर formamide, और (एक कमरे के तापमान, कंपनी की आपूर्ति बॉक्स में पाया) 150 मिलीलीटर XC3 संसाधित 8 मनका चिप्स के लिए आवश्यक हो जाएगा.
  3. संसाधित हर चिप के लिए, एक गिलास स्लाइड, एक प्लास्टिक प्रवाह के माध्यम से गले लगा, दो धातु clasps, और एक प्लास्टिक स्पेसर आवश्यक हो जाएगा. प्लास्टिक स्पेसर के लिए, केवल स्पष्ट एक का उपयोग करें, अपारदर्शी स्पेसर अलग और त्यागें. इसके अलावा, दो मनका चिप बर्तन साफ ​​करें औरएक मनका चिप ट्रे एक तरल विधानसभा स्टेशन और एक प्लास्टिक विधानसभा पट्टी के साथ साथ की जरूरत होगी.
  4. इथेनॉल के साथ छिड़काव और उन्हें सूखी पोंछते द्वारा कांच स्लाइड साफ करें.
  5. प्रवाह के माध्यम से चैम्बर रैक से जुड़ी है कि गर्म पानी से स्नान पर मुड़ें और 44 डिग्री सेल्सियस के लिए यह सेट धीरे किसी भी बुलबुले बेदखल करने के लिए चैम्बर रैक हिला.
  6. HYB कक्ष 25 मिनट के लिए ठंडा है, PB1 (लगभग 200 मिलीलीटर) के साथ एक धोने पकवान भरें. PB1 "के बाद 4" कमरे के तापमान बॉक्स में पाया जा सकता है.
  7. एक HYB कक्ष खोलें. (4 चित्र देखें) एक कोने पर मुहर लोभी और धीरे तिरछे छीलने से एक मनका चिप से कवर मुहर निकालें. सील निकाले जाने के बाद तुरंत एक मनका चिप ट्रे में चिप डाल दिया और मोती को छूने के बिना PB1 में डूब. ट्रे किसी भी चिप सूख जाने के लिए नहीं ख्याल रख रही है, मनका चिप्स से भरा है जब तक दोहराएँ.
  8. धीरे किसी भी बुलबुले को हटाने और 1 मिनट के लिए जलमग्न चिप्स छोड़ने के लिए ट्रे आंदोलन.PB1 साथ एक दूसरे धोने पकवान भरें. फिर ट्रे आंदोलन.
  9. दूसरे धोने डिश में मनका चिप्स की ट्रे ले जाएँ. फिर धीरे फिर से आंदोलन, आंदोलन और 1 मिनट के लिए लेना.
  10. तरल प्रवाह के माध्यम से विधानसभा स्टेशन में, खांचे में चार काले प्लास्टिक प्रवाह के माध्यम से ब्रेसिज़ जगह है. तरल लगभग आठ विधानसभा कोष्ठक (लगभग 150 मिलीलीटर) की ऊंचाई तक पहुँच जाता है जब तक PB1 साथ स्टेशन भरें.
  11. ट्रे से एक मनका चिप निकालें और एक प्लास्टिक प्रवाह के माध्यम से गले पर विधानसभा स्टेशन में जगह. चिप बारकोड विधानसभा स्टेशन में etched बारकोड प्रतीक ऊपर गठबंधन किया जाना चाहिए. विधानसभा स्टेशन के भीतर फिट कर सकते हैं कि अन्य तीन चिप्स के लिए दोहराएँ.
  12. एक मनका चिप के शीर्ष पर एक स्पष्ट प्लास्टिक स्पेसर रखें. स्पेसर के बाहरी किनारों विधानसभा स्टेशन के भीतर कोष्ठक घेर चाहिए. PB1 में जलमग्न अन्य चिप्स के लिए दोहराएँ.
  13. खांचे से अधिक यह फिटिंग द्वारा विधानसभा स्टेशन में प्लास्टिक विधानसभा पट्टी रखें. धीरे विधानसभा पट्टी के खिलाफ स्लाइड के पीछे के अंत धक्का और धीरे धीरे तरल में सामने कम से प्लास्टिक स्पेसर के शीर्ष पर एक गिलास स्लाइड जगह. स्लाइड के शीर्ष पर नाली मनका चिप और बारकोड अंत में स्लाइड के बीच एक अंतर छोड़ने, सीधे चिप के बारकोड ऊपर, नीचे की ओर का सामना करना चाहिए. PB1 में जलमग्न अन्य चिप्स के लिए दोहराएँ. एक पूर्ण प्रवाह के माध्यम से विधानसभा आरेख के लिए, चित्रा 5.
  14. चिप और स्लाइड के बीच बुलबुले के लिए जाँच करें. बुलबुले दिखाई देते हैं, धीरे बारकोड अंत में स्लाइड बढ़ाने के लिए और फिर कोशिश करें. लगातार बुलबुले एक कागज प्रयोगशाला तौलिया (Kimwipe) के साथ कांच से सफाया किया जा सकता है.
  15. गिलास स्लाइड के आसपास दो धातु clasps, बारकोड अंत की ओर एक और पीछे की ओर एक तस्वीर. clasps के किनारों चाहिए पकड़ चिप के तहत प्लास्टिक प्रवाह के माध्यम से गले लगा. PB1 में डूबे हुए हर चिप के लिए दोहराएँ.
  16. पूरा प्रवाह के माध्यम से विधानसभाओं निकालें और बी पर क्षैतिज जगहench. गिलास स्लाइड के नीचे तरल बचने के लिए अनुमति खड़ी विधानसभा टिप नहीं ख्याल रखना. अधिक चिप्स धोने ट्रे में इंतजार कर रहे हैं, वे एक ही PB1 के तहत इकट्ठा किया जा सकता है. अन्य चिप्स उनके मूल HYB कक्षों में इंतजार कर रहे हैं, तो विधानसभा स्टेशन में सभी तरल त्यागने और बर्तन धोने, और 7.6 कदम पर लौटें.
  17. एक बार सभी मनका चिप्स के रूप में संभव के रूप में गिलास स्लाइड के पास, शल्य कैंची की एक जोड़ी लेने के लिए और बंद स्पेसर के दोनों सिरों में कटौती, उनके प्रवाह के माध्यम से विधानसभाओं में हैं.

8. धुंधला और एक्सटेंशन

  1. प्रवाह के माध्यम से चैम्बर रैक एक तापमान जांच के साथ कई पदों में 44 डिग्री सेल्सियस पर पहुंच गया है सत्यापित. तापमान में आधे से अधिक एक डिग्री से बंद है, तो नहाने के पानी के तापमान को समायोजित.
  2. नीचे विधानसभा फिसलने और शीर्ष पर गले लगा hooking द्वारा चैम्बर रैक पर एक मनका चिप प्रवाह के माध्यम से विधानसभा रखें. मनका चिप के पीछे की ओर चैम्बर रैक को छू जाना चाहिए. जीलड़की स्लाइड एक अभिकर्मक जलाशय के लिए फार्म शीर्ष पर नाली के साथ, बाहर का सामना करना पड़ जाना चाहिए. हर मनका चिप विधानसभा के लिए दोहराएँ.
  3. एक 200 μl विंदुक का प्रयोग, गिलास जलाशय में तरल वितरण से प्रवाह के माध्यम से विधानसभाओं RA1to 150 μl जोड़ें. 30 सेकंड के लिए सेते हैं. 5x दोहराएँ.
  4. एक 1000 μl विंदुक का प्रयोग, गिलास जलाशय में तरल वितरण से प्रवाह के माध्यम से विधानसभाओं XC1to 450 μl जोड़ें. 10 मिनट के लिए सेते हैं.
  5. कांच जलाशय में तरल वितरण से प्रवाह के माध्यम से विधानसभाओं के लिए 450 μl XC2 जोड़ें. 10 मिनट के लिए सेते हैं.
  6. कांच जलाशय में तरल वितरण से प्रवाह के माध्यम से विधानसभाओं के लिए 200 μl मंदिर जोड़ें. 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  7. कांच जलाशय में तरल वितरण से प्रवाह के माध्यम से विधानसभाओं के लिए 450 μl 95% formamide / EDTA मिश्रण जोड़ें. 1 मिनट के लिए सेते हैं. 1x दोहराएँ.
  8. 5 मिनट के लिए प्रवाह के माध्यम से विधानसभाओं सेते हैं.
  9. तापमान एल को गर्म पानी से स्नान सेटisted एसटीएम के ट्यूब पर (या 37 डिग्री सेल्सियस भी नहीं दिखाया गया है). प्रत्येक एसटीएम ट्यूब सूचीबद्ध ही तापमान है सुनिश्चित करें.
  10. प्रवाह के माध्यम से विधानसभाओं के लिए 450 μl XC3 जोड़ें. 1 मिनट के लिए सेते हैं. 1x दोहराएँ.
  11. गर्म पानी से स्नान तापमान वांछित तापमान तक पहुँच गया है, कांच जलाशय में तरल वितरण से प्रवाह के माध्यम से विधानसभाओं के लिए 250 μLSTM जोड़ें. 10 मिनट के लिए सेते हैं.
  12. कांच जलाशय में तरल वितरण से प्रवाह के माध्यम से विधानसभाओं के लिए 450 μl XC3 जोड़ें. 1 मिनट के लिए सेते हैं. 1x दोहराएँ.
  13. 5 मिनट के लिए प्रवाह के माध्यम से विधानसभाओं सेते हैं.
  14. कांच जलाशय में तरल वितरण से प्रवाह के माध्यम से विधानसभाओं के लिए 250 μl एटीएम जोड़ें. 10 मिनट के लिए सेते हैं.
  15. कांच जलाशय में तरल वितरण से प्रवाह के माध्यम से विधानसभाओं के लिए 450 μl XC3 जोड़ें. 1 मिनट के लिए सेते हैं. 1x दोहराएँ.
  16. 5 मिनट के लिए प्रवाह के माध्यम से विधानसभाओं सेते हैं.
  17. प्रवाह के माध्यम से करने के लिए 250 μl एसटीएम जोड़ेंकांच जलाशय में तरल वितरण द्वारा असेंबलियों. 10 मिनट के लिए सेते हैं.
  18. कांच जलाशय में तरल वितरण से प्रवाह के माध्यम से विधानसभाओं के लिए Add4 50 μl XC3. 1 मिनट के लिए सेते हैं. 1x दोहराएँ.
  19. 5 मिनट के लिए प्रवाह के माध्यम से विधानसभाओं सेते हैं.
  20. दोहराएँ 8.14-8.19 1x कदम.
  21. चैम्बर रैक से प्रवाह के माध्यम से विधानसभाओं निकालें और नहाने के पानी बंद कर देते हैं.

9. वॉशिंग और सील

  1. PB1 (लगभग 315 मिलीलीटर) के साथ एक धुंधला मनका चिप धोने पकवान भरें. दो खड़ी बर्तन साफ ​​करें और एक खड़ी मनका चिप ट्रे कम से कम एक वैक्यूम कई गुना के साथ साथ की जरूरत होगी.
  2. Clasps और गले के बीच एक पतली धातु पट्टी डालने और फिर pivoting द्वारा एक प्रवाह के माध्यम से विधानसभा अलग करना. एक तरफ कांच स्लाइड सेट और मनका चिप हटा दें. तुरंत खड़ी मनका चिप ट्रे में मनका चिप जगह और PB1 में डूब. पूर्वी वायु कमान का सामना करने के ख्याल रख रही है, हर प्रवाह के माध्यम से विधानसभा के लिए दोहराएँज मनका एक ही दिशा में चिप और हवा के लिए अपने जोखिम को कम.
  3. धीरे बुलबुले को दूर करने के लिए मनका चिप ट्रे आंदोलन. 5 मिनट के लिए PB1 में जलमग्न मनका चिप्स सेते हैं. XC4 साथ दूसरी खड़ी धोने पकवान भरें पिछले दिन तैयार. फिर मनका चिप ट्रे आंदोलन.
  4. XC4 से भरा धोने पकवान मनका चिप ट्रे ले जाएँ. धीरे बुलबुले को दूर करने के लिए ट्रे आंदोलन. 5 मिनट के लिए सेते हैं और फिर से आंदोलन.
  5. ताकि हर मनका चिप चेहरे पर मोती ऊपर की ओर, एक निर्बाध गति में, धोने के पकवान से मनका चिप ट्रे खींचने के लिए और एक टेस्ट ट्यूब रैक पर निर्धारित किया है. स्वयं ताला चिमटी के साथ, ट्रे के बाहर एक मनका चिप स्लाइड और एक टेस्ट ट्यूब रैक पर रखें. हर मनका चिप के लिए दोहराएँ.
  6. ध्यान से एक निर्वात desiccator को चिप्स की टेस्ट ट्यूब रैक हस्तांतरण. बंद करें और एक उचित सील सुनिश्चित करने, निर्वात पर बारी. 50-55 मिनट के लिए सेते हैं. यदि आवश्यक हो, ऊष्मायन के दौरान स्कैनर गर्म.

10. स्कैनिंग

  1. तूवैक्यूम बंद आर.एन. और धीरे धीरे वायुमंडलीय के लिए दबाव वापसी. मनका चिप्स सूख रहे हैं कि जाँच करें. यदि आवश्यक हो, कोई भी तरल या मलबे को हटाने के किनारों और एक कागज तौलिया के साथ चिप के नीचे पोंछे.
  2. स्कैनिंग सॉफ़्टवेयर सक्रिय और स्कैनिंग ट्रे को मनका चिप्स चाल है. समझाना फ़ाइल क्लाइंट सॉफ्टवेयर को सक्रिय करने और उनके इसी बॉक्स ID के साथ, वांछित मनका चिप बारकोड inputting द्वारा चिप की व्याख्या करना फ़ाइलें (dmaps) डाउनलोड करें. Unscanned मनका चिप्स सुरक्षित रूप से अप करने के लिए 72 घंटे के लिए एक सूखी, अंधेरे क्षेत्र में संग्रहित किया जा सकता है.
  3. चिप्स ठीक से ट्रे में बैठे हैं और समझाना फाइलें सॉफ्टवेयर द्वारा मान्यता प्राप्त हो जाने के बाद, स्कैनिंग शुरू करते हैं.

Representative Results

स्कैनिंग, जबकि एक ठीक से संसाधित मनका चिप उज्ज्वल और विशिष्ट लाल और हरे रंग की लेजर प्रकाश तीव्रता को प्रदर्शित करना चाहिए. चित्रा 6 में, iscan स्कैनिंग सॉफ्टवेयर सफलतापूर्वक एक कस्टम पैनल SNP जीनोटाइपिंग सरणी संकरित एक मानक जीनोमिक डीएनए नमूना प्रदर्शित करता है. विस्तार और धुंधला चरणों के दौरान जुड़े थे कि लेबल nucleotides दो लेज़रों की रोशनी के तहत प्रतिदीप्ति. इन न्यूक्लियोटाइड चुनिंदा खंडित डीएनए किनारा संकरित मनका के oligonucleotide श्रृंखला का विस्तार, और oligonucleotide चेन संस्करण के स्थल पर समाप्त करने के लिए डिजाइन किए हैं, जिसके परिणामस्वरूप संकेत के रंग और तीव्रता में उपस्थित alleles का निर्धारण किया जा सकता है SNP साइट.

कंपनी से सीधे प्राप्त chipID और स्थिति के लिए नमूना आईडी और नैदानिक ​​जानकारी से मेल खाता है जो एक उपयोगकर्ता जनित नमूना चादर,, और एक सरणी विशेष SNP प्रकट, एससीए आयात करने के क्रम में दोनों आवश्यक हैंnner आउटपुट फाइल GenomeStudio विश्लेषण सॉफ्टवेयर में. उदाहरण नमूना चादरें कंपनी की वेबसाइट पर पाया जा सकता है. GenomeStudio परियोजना का निर्माण हो जाने के बाद, जीनोटाइप स्वतः सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न परिणामस्वरूप तीव्रता समूहों से प्राप्त किया जा सकता है. कई प्रदर्शन विकल्प मौजूद हैं, डिफ़ॉल्ट दृश्य, नॉर्म थीटा (एक allelic तीव्रता अनुपात) बनाम नॉर्म आर (एक सामान्यीकृत तीव्रता मूल्य), अक्सर तीन अलग समूहों को अलग करने के लिए सबसे आसान साजिश है. अधिकांश SNPs मामूली एलील की आवृत्ति पर निर्भर करता है, एक, दो, तीन या समूहों को दिखाना चाहिए.

तीन समूहों ए.ए., अटल बिहारी, या बी बी alleles (7 चित्र देखें) का प्रदर्शन नमूने का प्रतिनिधित्व करते हैं. इन समूहों सॉफ्टवेयर का विश्लेषण उपकरण पट्टी से "सभी SNPs क्लस्टर" का चयन करके, कंपनी से सीधे एक मानक क्लस्टरिंग स्थिति टेम्पलेट आयात द्वारा, या क्लिक करें और के लिए मैन्युअल ईडीआई तीव्रता भूखंडों पर रंग हलकों खींचकर या तो जीनोटाइप सौंपा जा सकता है टी कहते हैं. (लाल, बैंगनी, या नीला) तीव्रता भूखंड पर नमूने के रंग कॉल (ए.ए., अटल बिहारी, या बी बी, क्रमशः) इंगित करता है, काला नहीं कॉल इंगित करता है. सॉफ्टवेयर का पूरा डेटा फलक में सूचीबद्ध SNPs के माध्यम से स्क्रॉल करके, प्रत्येक SNP के लिए क्लस्टरिंग देखी या वापस बुलाया जा सकता है. समूहों संतोषजनक कॉल नियत होने पर, सॉफ्टवेयर का पूरा डेटा फलक प्रत्येक विशेष SNP में प्रत्येक व्यक्ति के नमूने के लिए जीनोटाइप सूचीबद्ध करता है. तालिका के ऊपर कॉलम चयनकर्ता का विकल्प डेटा स्वरूप बदल सकते हैं.

डाटा में गहराई से विश्लेषण के लिए विश्लेषण उपकरण पट्टी के माध्यम से या सीधे पूरा डेटा तालिका से या तो निर्यात किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. अवलोकन - इंफिनियम परख प्रोटोकॉल.683/50683fig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. पूरी Hyb चैंबर का आधार है और चटाई, प्लस ढक्कन. [12] बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3 एक Beadchip लोड हो रहा है -.. इनलेट बंदरगाहों पर नमूना बांटना [12] बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें छवि.

चित्रा 4
चित्रा 4 Beadchip Coverseal दूर -.. कोने पर मुहर समझ और धीरे तिरछे छील [12] बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. पूरी Beadchip प्रवाह के माध्यम से विधानसभा - BeadChip एक स्पेसर के साथ एक गिलास स्लाइड से अलग और clasps के साथ ही है.> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 6
चित्रा 6. सफल BeadChip स्कैन - ए) BeadChip दोनों एक लाल और हरे रंग की लेजर के साथ स्कैन किया जाता है, स्कैनिंग सॉफ्टवेयर को प्रदर्शित करता है दोनों एक साथ. तीव्रता क्यूसी गुजर धारा बाईं ओर BeadChip प्रदर्शन पर हरे रंग पर प्रकाश डाला जाएगा. तीव्रता ई.पू. में नाकाम रहने धारा BeadChip प्रदर्शन पर लाल प्रकाश डाला जाएगा. बी) स्कैनिंग पूरा हो जाने पर, सॉफ्टवेयर लाल और हरे रंग दिखाता है उपरिशायी जाएगा. एक तेजी से बढ़ी में छवि में दिखाया गया है. प्रत्येक व्यक्ति मनका के रंग और तीव्रता एलील मौजूद इंगित करता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .


चित्रा 7. आदर्श थीटा क्लस्टर प्रोफाइल बनाम SNP आदर्श आर -. ए.ए., अटल बिहारी, और बी बी जीनोटाइप, लाल, बैंगनी और नीले बी रंग) एक SNP आवश्यकता के संपादन का प्रतिनिधित्व तीन अलग समूहों के साथ ए) एक वैध SNP. समयुग्मक अटल बिहारी होना चाहिए जो मध्य क्लस्टर, संयुक्त राष्ट्र बुलाया छोड़ दिया है. बी बी क्लस्टर गलती एबी. सी) एक गरीब प्रदर्शन SNP कहा जाता है. कोई अलग समूहों मौजूद ही नहीं जीनोटाइप, इस तीव्रता साजिश से प्राप्त किया जा सकता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

बड़े पैमाने पर जीनोटाइपिंग अनुप्रयोगों बेहतर कई मानव रोगों अंतर्निहित आनुवंशिक तंत्र को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया है. एक जीनोम चौड़ा संघ विश्लेषण के माध्यम से किसी भी महत्वपूर्ण संस्करण की खोज से आगे के अध्ययन के लिए एक उम्मीदवार क्षेत्र झंडा सकते हैं. इसके अलावा, जीनोटाइप डेटा अनुक्रमण परियोजनाओं पर गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक अच्छा साधन है.

नमूना throughput को अधिकतम करने के लिए, कई नमूना प्लेटों प्रवर्धित और उनके खंडित, resuspended राज्यों में संग्रहित किया जा सकता है. आठ प्लेटों कई बैचों के लिए प्रोटोकॉल के पहले 24 घंटे के संयोजन और चिप प्रसंस्करण की ~ 2-8 दिनों के लिए पर्याप्त सामग्री उपलब्ध कराने, एक ही दिन में परिलक्षित किया जा सकता है. प्रवर्धित प्लेटें पहले से खरीदकर भंडार कर रहे हैं, और नए नमूने स्कैनिंग पिछले रन पर शुरू होता है तुरंत बाद चिप्स संकरित रहे हैं, प्रसंस्करण अतिरिक्त नमूना तैयार करने के लिए थामने के लिए आवश्यकता के बिना लगातार चला सकते हैं. इसलिए, हालांकि नमूने पूरा गुजरना करने के लिए तीन दिन का समय लगेगापरख, डेटा दैनिक उत्पन्न किया जा सकता है. Assuming24 चिप्स हर दिन संसाधित कर रहे हैं, एक 5 दिन workweek एक 12 नमूना मनका चिप पर चलाने के लिए 1,000 से अधिक डीएनए के नमूने के लिए अनुमति देता है. किसी भी कदम या अभिकर्मक में नाकाम रही है, तो किसी भी सुधार लागू किया जा सकता से पहले, हालांकि, कई बैचों खराब प्रदर्शन के लिए खतरा हो सकता है. सरणियों स्कैन या विश्लेषण कर रहे हैं जब तक त्रुटियाँ नोटिस बच सकता है, throughput अधिकतम है, इसलिए, प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों में नमूने के सैकड़ों पहले से ही खोज पर एक ही दोषपूर्ण उपचार प्राप्त हो सकता है. खो अभिकर्मकों और डेटा बरामद नहीं किया जा सकता है, उपयोगकर्ता एक त्वरित कार्यप्रवाह के लिए जरूरत के खिलाफ इन जोखिम पर भी गौर करना चाहिए.

GenomeStudio विश्लेषण सॉफ्टवेयर सचमुच जीनोटाइपिंग प्रक्रिया की सफलता गेज करने के लिए पहला मौका है. नॉर्म थीटा तीव्रता भूखंडों बनाम नॉर्म आर ठीक से समूह है, तो यह मान SLI बदलता है, हालांकि नमूनों की औसत कॉल दर (कुल SNPs के प्रतिशत सफलतापूर्वक टाइप किया), 99% दृष्टिकोण चाहिएghtly सरणी प्रकार पर निर्भर करता है. 85-90% से कम एक कॉल दर के साथ किसी भी नमूने से डेटा भरोसेमंद नहीं है और खारिज किया जाना चाहिए. गुणवत्ता नियंत्रण के प्रयोजनों के लिए, परिणाम संभव किसी भी पहले से ज्ञात जीनोटाइप जब भी तुलना की जानी चाहिए. ऐसी कोई डेटा मौजूद है, जानबूझकर नमूना दोहराव थाली या सरणी नियुक्तियों की पुष्टि करने में एक उपयोगी उपकरण है. ये नकली जोड़े अलग चिप्स, प्लेटें, बैच, या परियोजनाओं पर रखा जाना चाहिए, उनके जीनोटाइप पीढ़ी पर जाँच की. विशिष्ट क्यूसी बाधाओं अन्वेषक की वरीयता के अनुसार भिन्न है, जबकि आम SNP बाधाओं नमूना कॉल सफलता, हार्डी वेनबर्ग संतुलन, या मामलों और नियंत्रण के बीच missingness, पर आधारित हैं आम नमूना बाधाओं कॉल दरों, मेंडेलियाई विसंगतियों, या पार संदर्भ के आधार पर कर रहे हैं, जबकि नैदानिक ​​लिंग डेटा को एक्स गुणसूत्र heterozygosity की [13].

किसी भी समस्या पैदा होती है, विश्लेषण सूट में पाया नियंत्रण डैशबोर्ड, को प्रस्तुत किया जा सकता हैकारण का पता लगाने के क्रम में कंपनी. इन नियंत्रणों अक्सर likeliest कदम या अभिकर्मक विफलता को मुद्दा नीचे संकीर्ण कर सकते हैं. ब्याज की किसी भी SNPs एक इंफिनियम जीनोटाइपिंग प्रयोग के माध्यम से पाए जाते हैं, उनकी तीव्रता भूखंडों दोबारा जांच आगे अनुसंधान का आयोजन किया जाता है इससे पहले क्लस्टरिंग त्रुटियों के लिए GenomeStudio में होना चाहिए.

एक असफल इंफिनियम जीनोटाइपिंग प्रयोग की वजह से मानव संसाधन त्रुटि या खराब गुणवत्ता वाले इनपुट डीएनए की संभावना है. नमूना मात्रा का ठहराव सही और सटीक होना चाहिए. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, किसी भी अभिकर्मकों किसी भी नमूने में जोड़ा या चिप प्रोटोकॉल द्वारा निर्धारित मात्रा में तिरस्कृत किया जाना चाहिए. Pipettes ठीक से calibrated किया जाना चाहिए. अभिकर्मकों समाप्ति के बाद चलाया जा नहीं करना चाहिए और एक बार thawed refrozen नहीं किया जाना चाहिए, RA1 अभिकर्मक के लिए बचा. संभव धुंधला हो जाना और विस्तार त्रुटियों को कम करने के लिए, formamide / EDTA मिश्रण को हर महीने नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए. सभी -20 डिग्री सेल्सियस अभिकर्मकों केवल मैनुअल defrost फ्रीजर में संग्रहित किया जाना चाहिए. सेंट में इस्तेमाल सभी Labwareaining, प्रोटोकॉल का विस्तार, और धोने के अंश तुरंत अप्रचार पर पानी और हल्के साबुन के साथ अच्छी तरह से rinsed होना चाहिए. HYB कक्ष में humidifying जलाशयों एक टेस्ट ट्यूब ब्रश और हल्के साबुन के साथ झाड़ी की जानी चाहिए. एक सप्ताह में एक बार, उनके उपयोगकर्ता मैनुअल के निर्देशानुसार गिलास स्लाइड, 10% ब्लीच के साथ धोया जाना चाहिए.

Disclosures

इस लेख के लेखक का खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.

Acknowledgments

इस कार्य के लिए अनुदान एनआईएच P20 GM103456, एनआईएच RC2 AR058959, और एनआईएच R56 AI063274 द्वारा प्रदान की गई है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumable or Equipment Manufacturer Part Number Minimum Required for 96 Samples
0.8 ml Deep Well Plate Thermo Scientific AB-0765 1
Plate Mats Thermo Scientific AB-0674 2
Reagent Basin Fisher Scientific 13-681-502 9
Heat-seal Sheets Thermo Scientific AB-0559 1
Flow-through Spacer Fisher Scientific NC9563984 6
Pipette tips - 200 μl Rainin GP-L200F 192
Pipette tips - 10 μl Rainin GP-L10F 16
Pipette tips - 1,000 μl Rainin GP-L1000F 16
DNA Suspension Buffer Teknova T0220 0.5 ml
0.1 N NaOH Fisher Scientific AC12419-0010 0.5 ml
Isopropanol (HPLC grade) Fisher Scientific A451 15 ml
Ethanol (200-proof) Sigma-Aldrich 459836 330 ml
Formamide (100%) Thomas Scientific C001K38 15 ml
EDTA (0.5 M) Amresco E177 0.2 ml
10 μl 8-channel Pipette Rainin L8-10XLS 1
200 μl 8-channel Pipette Rainin L8-200XLS 2
1,000 μl Single-channel Pipette Rainin L-1000XLS 1
Microplate Shaker VWR 13500-890 1
Refrigerated Microplate Centrifuge VWR BK369434 1
Hybridization Oven Illumina SE-901-1001 1
Hybex Microsample Incubator SciGene 1057-30-0 1
Hybex MIDI Heat Block Insert Illumina BD-60-601 1
Heat Sealer Thermo Scientific AB-0384 1
Hyb Chamber w/ Insert and Mat Illumina BD-60-402 2
Surgical Scissors Fisher Scientific 13-804-20 1
Flow Through Assembly Parts Illumina WG-10-202 8
Wash Rack and Dish Illumina BD-60-450 1
Genepaint Chamber Rack Tecan 760-800 1
Temperature Probe Illumina A1-99-109 1
Staining Rack and Dish Illumina WG-10-207 1
Self-Closing Tweezers Ted Pella, Inc 5374-NM 1
Vacuum Manifold Ted Pella, Inc 2240 1
iScan or HiScan Illumina - 1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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बुनियादी प्रोटोकॉल अंक 81 जीनोमिक्स SNP जीनोटाइपिंग इंफिनियम iscan HiScan Illumina
बड़े पैमाने पर SNP जीनोटाइपिंग अनुप्रयोगों के लिए इंफिनियम परख
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Adler, A. J., Wiley, G. B., Gaffney, … More

Adler, A. J., Wiley, G. B., Gaffney, P. M. Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications. J. Vis. Exp. (81), e50683, doi:10.3791/50683 (2013).

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