Infinium analyse for Storskala SNP genotyping Applications

Summary

En protokoll er beskrevet som bruker Illumina er infinium analyser for å utføre storskala genotyping. Disse analysene kan sikkert genotype millioner av SNPs over hundrevis av individuelle DNA-prøver i tre dager. Når generert, kan disse genotyper brukes til å sjekke for assosiasjoner med en rekke forskjellige sykdommer eller fenotyper.

Abstract

Genotyping varianter i det menneskelige genom har vist seg å være en effektiv metode for å identifisere genetiske assosiasjoner med fenotyper. Fordelingen av varianter innenfor familier eller populasjoner kan lette identifikasjon av genetiske faktorer for sykdom. Illumina panel av genotyping BeadChips tillater etterforskere genotype tusenvis eller millioner av single nukleotid polymorfismer (SNPs) eller å analysere andre genomisk varianter, for eksempel kopi nummer, på tvers av et stort antall DNA-prøver. Disse SNP'er kan være spredt over hele genomet eller målrettet i bestemte områder for å maksimere potensial oppdagelse. Den infinium analysen har blitt optimalisert for å gi høy kvalitet og nøyaktige resultater raskt. Med riktig oppsett, kan en enkelt tekniker behandle fra noen hundre til over tusen DNA-prøver per uke, avhengig av hvilken type array. Denne analysen leder brukerne gjennom hvert trinn, og starter med genomisk DNA og slutter med skanning av tabellen. Ved hjelp av anstendighet reagents, ​​er prøvene forsterket, fragmentert, utfelt, resuspendert, hybridisert til chip, forlenges med et enkelt base, farget, og skannet på enten en iScan eller Hi Scan høyoppløselig optisk imaging system. En natten over trinnet er nødvendig for å forsterke DNA. DNA er denaturert og isotermisk forsterket av hel-genomet forsterker, og derfor er det ikke nødvendig for PCR. Prøvene hybridiseres til de matriser under et andre trinn over natten. Ved den tredje dagen, prøvene er klare til å bli skannet og analysert. Forsterket DNA kan bli lagret i store mengder, slik at kule matriser som skal behandles hver dag i uken, og maksimerer gjennomstrømning.

Introduction

Skrive single nukleotid polymorfismer (SNPs) er en viktig metode for å identifisere risiko varianter assosiert med sykdom. Historisk har omfanget av genotyping eksperimenter vært begrenset av tilgjengelig teknologi. Gel elektroforese-baserte metoder for genotyping er begrenset i sample-og SNP-throughput ^[1]. Utvikling av disse analysene kan ofte være arbeidskrevende, avhengig av sminke og strukturen i regionen rundt variant for optimalisering ^[1]. TaqMan genotyping-analyser utviklet av Life Technologies, kan kjøre et stort antall prøver raskt og med minimal involvering tekniker [2], men SNP-multipleksing begrensninger fortsette å begrense det totale antall genotyper til godt under millioner per dag ^{[3,4 ].} Sequenom sin iPlex plattformen kan også kjøre mange prøver på en gang, men, som færre enn hundre SNPs kan multiplekset sammen, er gjennomstrømningen forholdsvis lav samlet ^[5]. Beckman Coulter SNP stream teknologikan teoretisk produsere over tre millioner genotyper per dag, men dette teknologigrenser prosjektet utvalg til et maksimum bare førtiåtte SNPs per reaksjon ^[4,6]. Mens Golden analysen kan behandle nesten to hundre DNA-prøver hver dag på hundrevis eller tusenvis av SNPs per prøve, er prisen per genotype ikke konkurransedyktig med avanserte, ultra-high-throughput teknikker når du skriver over tre tusen SNPs på en gang ^{[4,7 ].} For å kunne behandle flere millioner genotyper per dag, omfanget som kreves for store genome-wide forening studier, har matrise-hybridiseringsbestemmelser blitt den mest kostnadseffektive alternativet på markedet.

Affymetrix linje av hybridisering arrays og Illumina linje av infinium-baserte arrays tillate potensielt hundrevis av prøver å være skrevet på hundretusener eller millioner av SNPs parallelt ^[4,8]. Disse SNP'er kan være spredt over hele genomet, lokalisert i områder av interesse, for eksempel exomes, eller tilpasses til brukerens preferanser. Disse arrays har fordelen av å ikke bare være i stand til å nøyaktig genotype en million SNPs per prøve på en gang, men også for å måle kopi nummer variasjon, potensielt avduking kromosomavvik. Infinium-justert OMNI BeadChip arrays nå har muligheten til å genotype opp til nesten fem millioner markører per prøve, inkludert en halv million tilpasset loci, på opp til nesten hundre prøver hver dag.

Som de fleste sykdommer har en genetisk komponent, kan disse store eksperimenter være avgjørende i å finne gener assosiert med sykdom. Høy gjennomstrømming genotyping muliggjør effektiv genotype generasjon i utvalget setter stor nok til å overbevis oppdage genetisk tilknytning ved lavere mindre allelfrekvensene. Hel-genom genotyping prosjekter kan brukes til å finne områder med statistisk signifikant case-control allel frekvens eller kopi nummer forskjeller ^[9,10,11]. Ifølge National Menneskelig Genome Research Institute, genome-wide forening studier førte til 1490 separate publikasjoner mellom 25 november 2008 og 25 januar 2013, som stammer fra oppdagelsen av 8283 SNPs med en p-verdi mindre enn 1 x 10 ^-5 (se http:// www.genome.gov/gwastudies/). Disse studiene, som forsket på forhold som strekker seg fra høyden til testikkelkreft, dratt nytte av den brede tilnærmingen gis av et genom-wide analyse. I tilfeller som disse, kan hele regioner av interesse har rømt varsel hadde omfanget av å skrive vært for restriktive. Således, for storskala krets analyser, er en genom-wide genotyping teknikk teknikken for valget.

Forskjellige versjoner av den infinium assay eksisterer, hvert beregnet for bruk sammen med spesielle typer matriser. Den InfiniumUltra analysen, grundig drøftet nedenfor, er passende for mange 12 - eller 24-sample array-chips. Disse ofte genotype over hundre tusen SNPs per DNA-prøve og fokusere på targeted regioner, slik som på exome eller tilpassede paneler. Andre analyse versjoner kan være nødvendig for andre typer chips, slik som hel-genom genotyping matriser. Men som alle infinium analyser dele et felles grunnlag og hovedsakelig skiller bare av reagensnavn, de reagensvolumene, eller den nøyaktige fargereagens prosedyre, teknikker perfeksjonert på én analyse versjon kan ofte være universelt brukt. Andre matriser, slik som metylering matriser, kan bruke en nesten identisk protokoll, så vel. Hensyn må tas til bare å bruke versjonen av analysen som kreves for brikketype i bruk. Noen typer, som for eksempel de som måler genekspresjon nivå, kan kreve bruk av en nonInfinium protokollen.

Prøvene må behandles i grupper. For eksempel, med InfiniumUltra assay, prehybridization reagensrør inneholde nok volum til å kjøre 96 prøver, og rørene kan ikke fryses igjen. Derfor må prøvene kjørt i grupper på 96 prøver om gangen. Prøvene vil bli forsterket på granert dag. Etter omtrent 1 time for benchwork, må prøvene oppvarmes i en konveksjonsovn for 20 til 24 timer. Den følgende dag, vil nesten 4 hr bli brukt fragmentering, utfelling, og risting av prøvene, noe som medførte at prøvene kan enten bli frosset for senere bruk eller hybridisert til brikken. Last chips tar nesten 2 timer, hvoretter prøvene blir hybridisert over natten i 16-24 timer. På den tredje dag, tar farging og forlengelsen trinnet ~ 4 hr. En ytterligere time blir brukt vasking, belegg, og tørking av flisen. Endelig er de matriser skannet, noe som kan ta 15-60 min / chip, avhengig av den type som anvendes.

Forholdsregler standard laboratorium sikkerhet og renslighet gjelder. Selv om forsterkningen er ikke PCR-basert, separate arbeidsstasjoner for pre-og postamplification prosedyrer er nødvendige for å minimere sannsynligheten for forurensning. Identifikasjonsnummeret til hver kit levert reagens i bruk må være logget inn for en sporing ark. ReageNTS skal ikke tines umiddelbart før bruk og invertert flere ganger før dispensering. Det DNA som skal skrives må være av høy kvalitet genomisk DNA (260/280 absorbans-forhold på 1,6 til 2,0, 260/230 absorbans-forhold av under 3,0), isolert ved hjelp av standardmetoder, og kvantifisert med et fluorometer. Nedbrytning av DNA er ofte en medvirkende årsak til lav kvalitet analyseresultatene. Typisk blir 200 ng av DNA som kreves, selv om denne mengde kan variere i noen chip typer. En Tecan væske-håndtering robot kan automatisere mange skritt i protokollen og redusere menneskelige feil som en faktor.

Protocol

Day One

En. Forberedelse

1. Tilsett 200 ng av DNA inn i en dyp brønn, 96-prøveskilt. Minst 96 prøver (full plater) må være belagt for å sikre at ingen reagens vil være bortkastet. Merke plate med en strekkode klistremerke levert av settet og sentrifuger det.
2. For å normalisere volumene, lar prøvene i en skuff eller avtrekksskap over natten for å fordampe væsken. Dekk platen løst med et lokk eller et papirhåndkle for å holde støv.

2. Amplification

ADVARSEL: prøvene bør ikke gjennomgå forsterkning med mindre fire timer vil være tilgjengelig på den påfølgende dagen for fragmentering, nedbør, og blandet godt skritt.

1. Fjern firma forsynt eske eller pakke med rør som er merket "Pre" fra -20 ° C fryseren (en tube av MA1, MA2, og MSM er tilstrekkelig for hvert sett av 96 prøver). Sett rør av MA2 og MSM på benken for å tine. Slå på riktig kalibrertovnen og satt til 37 ° C.
2. Ved hjelp av en reagens-bassenget, og en 10 yl, 8-kanal pipette, dispensere 4 pl av DNA resuspensjon buffer i hver brønn for å rehydrere prøvene. Det er ikke nødvendig å forkaste pipettespissene mellom hver kolonne hvis omsorg er tatt for ikke å berøre flytende.
3. Med en 8-kanal pipette, dispensere 20 mL av MA1 i hver brønn på platen. For hvert nytt reagens, bruke en fersk reagens bassenget. Dekk platen med en gjenbrukbar segl, puls-sentrifuge, og vortex i en min ved 1600 rpm på en mikro shaker.
4. 2.4) Inkuber ved romtemperatur i minst 30 min.
5. Tilsett 4 pl av 0,1 N NaOH til hver brønn på platen. Dekk platen med gjenbruk segl, puls-sentrifuge, og vortex i en min ved 1600 rpm.
6. Inkuber ved romtemperatur i 10 min.
7. Tilsett 34 pl av MA2 i hver brønn på platen.
8. Tilsett 38 pl av MSM i hver brønn på platen. Dekk platen medgjenbruk segl, puls-sentrifuge, og vortex i en min ved 1600 rpm.
9. Sett i ovnen i 20-24 timer.

Dag to

Tre. Fragmentering

1. Fjern FMS-rør fra "Post-1" -20 ° C boksen (ett rør er tilstrekkelig for hvert sett av 96 prøver). Tine på benk eller i et rom-temperatur vannbad. Etter innsetting av MIDI-plate sette inn i en tabletop micros inkubasjon system, slå på varmen blokk og satt til 37 ° C.
2. Når rørene er tint, fjerner du prøveskilt fra ovnen og puls-sentrifuger. Tilsett 25 pl av FMS i hver brønn av DNA-plate. Sett på lokket, puls-sentrifuge, og virvle ved 1600 opm i 1 min.
3. Inkuber platene i varmeblokk i 1 time.

4. Nedbør

1. Fjern PM1 røret fra "Post-3» 4 ° C boks eller pakke og oppvarmes til romtemperatur (en slange er tilstrekkelig for hvert sett av 96 prøver). Fjern platen fra varmen block og puls-sentrifuger.
2. Tilsett 50 mL av PM1 i hver brønn av platen. Sett på lokket, puls-sentrifuge, og virvle ved 1600 opm i 1 min.
3. Inkuber platene i varmeblokk i 5 minutter.
4. Fjern plate fra varme blokk, slå den av, og kast platen lokket. Tilsett 155 ul av 100% isopropanol i hver brønn på platen. Dekk tett med et nytt lokk og manuelt snus platen flere ganger for å blande.
5. Plasser plate i 4 ° C i minst 30 min. Slå på nedkjølt sentrifuger og satt til 4 ° C for å kjøle.
6. Balanse platen og sentrifuge ved 4 ° C i 20 min ved 3000 x g.
7. Kontroller bunnen av platen, uten å snu den og bekrefter prøvene utfelt i en blå pellet. Dersom ingen pellets kan sees, sentrifuger på nytt. Få papirhåndklær.
8. Kast lokket og raskt fjerne væsken ved å snu platen og trykke den hardt på stasjonære dekket i papirhåndklær. Når platen er inverted, tar seg ikke å gå tilbake den mens noe væske igjen. Gjentatte ganger på platen mot benkeplate til all væske er fjernet.
9. Sett platen på et reagensglass beholder, invertert, for å tørke. Inkuber ved romtemperatur i 1 time.

5. Resuspensjon

1. Fjern RA1 fra «Post-2" -20 ° C boks og tine i romtemperatur vannbad. Slå på ovnen og sett den til 48 ° C.
2. Tint, dispensere 23 pl av RA1 til hver brønn av prøveplaten. Ikke hell hele flasken av RA1 inn i bassenget; spare 30 ml for senere. Hvis prøvene vil bli hybridiserte på arrays senere den dagen, plasserer RA1 inn en 4 ° C kjøligere. Hvis prøvene vil bli kjørt på et senere tidspunkt, merke flasken og frys den RA1.
3. Varme forsegle et nytt lokk på tallerkenen. Puls-sentrifuger platen og legg den i ovnen i 1 time.
4. Fjern platen fra ovnen og vortex ved 1800 opm i 1 min.
   Prøvene kan trygt bli held på dette stadiet i opptil en uke. Plater kan bli lagret, og prøvene kan bli omorganisert for å forberede seg perle chip-programmet, hvis det er nødvendig. Dersom fartøyet med fremgangsmåten, lar platen ved romtemperatur, og slå på varmeblokken. Ellers lagres platen ved -20 ° C.

6. Hybridisering

ADVARSEL: Prøver bør ikke gjennomgå hybridisering med mindre 5,5 hr er tilgjengelig på følgende dag for flekker og vaske trinn.

1. Slå på varmeblokk og sette den til 95 ° C. Slå på ovnen og sett den til 48 ° C.
2. Etter at temperaturen har stabilisert seg, inkuber platen på varmeblokken i 20 min.
3. Mens platen er denaturering, fjerne boks med perle chips fra 4 ° C og sett den på benken. Ta en flaske med XC4 (fra rom-temperatur kit) og tilsett 330 ml 100% etanol. Rist det godt og inkuber ved værelsestemperatur over natten. Forbered formamide / EDTA blanding (95% formamide, 0,2%EDTA (0,5 M), 4,8% H ₂ O ved volum) og fryse i atskilte 15 ml inkrementer. Overflødig formamide kan bli lagret.
4. Fjern prøven platen fra varmeblokken. Inkuber ved romtemperatur i 30 min.
5. Mens platen er kjøling, forberede hyb kammeret. Ett kammer vil være nødvendig for hver fjerde perle chips bearbeides.
   Plasser en gummi-matte på toppen av hyb kammeret base, innretting av tykkere hullet med fronten av basen. Strekkodesymbolet etset inn i basen bør fortsatt være synlig (se figur 2).
6. Ved hjelp av en 1000 mL pipette, dispensere 400 mL av PB2 i hver av de åtte fuktighets-reservoarene skåret inn i basen. PB2 kan finnes i "Post-3" boks eller pakke. Plasser hyb kammer på basen og lås begge ender ved å stenge to hekter på diagonalt motsatte sider først.
7. Fjern de individuelle sølv pakker av bead chips fra de respektive bokser, men, for å minimere chips "eksponeringHusk å luft og lys, ikke ennå åpne dem. Nøye skanne strekkodene på sjetongene og registrere i hvilken rekkefølge de vil bli lastet på en sporing ark, sammen med boksen IDer som de kom. En grundig forståelse av hvor hver enkelt DNA-prøven vil bli dispensert på perle chips er nødvendig.
8. Fjern de individuelle sølv pakker av bead chips fra de respektive bokser, men, for å minimalisere flisen eksponering mot luft og lys, ikke ennå åpne dem. Nøye skanne strekkodene på sjetongene og registrere i hvilken rekkefølge de vil bli lastet på en sporing ark, sammen med boksen IDer som de kom. En grundig forståelse av hvor hver enkelt DNA-prøven vil bli dispensert på perle chips er nødvendig.
9. Like før 30 min avkjøles har fullført, åpne sølv perle chip pakker. Fjern brikkene fra sine klare plastlommer. Uten å berøre perler, plassere hver perle chip på en hyb kammerinnsats, orientere chipstrekkode med strekkodesymbolet etset inn i innsatsen øverste overflaten.
10. Trekk av og kast lokket på prøveskilt. Ta 15 ul prøve fra prøveplaten og langsomt dispensere på innløpet til matrisen (se figur 3). Ekstraordinær forsiktighet må tas for å plassere den riktige prøven på riktig perle chip i riktig posisjon, matchende perle chip rekkefølgen de ble tatt tidligere. En flerkanals pipette kan brukes til å dispensere væske på chips, men omtanke må tas for å aspirere bare antall prøver som trygt kan plasseres på vulsten chip, som antallet rader på en plate som ikke alltid stemmer overens med antallet rader på en chip.
11. Når hver prøve har blitt plassert på den tilsvarende matrise, visuelt inspisere chip for bobler eller regioner ikke belagt i væske. Hvis disse problemene finnes, rist innsatsen. Om nødvendig kan mer væske tilsettes til matrisen. Pass på å legge inn riktig DNA-prøve.
12. Åpne hyb kammer enD Plasser innsatsene over fuktighets-reservoarene. Strekkoden på brikken skal plasseres over strekkoden etset inn i hyb kammersokkelen. Sett på hyb kammerdekselet og lukk alle fire hekter ved å lukke krokene på diagonalt motsatte sider først.
13. Inkuber hyb kammeret i ovnen i 16 til 24 timer. Pass på å ikke vippe kamrene når du flytter dem.
14. Hvis mer enn én plate er å bli behandlet, gå tilbake til trinn 6.2. Behandler mer enn 24 perle chips på en dag er ikke anbefalt for å både redusere sannsynligheten for menneskelige feil ved håndtering av en stor mengde forbruksvarer eller chips og å minimere mengden av tiden det tar å behandle chips i fremtidige trinn, som omsorg må tas for å begrense deres eksponering for luft så mye som mulig. En flaske XC4 er tilstrekkelig for opp til 24 perle chips.

Dag tre

7. Farging Forberedelse

1. Fjern Hyb kamre fra ovnen, og inkuber ved værelse temperature for 25 min. Hvis behandlingen mer enn to Hyb kamre, rave sin dual fjerning hvert 10 min. For å holde flisen fra tørking, ikke ennå åpne Hyb kamre.
2. Mens Hyb kamrene er kjøling, fjerne rør av XC1 Xc2 TEM, STM, og ATM fra "Post-1" -20 ° C boksen og satt på benken for å tine. Ta en flaske RA1 fra "Post-2"-boksen ved -20 ° C (eller 4 ° C hvis gjenbruk av reagensen fra den foregående dag) og tining i et romtemperatur-vannbad. Tine en tube med 95% formamide også. For åtte perle chips bearbeidet, to tuber hver reagens, 10 ml RA1, 15 ml formamid, og 150 ml XC3 (funnet i et rom-temperatur, selskaps levert boks) vil være nødvendig.
3. For hver brikke behandlet, vil ett glass slide, en plast gjennomstrømning brace, to metallspenner, og en plast spacer være nødvendig. For plast spacer, bruker bare den klare ett, skille ut og kast den ugjennomsiktig spacer. I tillegg er to perle chip vask-ogen perle chipbrett vil være nødvendig, sammen med en flytende samlingsstasjon og en plast skinnen.
4. Rengjør glassplater ved å sprøyte dem med etanol og tørke dem tørre.
5. Slå på varmt vannbad som er festet til gjennomstrømning kammer rack og sette den til 44 ° C. Rist kammeret stativet for å løsne eventuelle bobler.
6. Når hyb kammeret er avkjølt for 25 min, fylle en vask tallerken med PB1 (ca. 200 ml). PB1 kan finnes i "Post-4" romtemperatur boksen.
7. Åpne en hyb kammer. Fjern dekselpakning fra en perle chip ved å ta tak forseglingen på ett hjørne og forsiktig peeling diagonalt (se figur 4). Når forseglingen er fjernet, umiddelbart plassere brikken i en perle chip skuffen og senk i PB1 uten å berøre perler. Gjenta inntil skuffen er fylt med perle chips, tar seg ikke å la noen chip tørr.
8. Forsiktig agitere skuffen for å fjerne eventuelle bobler og la chips neddykket i 1 min.Fyll en andre vaske tallerken med PB1. Agitere skuffen igjen.
9. Flytt skuffen av perle sjetonger i andre vaske fatet. Forsiktig agitere og la trekke i 1 min, deretter agitere igjen.
10. I væskegjennomstrømnings montering stasjonen, sett fire sorte plastgjennomstrømningsbukseseler i sporene. Fylle-stasjon med PB1 til væsken når nesten høyden av de åtte monterings-brakettene (ca. 150 ml).
11. Fjern en perle chip fra skuffen og legg det inn i sammenstillingsstasjon på en plast gjennomstrømning brace. Brikken strekkode bør være på linje over strekkoden symbol etset inn i sammenstillingsstasjon. Gjenta for de tre andre chips som får plass i forsamlingen stasjonen.
12. Plasser en klar plast spacer på toppen av en perle chip. De ytre kantene av avstandsstykket bør omgi brakettene innenfor monteringsstasjonen. Gjenta for de andre chips neddykket i PB1.
13. Legg plast forsamlingen bar i forsamlingen stasjonen ved å montere den over sporene. Forsiktig en glass-slide på toppen av plast-avstandsstykket ved å presse den bakre ende av glide mot skinnen, og langsomt å senke den fremre inn i væsken. Sporet på toppen av lysbildet skal vende nedover, rett over strekkoden på brikken, og etterlater et gap mellom perle chip og lysbildet på strekkoden slutten. Gjenta for de andre chips neddykket i PB1. For en fullstendig gjennomstrømning montering diagram, se figur 5.
14. Se etter bobler mellom chip og lysbilde. Hvis det oppstår bobler, forsiktig heve lysbildet på strekkoden slutten og prøv igjen. Vedvarende bobler kan tørkes fra glasset med et papir laboratorium håndkle (Kimwipe).
15. Snap to metallspenner rundt glasset lysbilde, ett mot strekkode slutten og ett bakover. Kantene på krokene skal gripe plastgjennomstrømnings spenne under brikken. Gjenta for hver brikke neddykket i PB1.
16. Fjern de ferdige gjennomstrømnings forsamlinger og plasser horisontalt på bench. Pass på ikke å tippe montering vertikalt, slik at væsken under glasset lysbilde å flykte. Hvis flere chips venter i vask skuffen, kan de settes sammen under samme PB1. Hvis andre chips venter i sine opprinnelige Hyb kamre, forkaste all væske i forsamlingen stasjonen og vaske, og gå tilbake til trinn 7.6.
17. Når alle perle chips er i sine gjennomstrømningssammenstillinger, kan et par kirurgiske sakser og kutte begge ender av avstandsstykket av, som i nærheten av glass-slide som mulig.

8. Farging og Extension

1. Kontroller at gjennomstrømningskammeret stativ har nådd 44 ° C i flere posisjoner med en temperatursonde. Hvis temperaturen er av mer enn en halv grad, justeres temperaturen i vannbadet.
2. Plasser en perle chip gjennomstrømnings montering på kammeret stativet ved å skyve forsamlingen ned og hekte spenne på toppen. Baksiden av vulsten brikken skal berøre kammerbeholder. Den glass glide skal vende ut, med sporet i toppen for å danne et reagensreservoar. Gjenta for hver perle chip montering.
3. Ved å bruke en 200 ul pipette, tilsett 150 pl RA1to gjennomstrømningselementer ved dispensering av væsken inn i glassbeholderen. Inkuber i 30 sek. Gjenta 5x.
4. Ved hjelp av en 1000 mL pipette, tilsett 450 ul XC1to gjennomstrømningselementer ved dispensering av væsken inn i glassbeholderen. Inkuber i 10 min.
5. Legg 450 mL Xc2 til gjennomstrømningselementer ved dispensering av væsken inn i glassbeholderen. Inkuber i 10 min.
6. Tilsett 200 ul TEM til gjennomstrømningselementer ved dispensering av væsken inn i glassbeholderen. Inkuber i 15 min.
7. Til 450 pl 95% formamid / EDTA blanding til gjennomstrømningselementer ved dispensering av væsken inn i glassbeholderen. Inkuber i 1 min. Gjenta 1x.
8. Inkuber gjennomstrømnings sammensetninger for 5 min.
9. Still varmt vannbad til temperaturen listed på rørene av STM (eller 37 ° C hvis ingen er vist). Sørg for at hver STM rør har samme temperatur oppført.
10. Legg 450 mL XC3 til gjennomstrømningssammenstillinger. Inkuber i 1 min. Gjenta 1x.
11. Når varmt vannbad temperaturen har nådd den ønskede temperatur, tilsett 250 μLSTM til gjennomstrømningselementer ved dispensering av væsken inn i glassbeholderen. Inkuber i 10 min.
12. Legg 450 mL XC3 til gjennomstrømningselementer ved dispensering av væsken inn i glassbeholderen. Inkuber i 1 min. Gjenta 1x.
13. Inkuber gjennomstrømnings sammensetninger for 5 min.
14. Tilsett 250 pl ATM til gjennomstrømningselementer ved dispensering av væsken inn i glassbeholderen. Inkuber i 10 min.
15. Legg 450 mL XC3 til gjennomstrømningselementer ved dispensering av væsken inn i glassbeholderen. Inkuber i 1 min. Gjenta 1x.
16. Inkuber gjennomstrømnings sammensetninger for 5 min.
17. Tilsett 250 pl STM til gjennomstrømningssammenstillinger ved dispensering av væsken inn i glassbeholderen. Inkuber i 10 min.
18. Add4 50 ul XC3 til gjennomstrømningselementer ved dispensering av væsken inn i glassbeholderen. Inkuber i 1 min. Gjenta 1x.
19. Inkuber gjennomstrømnings sammensetninger for 5 min.
20. Gjenta trinn 08.14 til 08.19 1x.
21. Fjern gjennomstrømnings forsamlinger fra kammeret rack og skru av vannbadet.

9. Vask og Sealing

1. Fyll en farging perle chip vask tallerken med PB1 (ca 315 ml). To vertikale vaske retter og en vertikal vulsten chip skuffen vil være nødvendig, sammen med i det minste en vakuum-manifold.
2. Demontere en gjennomstrømning forsamlingen ved å sette inn en tynn metallstang mellom bøyler og seler og deretter å svinge. Sett til side glass lysbilde og fjern perle chip. Umiddelbart plassere perle chip i den vertikale perle chip skuffen og senk i PB1. Gjenta for hver gjennomstrømning montering, ta vare å møte EACh vulsten chip i samme retning, og å minimalisere deres eksponering for luft.
3. Forsiktig agitere perlen chip skuffen for å fjerne boblene. Inkuber nedsenkede perle chips i PB1 for 5 min. Fyll den andre vertikale vaske fatet med XC4 forberedt dagen før. Vend perle chip skuffen igjen.
4. Flytt perle chip skuffen til vaske tallerken fylt med XC4. Forsiktig agitere skuffen for å fjerne boblene. Inkuber i 5 min, og agitere nytt.
5. I en jevn bevegelse, trekker perle chip skuffen fra vaske fatet og satt på et reagensrør rack, slik at perlene på hver perle chip ansiktet oppover. Med selvlåsende pinsett, skyver en perle chip ut av skuffen og legg på et reagensrør rack. Gjenta for hver perle chip.
6. Overfører testrøret rack av chips forsiktig til en vakuum eksikkator. Lukk og slå på vakuum, noe som sikrer en forsvarlig tetning. Inkuber i 50-55 min. Hvis nødvendig, varme opp skanneren under inkubasjon.

10. Skanning

1. Turn av vakuum og sakte tilbake trykket til atmosfærisk. Kontroller at perle chips er tørre. Om nødvendig, tørk kantene og bunnen av chip med et papirhåndkle for å fjerne væske eller rusk.
2. Aktiver skanning programvare og flytte perle chips til skanning skuffen. Last ned chip er dekode filer (dmaps) ved å aktivere Decode File-klienten og legge inn de ønskede perle chip strekkoder, sammen med de tilsvarende boks IDer. Uskannede perle chips kan trygt lagres på et tørt, mørkt område for opp til 72 timer.
3. Når brikkene er satt inn riktig i skuffen og dekode filene er anerkjent av programvaren, starte skanningen.

Representative Results

Et riktig behandlet perle chip bør vise lyse og tydelige røde og grønne laser-lys intensiteter mens du skanner. I figur 6, viser iScan skanneprogramvare en standard genomisk DNA-prøve vellykket hybridisert til en custom-panel SNP genotyping array. De merkede nukleotider som var festet under utvidelse og farging trinn fluoresce under lysene av de to lasere. Ettersom disse nukleotidene selektivt forlenger vulsten er oligonukleotidet kjede hybridisert til den fragmenterte DNA-tråd, og som oligonukleotid-kjeder er konstruert til å avslutte på stedet av den variant, kan fargen og intensiteten av det resulterende signalet brukes til å bestemme lene tilstede på SNP nettstedet.

En brukergenerert prøvearket, som matcher prøve-IDer og klinisk informasjon til chipID og posisjon, og en rekke spesifikke SNP manifest, hentet direkte fra selskapet, er både nødvendig for å importere scanner ut filene inn i GenomeStudio analyse programvare. Eksempel prøve ark kan finnes på selskapets hjemmeside. Når GenomeStudio prosjektet er bygget, kan genotyper fås fra de resulterende intensitet klynger automatisk generert av programvaren. Selv om flere visningsalternativer finnes, standardvisningen, Norm-R (en normalisert intensitet verdi) vs Norm-Theta (en allelisk intensitet ratio), er ofte den enkleste komplott for å skille tre forskjellige klynger. De fleste SNPs bør vise en, to, eller tre klynger, avhengig av den mindreårige allel frekvens.

De tre klynger representere prøvene demonstrerer AA, AB, eller BB-alleler (se figur 7). Disse klyngene kan tildeles genotyper enten ved å importere en standard gruppering posisjon mal direkte fra selskapet, ved å velge "Cluster All SNPs" fra analyseverktøylinjen av programvaren, eller ved å klikke og dra de fargede sirkler på intensitet tomter til manuelt edi t-samtaler. Fargen av prøven på intensiteten plot (rødt, fiolett eller blått) angir anrop (AA, AB, BB, henholdsvis); sort indikerer ingen samtale. Ved å bla gjennom de SNPs oppført i Full Data-ruten av programvaren, kan clustering for hver SNP vises eller tilbakekalt. Når klyngene er tildelt tilfredsstillende samtaler, Full Data-ruten av programvaren viser genotyper for hver enkelt prøve på hver bestemt SNP. Kolonne Velger alternativet ovenfor bordet kan veksle dataformater.

Data kan eksporteres enten gjennom analyse verktøylinjen eller direkte fra Full datatabellen for grundig analyse.

Figur 1. Oversikt - infinium Assay Protocol.683/50683fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Figur 2. Komplett Hyb Chamber base og matte, pluss lokket. ^[12] Klikk her for å se større bilde .

Figur 3 Legge en Beadchip -.. Tilsett prøven på innløpsportene ^[12] Klikk her for å se større versjon image.

Figur 4 Fjerne Beadchip Coverseal -.. Ta tak i forseglingen på hjørnet og forsiktig skrelle diagonalt ^[12] Klikk her for å se større bilde .

Figur 5. Komplett Beadchip Gjennomstrømning Assembly - Den BeadChip er skilt fra en glass-slide med en spacer og bundet med klips.> Klikk her for å se større bilde.

Figur 6. Vellykket BeadChip Scan - A) BeadChip skannes med både en rød og grønn laser, skannerprogramvaren vises begge samtidig. Seksjoner passerer intensitet QC vil markere grønt på BeadChip displayet til venstre. Seksjoner sviktende intensitet QC vil markere rødt på BeadChip displayet. B) Når skanningen er fullført, vil programvaren overlappe de røde og grønne skjermer. En zoomet inn bilde vises. Fargen og intensiteten på hver enkelt perle indikerer allel stede. Klikk her for å se større bilde .

Figur 7. SNP NORM-R vs NORM-THETA Cluster Profiler - A) En gyldig SNP med tre distinkte klynger representerer AA, AB, og BB genotyper, farget rød, lilla og blå B) En SNP krever redigering.. Den midterste klynge, som bør være homozygot AB, er igjen un-heter. BB klyngen er feilaktig kalt AB. C) En dårlig ytelse SNP. Ingen genotyper kan fås fra denne intensiteten tomten, som ingen distinkte klynger eksisterer. Klikk her for å se større bilde .

Discussion

Storskala genotyping applikasjoner har blitt brukt til å bedre forstå den genetiske mekanismen bak mange menneskelige sykdommer. Oppdagelsen av noen betydelig variant gjennom et genom-wide forening analyse kan flagge en kandidat region for videre studier. I tillegg er genotype data et godt verktøy for kvalitetskontroll på sekvense prosjekter.

For å maksimere prøvekapasitet, kan flere prøveplater bli forsterket og lagret i deres fragmenterte, resuspendert stater. Åtte plater kan forsterkes på en enkelt dag, ved å kombinere de første 24 timer av protokollen for flere grupper, og som gir tilstrekkelig materiale for ~ 2-8 dager med chip-behandling. Hvis forsterkede plater ligger lagret på forhånd, og dersom nye prøver er hybridisert til chips umiddelbart etter skanning begynner på forrige løp, kan behandlingen kjøres kontinuerlig uten behov for å ta en pause for ytterligere prøveopparbeidelse. Derfor, skjønt prøver tar tre dager for å gjennomgå den kompanalysen, kan data genereres hver dag. Assuming24 chips behandles hver dag, gjør at en fem dagers arbeidsuke i over 1000 DNA-prøver som skal kjøres på en 12-sample perle chip. Hvis noen trinn eller reagens har sviktet, men kan flere partier være i faresonen for dårlig ytelse før en eventuell korreksjon kan brukes. Feil kan unnslippe varsel før arrays skannes eller analyseres, og derfor hvis gjennomstrømning er maksimert, hundrevis av prøver i ulike stadier av protokollen kanskje allerede har fått den samme defekte behandling etter oppdagelsen. Som tapte reagenser og data ikke kan gjenopprettes, må brukeren veie disse risikoene mot behovet for en akselerert arbeidsflyt.

Den GenomeStudio analyse programvare er den første sjansen til å virkelig måle suksessen av genotyping prosessen. Hvis Norm-R vs Norm-Theta intensitet tomter er riktig gruppert, bør den gjennomsnittlige samtalehastighet (prosent av total SNPs hell skrevet) av prøvene nærmer 99%, selv om denne verdien varierer SLIghtly avhengig rekke type. Dataene fra noen prøve med en samtalehastighet lavere enn 85-90% er ikke troverdig og skal kastes. For kvalitetskontroll, bør resultatene bli sammenlignet med noen tidligere kjente genotyper når det er mulig. Hvis ingen slike data foreligger, er tilsiktet prøve duplisering et nyttig verktøy i å verifisere plate eller array-plasseringer. Disse dupliserte parene bør plasseres på separate brikker, plater, partier, eller prosjekter, deres genotyper kontrollert ved generasjon. Mens spesifikke QC begrensninger varierer i henhold til etterforsker preferanser, er vanlige SNP begrensninger basert på utvalgets samtale suksess, Hardy-Weinberg likevekt, eller missingness mellom saker og kontroller, mens vanlige utvalgsbegrensninger er basert på ringeprisene, Mendels uoverensstemmelser, eller kryssreferanser av X-kromosom heterozygosity til kliniske kjønns data ^[13].

Hvis noen problemer oppstår, Kontroller Dashboard, som finnes i analysen suite, kan foreleggesselskapet for å fastslå årsaken. Disse kontrollene kan ofte begrense problemet til den mest sannsynlige trinn eller reagens svikt. Hvis noen SNPs av interesse er funnet gjennom en infinium genotyping eksperiment, bør deres intensitet tomter være dobbelt-sjekket inn GenomeStudio for clustering feil før videre forskningen er utført.

En mislykket infinium genotyping eksperiment skyldes sannsynligvis menneskelig behandlingsfeil eller dårlig kvalitet innspill DNA. Sample kvantifisering må være nøyaktig og presis. For best resultat, noen reagenser lagt til noen prøve eller chip må fravikes ved volum satt av protokollen. Pipetter må være riktig kalibrert. Reagenser bør ikke løpe etter utløp og skal ikke fryses på nytt tint, lagre for RA1 reagens. For å minimalisere eventuelle flekker og forlengelses feil, må det formamid / EDTA blanding fremstilles frisk hver måned. Alle -20 ° C reagenser skal oppbevares i manuell-avrime frysere bare. Alle labware brukes i staining, bør forlengelse, og vask deler av protokollen skylles grundig med vann og mild såpe umiddelbart ved stillstand. De fuktig reservoarene i hyb kammeret bør vaskes med et reagensrør børste og mildt vaskemiddel. De glassplater bør vaskes med 10% blekemiddel, som instruert av sine brukermanualer, en gang i uken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumable or Equipment	Manufacturer	Part Number	Minimum Required for 96 Samples
0.8 ml Deep Well Plate	Thermo Scientific	AB-0765	1
Plate Mats	Thermo Scientific	AB-0674	2
Reagent Basin	Fisher Scientific	13-681-502	9
Heat-seal Sheets	Thermo Scientific	AB-0559	1
Flow-through Spacer	Fisher Scientific	NC9563984	6
Pipette tips - 200 μl	Rainin	GP-L200F	192
Pipette tips - 10 μl	Rainin	GP-L10F	16
Pipette tips - 1,000 μl	Rainin	GP-L1000F	16
DNA Suspension Buffer	Teknova	T0220	0.5 ml
0.1 N NaOH	Fisher Scientific	AC12419-0010	0.5 ml
Isopropanol (HPLC grade)	Fisher Scientific	A451	15 ml
Ethanol (200-proof)	Sigma-Aldrich	459836	330 ml
Formamide (100%)	Thomas Scientific	C001K38	15 ml
EDTA (0.5 M)	Amresco	E177	0.2 ml
10 μl 8-channel Pipette	Rainin	L8-10XLS	1
200 μl 8-channel Pipette	Rainin	L8-200XLS	2
1,000 μl Single-channel Pipette	Rainin	L-1000XLS	1
Microplate Shaker	VWR	13500-890	1
Refrigerated Microplate Centrifuge	VWR	BK369434	1
Hybridization Oven	Illumina	SE-901-1001	1
Hybex Microsample Incubator	SciGene	1057-30-0	1
Hybex MIDI Heat Block Insert	Illumina	BD-60-601	1
Heat Sealer	Thermo Scientific	AB-0384	1
Hyb Chamber w/ Insert and Mat	Illumina	BD-60-402	2
Surgical Scissors	Fisher Scientific	13-804-20	1
Flow Through Assembly Parts	Illumina	WG-10-202	8
Wash Rack and Dish	Illumina	BD-60-450	1
Genepaint Chamber Rack	Tecan	760-800	1
Temperature Probe	Illumina	A1-99-109	1
Staining Rack and Dish	Illumina	WG-10-207	1
Self-Closing Tweezers	Ted Pella, Inc	5374-NM	1
Vacuum Manifold	Ted Pella, Inc	2240	1
iScan or HiScan	Illumina	-	1