Summary
Den ökande användningen av zebrafisk som en djurmodell kräver utveckling av effektiva metoder för leverans av kända mängder av föreningar och lösningar. Den sondmatning förfarande som beskrivs nedan medger oral tillförsel av exakta volymer av lösning pålitligt, säkert och effektivt för vuxna zebrafisk.
Abstract
Den zebrafisk har blivit en viktig in vivo-modell i den biomedicinska forskningen. Effektiva metoder måste utvecklas och utnyttjas för att leverera föreningar eller medel i lösningar för vetenskaplig forskning. Nuvarande metoder för att administrera föreningarna oralt till vuxna zebrafisk är felaktiga på grund av variationer i frivillig konsumtion av fisk. En sondmatning förfarande har utvecklats för att ge exakta mängder av smittämnen som zebrafisk för studier i biomedicinsk forskning. Vuxna zebrafisk över 6 månaders ålder sövdes med 150 mg / L av buffrad MS-222 och sondmatades med 5 pl lösning med slangar kateter implantation bifogas ett snitt 22-G nål spets. Den flexibla slangen sänktes in i den orala håligheten hos zebrafisk tills spetsen av slangen utskjuten förbi gälarna (cirka 1 cm). Lösningen injicerades sedan långsamt i tarmkanalen. Denna metod var effektiv 88% av tiden, med fisk återhämtar händelselöst. Dettaförfarandet är också effektiv som en person kan sondmatning 20-30 fisk i en timme. Denna metod kan användas för att exakt administrera medel för infektionssjukdomar studier eller studier av andra föreningar i vuxen zebrafisk.
Introduction
Nuvarande metoder för att administrera föreningarna oralt till zebrafisk inkluderar administrering föreningar toppbelagd på foder, blandas in i gelatin dieter 1, bioencapsulated in artemia 2, blandat med lipid inkapslade dieter 3, vax sprej pärlor 4 och via gluten-baserade dieter. 5 Begränsningar av dessa metoder för oral administration inkluderar höga urlakningshastigheter och ofullständig eller oförutsägbara förening konsumeras av fisk. Dessa variabler är problematiskt eftersom i infektionssjukdomar studier, i vetskap om smittsam dos administreras till fisken kan vara kritisk för studier framgång. Dessutom har tidigare arbete visat att vissa föreningar administreras i vattenbad orsaka toxisk skada som zebrafisk gälar innan de intestinala effekter som kan vara under utredning sker. 6
Sondmatning är en vanlig metod som används i andra försöksdjurart att administrera exakta kvantiteter av en produkt med akNown koncentration för studier i biomedicinsk och farmaceutisk forskning. Först nyligen har metoder för gavaging zebrafisk har beskrivits i litteraturen. En teknik som beskrivs är en två-person som använder en 24-G katetermantel ansluten till en 2-20 l pipett för att leverera 5 pl lösning. 7 Den beskrivna metoden hade en dödlighet på 8,7% och 39% på den första och andra rättegång, respektive, de flesta av dödligheten tillskrevs dräktiga honor. Den andra sondmatning beskrivna tekniken används trubbig spets sondmatning sprutor för att administrera 5 pl lösning till medakas (Oryzias latipes). Var 8 Information om dödligheten inte tillhandahålls och den exakta processen att utföra sondmatning beskrevs inte. Enligt den kanadensiska rådet om Animal Care och Laboratoriet Zebrafish, upp till 1% av fiskens kroppsvikt kan administreras via sondmatning. 9,10 Vårt mål var att utveckla en repeterbar, säker och effektiv metod för att leverera precisa volymer compounds oralt till vuxna zebrafisk av båda könen och i alla stadier. Detta förfarande skulle gälla för någon studie där noggrann oral dosering av en förening krävs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Förberedelse av bedövningslösningen
- Bered en lösning av 150 mg / L av MS-222 i systemet vatten antingen från en stamlösning eller från pulverform.
- Verifiera pH med användning av en pH-meter.
- Buffert med natriumbikarbonat behövs som tills pH är mellan 7-7,5.
- Förbered en tank med systemvattnet fri från MS-222 för fisken att återhämta sig i. Tiden för återhämtning är typiskt mindre än 1 min.
2. Förbereda sondmatning Apparatus
- Skär den klara 22-G implantation slang till lite mer än ungefärliga längden från munnen till tarmen glödlampan av fisken. Inledningsvis föreslår vi söva en fisk för varje ny grupp som används för att få den bästa uppskattningen av det som krävs längden.
- Skjut cut klara implantation slangen på ½-tums 22-G nål tills den är säker och det finns ingen risk för att lösgöra. Om en ½ 22-C nålen inte är tillgänglig, klippa en längre nål till mobilenroximately denna längd.
- När det är färdigt, bör katetern implantation slangen sträcka sig ca 1 cm från spetsen av nålen, eller kortare om fisken är mindre.
- Fäst 22 G-nål hubb till en 1-cc luerlok spruta.
Tre. Förberedelser för sondmatning
- Skär ett spår i en svamp med ett skalpellblad.
- Blötlägg svampen i systemet vatten fritt från MS-222.
- Placera fuktad svamp på en plan yta.
- Dra upp lämplig 5 pl lösning för sondmatning i 22-G kateter slang och en 1-cc spruta.
4. Anestesi och sondmatning
- Snabb fisk i minst 24 timmar före ingreppet.
- Placera fisken i MS-222-lösning tills den förlorar sin rätande reflex, och inte svarar på en stjärtfena nypa, men underhåller opercular rörelse. Detta tar typiskt ca 2-3 min.
- Ta ut fisken ur narkos lösningen och placera den ispåret i svampen med huvudet något utskjutande från svampen, men gälarna omfattas av svampen.
- Flytta svampen till ett vertikalt läge.
- Öppna zebrafisk mun med hjälp av 22-G kateterrör.
- Försiktigt in slangen tills spetsen är förbi gälarna (ca 1 cm eller längden på slangen). Den implantation slangen ska inte behöva tvingas. Motstånd antyder röret kan slå gill arch eller hjärta.
- Om det finns motstånd, försiktigt dra, flytta och försök igen.
- Injicera materialet långsamt.
- Medan du injicerar, se till att lösningen inte kommer ut via gälarna eller munnen.
- Ta ut fisken ur svampen och plats i returtanken.
- Återhämtning sker vanligtvis på mindre än 1 minut och anges med fisken simmar upprätt och upprätthålla jämvikt.
- Övervaka fiska uppstötningar som visas genom att visualisera fiska aktivt utvisa material från dess mun, eller ingen opercular rörelse.
- Fiskar kan sändas tillbaka till sina ordinarie tank när de har återhämtat sig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Båda könen av fisk, inklusive dräktiga honor framgångsrikt sondmatades (Figur 1). En lyckad procedur tar mindre än en minut utan vätska sett lämnar gälarna eller munnen. Slangen går lätt, utan våld, utan blod ses vid katetern avlägsnas. Proceduren är snabb och kräver ungefär 10 min till sondmatning 3-4 fisk, med ett genomsnitt på 30 till 45 sekunder per fisk.
Zebrafisk ska inte sondmatades med mer än 5 ìl av varje lösning. Sondmatning med 10 pl lösningar resulterade i endast en 50% framgång (Figur 2). Sondmatning av 10 pl var också helt tappat dräktiga honor. I denna studie, vägde den vuxna fisken i genomsnitt 0,2 g vardera. Använda CCAC rekommendation, skulle detta innebära att 4 pl lösning kan administreras till varje fisk. Den nuvarande användningen av 5 ^ skulle vara förenligt med dessa rekommendationer. Denna teknik hade ungefär en 10% mortality takt främst hänförliga till dräktiga honor som hittades döda nästa dag. Även denna dödligheten är betydligt lägre än andra rapporterade sondmatning tekniker, helst bör grovt dräktiga honor inte sondmatades om det är nödvändigt för studier.
Figur 1. Jämförelse av procent framgång mellan olika reproduktiva grupper med 5 pl lösning. The procent lyckas med alla kombinerade grupperna var 88%. Den procent framgång för dräktiga honor var 100%, för icke-dräktiga honor 90% och för män 82%.
Figur 2. Jämförelse av total procent framgång med 5 pl kontra 10 pl. Totalt procent framgång med 5 pl var 88%. Den totala procent framgång med hjälp av 10il var 50%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Signifikans
Denna teknik är en förbättring och ger flera fördelar över de två tidigare beskrivna tekniker för gavaging vuxna zebrafisk. Först tillåter användning av en svamp för att hålla tillbaka fisken en person att utföra proceduren, i motsats till en tidigare beskrivna tekniken kräver två personer. 7 det andra är kateter implantation slang mer flexibel än IV-katetrar, som kan hjälpa till att minimera sekundära trauma på grund till perforering på liknande sätt med hjälp av trubbig spets sprutor. 7,8 tredje, genom att använda en klar slang kan lösningen lätt visualiseras in fisken. Och slutligen, är det sondmatning apparaten stabilt så att den kan återanvändas snabbt och effektivt när många fiskar måste sondmatades. Den sondmatning teknik i allmänhet minskar variationen i förbrukningen och koncentration ses i andra metoder för oral administration av föreningen till zebrafisk, och som sådan kan också minska den mängd fisk som behövs för att perform ett experiment. 1-5
Kritiska steg
Det är också viktigt att fasta fisken i minst 24 tim sedan med en 12 hr snabbt inte alla zebrafisk har en tom intestinal glödlampa. Den 24 hr snabbt kommer att förhindra uppstötning och förlust av lösningen genom munnen och gälar grund av en delvis full tarmkanalen 13. Det vanligaste problemet är vätska utträder genom munnen eller gälarna, vilket indikerar att slangen inte var isatt ner tillräckligt långt i tarmkanalen. Vätska utträder via munnen eller gälar kan undvikas genom att observera den korrekta placeringen av röret samt att använda en slang med tillräcklig längd för att kringgå gälarna. Mer allvarliga komplikationer kan inkludera gill trauma, inre blödningar, intestinal perforation, uppstötningar och plötslig död. Dessa komplikationer kan eller inte kan observeras direkt. Vanligtvis inträffar plötslig död timmar efter det att förfarandet avslutats, medan fisken såg ingenrmal under initial återhämtning.
Svamparna blötlades i blekmedel och sedan i natriumtiosulfatlösning innan den kommer i kontakt med fisken. Detta avlägsnade några agenter eller kemikalier som kan ha varit skadliga för fisken. MS-222 stamlösning bör förvaras i en mörk behållare, borta från ljus och i upp till 5 dagar i kylskåp. Om en brunaktig färg observeras ska lösningen kasseras eftersom effekten reduceras. 11,12
Begränsningar
Detta protokoll kräver narkos av zebrafisk att säkerställa framgång. Detta kan vara till nackdel under vissa omständigheter då det anestetiska medlet kan ha en negativ effekt på de forskningsresultat som mäts. 12 För närvarande finns det ingen sondmatning protokoll för zebrafisk som inte kräver narkos. 7,8 Om MS-222 anestesi är känt för att påverka uppmätta variabler kan andra anestetika användas, eller en av de föregåendeiously nämnda metoder för frivilliga konsumtion metoder kan utnyttjas. 1-5
Denna teknik, som med tidigare beskrivna teknikerna är utmanande när det utförs på dräktiga honor. 7 En möjlig orsak till hög dödlighet i denna grupp kan vara intestinal perforation leder till sepsis grund tarmkanalen förskjuts av äggen i coelom. Likaså om äggen samt tarm är perforerade, då en akut ägg-associerad coelomitis kan också förekomma. Sådana händelser kan minimeras genom lek de dräktiga honorna innan gavaging. Alternativt kan en mindre gauge kateter kan användas för att utföra proceduren.
Om zebrafisk av en mindre storlek används försiktighet bör vidtas för att justera storleken på slangen och nålen så att diametern och längden kommer att passa in i deras mun och tarmkanal.
Effektiviteten i förfarandet kan ökas ytterligare om ett andra individuaJag skulle övervaka anestesi och säkerställa en konstant tillförsel av sövda fisk till individen utför sondmatning. Denna teknik är relativt lätt att behärska och inte kräver omfattande praxis att få kunskaper. Dessutom kräver förfarandet inte specialiserad utrustning eller anläggningar.
Felsökning
Om zebrafisk inte blir sövd inom 2-3 minuter, ändra bedövningslösningen eller använd en nygjord stamlösning. Om slangen inte glider lätt ner i tarmkanalen hos zebrafisk, bör mindre diameter slang användas. Det kan vara fördelaktigt att träna på att använda ett litet antal liknande storlek fisk för att säkerställa en korrekt diameter och slangens längd samt att utvärdera om den volym som getts är lämplig för zebrafisk storlek. Slangen kan även märkas att notera den perfekta penetreringsdjupet för fiskarnas storlek utnyttjas.
När denna teknik är behärskar, kan den användas för att leverera en exakt mängd av olika föreningar eller infektiösa agens till vuxna zebrafisk effektivt och konsekvent, vilket gör det användbart för olika forskningprotokoll. Denna teknik kan också minimera antalet fisk behövs för att utföra experiment och tillåta exakt tid mätningar av effekterna av olika föreningar på fisken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
The Rockefeller University Comparative Bioscience Center gav stöd för detta projekt. Vi tackar Janelle Monnas för tekniskt bistånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| A sponge | |||
| 1-cc luer lock syringe | Becton Dickinson Co | ||
| 22-G Micro-Renathane Implantation tubing (cut) | Braintree Scientific, Inc. | ||
| 1 22-G needle (cut, if needed) | Becton Dickinson Co | ||
| pH meter | Hanna probe | ||
| 1 scalpel blade | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| MS-222 (Finquel) | Argent Laboratories | ||
References
- Royes, J. -A. B., Chapman, F. Preparing Your Own Fish Feeds. , Department of Fisheries and Aquatic Sciences, Florida Cooperative Extension Service, Insitute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida. (2009).
- Gomez-Gil, B., Cabanillas-Ramos, J., Paez-Brambila, A., Roque, A. Standardization of the bioencapsulation of enrofloxacin and oxytetracycline in Artemia fransciscana Kellogg. Aquaculture. 196, 1-12 (1906).
- Langdon, C. Microparticle types for delivering nutrients to marine fish larvae. Aquaculture. 227, 259-275 (2003).
- Langdon, C., Nordgreen, A., Hawkyard, M., Hamre, K. Evaluation of wax spray beads for delivery of low-molecular weight, water soluble nutrients and antibiotics to Artemia. Aquaculture. 284, 151-158 (2008).
- Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A Novel Protocol for the Oral Administration of Test Chemicals to Adult Zebrafish. Zebrafish. 8, 203-210 (2011).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think Small: Zebrafish as a Model System of Human pathology. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , (2012).
- Tysnes, K. R., Jorgensen, A., Poppe, T., Midtlyng, P. J., Robertson, L. J. Preliminary expermients on use of zebrafish as a laboratory model for Giardia duodenalis infection. Acta Parasitologica. 57, 1-6 (2012).
- Marie, B., Huet, H., et al. Effects of a toxic cyanobacterial bloom (Planktothris agardhii) on fish: Insights from histopathological and quantitative proteomic assessments following the oral exposure of medaka fish (Oryzias latipes). Aquatic Toxicology. 114-115, 39-48 (2012).
- Canadian Council on Animal Care. CCAC guidelines on: the care and use of fish in research, teaching and testing. , CCAC. Ottawa, Ontario, Canada. (2005).
- Harper, C., Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish. , CRC Press. Boca Raton, Florida, USA. (2011).
- De Tolla, L. J., Srinivas, S., et al. Guidelines for the Care and Use of Fish in Research. ILAR Journal. 37 (4), (1995).
- Topic Popovic, N., Strunjak-Perovic, I., et al. Tricaine methane-sulfonate (MS-222) application in fish anaesthesia. Journal of Applied Ichthyology. 28, 553-564 (2012).
- Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish. Neurogastroenterology & Motility. 21, 304-312 (2009).
