Summary
Fare meme bezi sulu reaktiflerin non-invazif intraduktal teslimat için bir protokol tarif edilmektedir. Bu yöntem, özellikle meme kanalları hedef meme bezlerinin meme lokalize enjeksiyon yararlanır. Bu teknik, siRNA, kemoterapötik maddeler ve küçük moleküller de dahil olmak üzere çeşitli bileşikler için uyarlanabilir.
Abstract
Bu yazıda intraduktal enjeksiyon yoluyla fare meme bezinin çeşitli reaktifler teslim etmek için bir protokol açıklar. Lokalize ilaç verme ve knock-down meme epitel içinde genlerin nedeniyle bu tür gebelik ve emzirme gibi gelişim aşamaları bağımsız uygun hedefleme molekülünün eksikliği elde etmek zor olmuştur. Burada, farelerin meme intraduktal içine enjeksiyon ile erişkin herhangi bir aşamasında meme bezine reaktiflerin lokalize olarak verilmesi için kullanılan bir tekniği açıklar. Enjeksiyonlar anestezi altında, canlı farelerde gerçekleştirilen ve meme bezine bir non-invazif ve lokalize ilaç verilmesi için izin edilebilir. Ayrıca, enjeksiyon meme zarar vermeden birkaç ay boyunca tekrarlanabilir. Böyle Evans Blue gibi hayati boyalar tekniği öğrenmek için çok faydalıdır. Mavi boya intraduktal enjeksiyonu üzerine, bütün duktal ağaç gözle görünür hale gelir. Ayrıca, flüoresan etiketli reaktif maddeler de izin verirmeme bezinde görselleştirme ve dağıtım. Bu teknik, siRNA, kemoterapötik maddeler ve küçük moleküller de dahil olmak üzere çeşitli bileşikler için uyarlanabilir.
Introduction
Fare meme bezi meme merkezi bir kanal içine yakınsayan kompleks duktal-alveolar ağaç oluşmaktadır. Farelerde hem de insanlarda, göğüs tümörlerinin çoğunluğu süt kanallarını astar epitel hücrelerinde kökenlidir. Şu an mevcut tedaviler intravenöz kemoterapi, radyasyon ve cerrahi içerir. Lokalize intraduktal tedaviler 1-3 araştırdı ve düşük toksisite ve yan etkiler açısından önemli avantajlar sunuyoruz edilmiştir. Bu daha yaygın olarak uygulanabilir önce Ancak, çeşitli zorluklar kalır. Fare meme bezinde benzer işlemleri gerçekleştirmek için yeteneği intraduktal müdahalelerin karakterizasyonu kolaylaştırır. Burada doğrudan fare meme kanal içine reaktiflerin teslimat için non-invaziv bir yöntem mevcut.
Meme kanseri hastalarında ve fare modellerinde hem de kemoterapötik maddelerin intraduktal dağıtım daha önce hiçbir kanıt ile son derece etkili olduğu gösterilmiştirsistemik toksisite ya da uzun vadeli histopatolojik 3-6 değiştirir. Bundan başka, tümör hücre enjeksiyonu ve onkogenlerin lentiviral vector teslim önce intraduktal enjeksiyon 7-10 ile uygun olduğu gösterilmiştir.
İlaç vermek için ek olarak, bu prosedür, siRNA intraduktal enjeksiyon yoluyla meme bezi genlerin yerel susturulması için yararlıdır. SiRNA çözüm küçük hacimli enjeksiyon meme bezinin anatomisi ve fizyolojisini değiştirmeden etkilidir. Laboratuarımızda yakın zamanda kendiliğinden (Brock ve diğ., Yayınlanmamış), tümör ilerlemesinin önlenmesi ile sonuçlanan meme tümörleri geliştirmektedir transgenik farelerde önemli aracı genlerin başarılı susturulması göstermiştir. Biz hiçbir görünür doku hasarı veya toksisite ile 2 haftalık aralıklarla 7 kata kadar aynı meme içine iki haftada enjeksiyonları tekrarlamak mümkün olmuştur.
İntraduktal enjeksiyonları devel adresine bir yetişkin fare zamanlı olabilirgebelik, emzirme ve involüsyon sırasında ya da tümör gelişimi ve ilerlemesi sırasında sonraki aşamalarını hedef meme bezi gelişimi ile ilgili opmentally özgü olaylar. Yaşı 8 hafta gibi genç bakire kadın Laboratuvarımızda non-invaziv enjekte edilmiştir.
Protocol
1.. Enjeksiyon solüsyonunun hazırlanması
- Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ya da ilgili diğer bir sulu çözelti içinde% 0.2 Evans mavi boya hazırlayın. Bu vital boya intraduktal enjeksiyon başarısını değerlendirmek için yararlı olan ve tekniğin uzmanlığı geliştirirken bir görüntüleme aracı olarak önerilir.
Gerekli, enjekte edilecek hacmi bezlerinin sayısı ve konumu bağlıdır. Dişi farelere her 10 meme bezleri, enjekte edilebilir, ancak nedeniyle daha küçük boyuta bezi, bez çiftleri 1 ve 5, tipik olarak çözeltinin 10 ul enjekte edilir. Diğer tüm meme çiftleri 20 ul enjekte edilir. Bu birimler tüm duktal ağacı doldurmak için yeterlidir.
2. Ameliyat öncesi hazırlık
- Her bir farenin vücut ağırlığını kaydedin. Tüm klinik öncesi çalışmalarda olduğu gibi, hayvan ağırlıkları potansiyel toksisitesini değerlendirmek üzere (haftada iki kez ya da daha fazla) düzenli olarak izlenmelidir.
- M uyutmakizofluran odacığı kullanılarak ouse ve göz yağ uygulanır. İşlem sırasında fareler, bir burun konisiyle oksijen izofluran inhale% 2-4 konsantrasyon kullanılarak anestezi devam edecektir. Dikkatle buna izofluran seviyesini ayarlayarak, solunum hızında değişiklikler için fareyi izlemek.
- Deri altından önce analjezi gibi prosedüre meloksikam (5-10 mg / kg) enjekte edilir.
- Meme alan bir over-the-counter epilasyon kremi uygulayın. 5 dakika bekleyin ve hafifçe dairesel hareketlerle bir pamuk uçlu aplikatör ile gevşek saç kaldırmak. Ilık su ile ıslatılmış nemli bir kağıt havlu kullanarak krem çıkarın. Tıraş nedeniyle meme zarar verme riskine tavsiye edilmez.
- Yavaşça aşağı ekstremitelerde taping tarafından Stereoskop altında fareyi sabitleyin.
- Alkol bezlerden ile temiz enjeksiyon siteleri.
3. İntraduktal enjeksiyon
- Stereoskop altında enjekte edilmesi uygun meme bulun. Tuhaf mikro diseksiyon ince kullanınmeme açılmasını kapsayan herhangi bir ölü deri kaldırmak için zers.
- Sabitlenmiş bir 33 G iğne ile merkezi metal bir 50 ul şırınga içine yükleyin enjeksiyon solüsyonu 10-20 ul. Bazen, enjeksiyondan sonra, az miktarda (1 ul ya da daha az) iğne çekerek üzerine meme dışarı sızıntı olabilir. Bu nedenle, potansiyel kaybı hesaba katmak için sırasıyla 11 veya 21 ul enjekte etmek için tavsiye edilir.
- Ince cımbız ile hafifçe meme tutun ve enjeksiyon için konumlandırmak için hafifçe kaldırın. Bu meme kesmek için gerekli değildir.
- Hızla duktal lümen içindeki sıvıyı hareket nedeniyle potansiyel hasarı en aza indirmek için yavaş yavaş çözüm enjekte edilir. Enjeksiyon oranı, yaklaşık olarak 40 | il / dk 'da muhafaza edilmelidir.
4. Ameliyat Sonrası Bakım
- Enjeksiyon yerinde gözlemlemek. Meme bölge veya çevre dokuya travma izi yok olmalıdır. Meme çevresindeki bölgede şişlik olası bir meme yağ pedi enjeksiyonu rathe gösterirBaşarılı bir intraduktal enjeksiyon daha r.
- Burun konisi hayvan çıkarın ve kurtarma için ayrı bir kafeste taşımak. Hipotermi önlemek ve kurtarma yardımcı olmak için bir ısı lambası altında kafes yerleştirin. Fareler tek başına ev sahipliği ve onlar bilinci ve hareketlilik yeniden kadar yakından takip edilecektir.
5. Meme Bezi Doku Analizi
- Çalışmanın tamamlanmasından sonra, fareler bir izolasyon odası içinde CO2 sıkıştırılmış gaz, aşağıdaki servikal dislokasyon ile ötenazi vardır. Meme bezleri kesilir ve bütün montaj hazırlanması 11, histoloji, ya da RNA ve protein izolasyonu için kullanılabilmektedir.
Representative Results
Meme kolayca saç onu (Şekil 1A) çevreleyen alanda çıkarıldıktan sonra Stereomikroskopta lokalize edilebilir. Enjeksiyon tekniği ana, o Evans mavi boya enjekte ve bezin bütünlüğünü (Şekil 1B ve C) izlemek için tavsiye edilir. Bu yaklaşım, aynı zamanda bir görsel boya tüm duktal sistemi (Şekil 1 C ve 2A) ulaşır olup olmadığını değerlendirmek için her bir bezi içine enjekte edilecek uygun hacimleri belirlenmesine izin verir. Enjekte Evans mavi görüntü bir görüntü daha sonra tüm duktal ağaç Carmine alum boya (Şekil 2B) ile boyanmış olduğu bütün monte edilmiş meme bezi, karşılaştırılabilir.
Bu enjeksiyon yöntemi sağlamlığı operatör derece bağımlı olduğunu unutmayınız. Örneğin, kanal perfore bir meme yağ pedi enjeksiyonu neden olur ve çok hızlı bir çözüm enjekte duktal epitelyum cel zarar verebilirls ve enflamatuar tepkiye yol açar. Başarılı intraduktal enjeksiyon meme bezi ile lokal ilaç verilmesini sağlayan ve çoğu zaman, aksi görülen spesifik olmayan yan etkilerini azaltır.
Floresan enjekte bir bezinin bir örneği Şekil 3 'de resmi gösterilen siklofilin (esas teşkil etmeyen bir gen) siRNA hedef etiketlendi.
Şekil 1. Bir inguinal meme bezi Evans mavi boya ile meme yoluyla enjekte. 20 ul Evans mavi boya ile enjeksiyondan sonra enjeksiyon ve B öncesi meme A) Görünüm). Resim şişme ya da doku hasarı cildi açıldığında. ° C) görülmektedir, boya tüm meme duktal ağacının görselleştirme izin verir.
Şekil 2. Evans mavi-in analizi Tüm montajtâbi bezi. A) hayvana kesilip çıkarılır ve hemen sonra yağ kırmızı bir boya ile aynı bezinin enjeksiyonu. B) Tüm montaj boyandıktan sonra bir cam slayt üzerine yayılmış kesilmiş bezinin Örnek görüntü temizlenmişti. A) ile karşılaştırılması, enjekte edilen çözelti, meme duktal ağaç doldurur ve bez anatomik sağlam olduğunu doğrular.
Şekil 3,. Taze doku örneği floresan siRNA'nın Intradüktal teslim. Temsili görüntü, 48 saat enjeksiyondan çıkarıldı.
Discussion
Transgenik ve nakavt farenin göğüs kanserinde tek tek genlerin in vivo rolünü incelemek için çok değerli araçlardır. Bununla birlikte, pahalı ve zaman alıcı, bu hayvanlar oluşturmak için olan ve gen yok etme bazen meme bezi üzerinde bu genin özel etkileri fark bize önleyen bu genellikle yaygındır. Bu nedenle, hedef knockdown diğer organlarda spesifik olmayan yan etkiler ve toksisite sorunları giderecektir.
Burada sunulan siRNA intraduktal enjeksiyon fare meme bezi lokalize gen demonte sağlar. Bu teslimat siRNA ile sınırlı değildir meme bezi ile bir hedef ve lokalize ilaç verilmesi için hızlı bir yöntemdir. Bu gibi bir meme bezi özel ilaç verme diğer organlara spesifik olmayan yan etkiler ve toksisite önler ve meme bezi gelişimi ve göğüs tümör oluşumu sırasında belirli zaman noktalarında gen değişikliklerinin çalışma sağlar. Si hiçbir kanıt yokturOlmayan enjekte bezlerinde RNA parçacıklar, karaciğer ya da bu yöntem meme bezi lokalize gen demonte için tercih edilen bir yol sunar daha fazla kanıt temin etkilenebilir. Ayrıca, intraduktal enjeksiyon terapötik maddelerin uzun süreli izlenmesi için izin vermek için birkaç ay boyunca haftada bir veya iki haftada bir tekrarlanabilir.
Bu teknik, fare meme kanalları için çeşitli ajanların intraduktal teslim tahlil için olasılık açar. Iyi karakterize edilmiş fare modellerinde lokalize olarak verilmesi gelişmeler invazif olmayan uygulama hızlandırmak olmalıdır, insanlarda tedavi edici stratejiler hedef almıştır.
Disclosures
Yazarlar finansal açıklamaları var.
Acknowledgments
Yazarlar hayvanlar ile ona yardım için stabilize SiRNA çözüm ve Heather Tobin hazırlamak için Michael Goldberg teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma DEI DOD Yenilikçi Ödülü W81XWH-08-1-0659 tarafından finanse edildi. SK doktora sonrası eğitim Susan G Komen vakıf (KG101329) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar şematik hazırlanması için Kristin Johnson teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | 2-4% | ||
| meloxicam | 5-10 mg/ml | ||
| Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129-10G | 0.2% in PBS |
| hair removing cream | Veet | Choose sensitive option | |
| stereoscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| micro-dissecting tweezers | Roboz | rs-4976 | With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar |
| Hamilton syringe | Hamilton | 7637-01 | |
| 33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 4, 12 degree bevel (standard) |
| siGLO cyclophilin B control siRNA | Dharmacon | D-001610-01-05 |
References
- Dooley, W. C., et al. Ductal lavage for detection of cellular atypia in women at high risk for breast cancer. J Natl Cancer Inst. 93, 1624-1632 (2001).
- Jacobs, L., Sukumar, S., Stearns, V. Intraductal therapy for the prevention of breast cancer. Curr Opin Investig Drugs. 11, 646-652 (2011).
- King, B. L., Love, S. M. The intraductal approach to the breast: raison d'etre. Breast Cancer Res. 8, 206 (2006).
- Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Res. 66, 638-645 (2006).
- Stearns, V., et al. Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer. Sci Transl Med. 3, 106ra108 (2011).
- Flanagan, M., Love, S., Hwang, E. S. Status of Intraductal Therapy for Ductal Carcinoma in Situ. Curr Breast Cancer Rep. 2, 75-82 (2010).
- Nguyen, D. -A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. Methods in mammary gland biology and breast cancer research. Ip, M. M., Asch, B. B. , Kluwer Academic/ Plenum Publishers. 259-270 (2000).
- Behbod, F., et al. An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ. Breast Cancer Res. 11, R66 (2009).
- Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 401-404 (2009).
- Reddy, J. P., Li, Y. The RCAS-TVA system for introduction of oncogenes into selected somatic mammary epithelial cells in vivo. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 405-409 (2009).
- Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J. Vis. Exp. , e2828 (2011).
