Intraductal Injektion för Lokaliserad Drug Delivery till Mouse bröstkörtel

Summary

Ett protokoll för icke-invasiv intraductal leverans av vattenbaserade reagenser till musen bröstkörteln beskrivs. Metoden drar nytta av lokal injektion i bröstvårtorna av bröstkörtlarna riktade bröst kanaler specifikt. Denna teknik är anpassningsbar till en mångfald föreningar inkluderande siRNA, kemoterapeutiska medel och små molekyler.

Abstract

Häri beskriver vi ett protokoll för att leverera olika reagenser till musen bröstkörteln via intraductal injektioner. Lokaliserad drug delivery och knock-down av gener inom bröst epitel har varit svårt att uppnå på grund av brist på lämpliga målsökande molekyler som är oberoende av utvecklingsstadier som graviditet och amning. Häri beskriver vi en teknik för lokal leverans av reagens till bröstkörteln i något skede i vuxenlivet via intraductal injektion i bröstvårtorna av möss. Injektionerna kan utföras på levande möss, under anestesi, och möjliggöra en icke-invasiv och lokal läkemedelstillförsel till bröstkörteln. Dessutom kan injektioner upprepas under flera månader utan att skada nippeln. Vital färgämnen såsom Evans Blue är till stor hjälp för att lära sig tekniken. Upon intraductal injektion av det blåa färgämnet blir hela duktal träd synlig för ögat. Dessutom är fluorescent märkta reagens medger ocksåvisualisering och distribution inom bröstkörteln. Denna teknik är anpassningsbar till en mångfald föreningar inkluderande siRNA, kemoterapeutiska medel och små molekyler.

Introduction

Musen bröstkörteln är sammansatt av en komplex duktal-alveolära träd som konvergerar in i en central kanal vid nippeln. Hos möss och människor, de flesta brösttumörer har sitt ursprung i de epitelceller som kantar mjölkgångarna. Nuvarande tillgängliga behandlingar inkluderar intravenös cytostatika, strålning och kirurgi. Lokaliserad intraductal behandlingar har undersökts ^1-3 och erbjuder betydande fördelar i form av minskade effekter toxicitet och biverkningar. Men flera utmaningar kvarstår innan dessa kan tillämpas i större utsträckning. Förmågan att utföra liknande förfaranden i musen bröstkörteln underlättar karakteriseringen av intraductal interventioner. Här presenterar vi en icke-invasiv metod för tillförsel av reagens direkt i mus mammary kanalen.

Intraductal leverans av cytostatika i båda bröstcancerpatienter och musmodeller har tidigare visat sig vara mycket effektivt utan tecken påsystemisk toxicitet eller långvarig histopatologiska förändringar ^3-6. Vidare har tumörcellinjektion och lentivirusvektor leverans av onkogener tidigare visat sig vara genomförbara via intraductal injektion ^7-10.

Förutom läkemedelstillförsel, är detta förfarande användbart för lokal tysta av bröstkörtel gener genom intraductal injektion av siRNA. Injektion av små volymer av siRNA-lösning är effektiv utan att förändra anatomi och fysiologi av bröstkörteln. I vårt laboratorium har vi nyligen visat framgångsrikt tysta av viktiga förmedlar gener i transgena möss som spontant utvecklar brösttumörer som resulterar i att förhindra tumörprogression (Brock et al., Opublicerad). Vi har kunnat upprepa varannan vecka injektioner i samma bröstvårtor upp till 7 gånger i 2-veckors intervall med inga synliga skador vävnad eller toxicitet.

Intraductal injektioner kan travade en vuxen mus för att ta itu med utveckopmentally-specifika händelser relevanta för bröstkörtelutveckling under graviditet, amning och involution eller att rikta senare skeden under tumörutveckling och progression. Virgin kvinnor så unga som 8 veckors ålder har injicerats icke-invasivt i vårt laboratorium.

Protocol

1. Beredning av injektionslösning

1. Bered 0,2% Evans blått färgämne i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller annan vattenlösning av intresse. Denna vitala färgämnet är användbar för att bedöma framgången med intraductal injektioner och rekommenderas som ett visualiseringsstöd vid utveckling av expertis inom teknik.

Den volym som behövs kommer att bero på antalet och placeringen av de körtlar som skall injiceras. Alla 10 mjölkkörtlar hos honmöss kan injiceras men på grund av den mindre körtelstorlek, är körtelparen 1 och 5 typiskt injiceras med 10 ul av lösningen. Alla andra bröst par injiceras med 20 ul. Volymerna är tillräcklig för att fylla hela duktal trädet.

2. Preoperativ Framställning

1. Anteckna kroppsvikten hos varje mus. Som med alla prekliniska studier, bör djurvikter kontrolleras regelbundet (två gånger i veckan eller mer) för att utvärdera potentiella toxicitet.
2. Bedöva mOuse användning av en isofluran kammaren och tillämpa öga smörjmedel. Under förfarandet möss kommer att bedövas med hjälp av inhalerad 2-4% koncentration av isofluran i syre via en noskon. Noggrant övervaka musen för förändringar i andningsfrekvens, att justera nivån på isofluran därefter.
3. Injicera meloxikam (5-10 mg / kg) subkutant före proceduren såsom analgesi.
4. Applicera en over-the-counter hårborttagningskräm till bröstvårtan området. Vänta 5 min och försiktigt bort lösa hår med en bomulls-tip applikator med en cirkelrörelse. Ta bort krämen med hjälp av fuktiga pappershanddukar fuktade med varmt vatten. Rakning rekommenderas inte på grund av risken för skador på bröstvårtorna.
5. Säkra musen under stereoskop genom att försiktigt tejpa ner extremiteter.
6. Rengör injektionsställe för alkoholtorkar.

3. Intraductal injektion

1. Leta upp lämpliga nipplar som ska injiceras under stereoskop. Använd fina mikro-dissekera indiepopZers att ta bort alla döda hud som täcker bröstvårtan öppningen.
2. Belastning 10-20 pl av injektionslösning i en 50 ^ spruta med en 33 G metall nav nål fäst. Ibland, efter injektion, kan små mängder (1 ^ il eller mindre) läcker ut ur nippeln på att dra ut nålen. Därför rekommenderas det att injicera 11 eller 21 l respektive svara för den potentiella förlusten.
3. Håll i bröstvårtan försiktigt med fin pincett och lyft det en aning för att placera den för injektion. Det är inte nödvändigt att skära av nippeln.
4. Injicera lösningen långsamt för att minimera eventuella skador som orsakas av snabbt rörliga vätska i duktal lumen. Injektionshastigheten bör hållas vid cirka 40 | il / min.

4. Postoperativ vård

1. Beakta injektionsstället. Det bör inte finnas några tecken på trauma till nippeln region eller omgivande vävnad. Svullnad i området kring bröstvårtan sannolikt indikerar en juverfett pad injektion rather än en lyckad intraductal injektion.
2. Ta bort djuret från noskonen och flytta till en separat bur för återhämtning. Placera buren under en värmelampa för att förhindra hypotermi och bistå vid återhämtning. Möss hållas individuellt och kommer att övervakas noga tills de återfår medvetandet och rörlighet.

5. Analys av bröstkörtelvävnaden

1. Efter avslutad studie, möss avlivas genom halsdislokation efter _CO2 komprimerad gas i en isoleringskammare. Bröstkörtlarna skärs och kan användas för hela montera beredning ^11, histologi, eller RNA och protein isolering.

Representative Results

Nipplarna lätt kan lokaliseras med hjälp av ett stereomikroskop efter hår har tagits bort i området kring det (Figur 1A). Att bemästra den injektionsteknik, rekommenderas att injicera Evans blå färg och övervaka att körteln (figur 1B och C). Denna metod gör det också möjligt för bestämning av lämpliga volymer som ska injiceras i varje körtel som man kan visuellt bedöma om färgämnet når hela duktal systemet (figur 1C och 2A). En bild av det injicerade Evans blå bild kan sedan jämföras med hela monterade bröstkörteln, där hela duktal trädet färgas med Carmine alum färgämne (Figur 2B).

Observera att robustheten hos denna injektionsmetoden är i hög grad beroende på operatören. Till exempel kommer att perforera kanalen resultera i en bröstfettkudden injektionen och injicering av lösningen alltför snabbt kan skada ductal epithelial cells och provocera en inflammatorisk reaktion. Framgångsrika intraductal injektion möjliggör lokal läkemedelstillförsel till bröstkörteln och minskar ospecifika biverkningar ofta observerats i övrigt.

Ett exempel bild av en körtel injiceras med fluorescerande taggade siRNA riktar cyklofilin (en icke-essentiell gen) visas i figur 3.

Figur 1. Ett ljumsk mjölkkörtlarna injiceras genom bröstvårtan med Evans blå färg. A) Utseende av nippeln före injektion och B) efter injektion med 20 ^ il Evans blue färgämne. Ingen svullnad eller vävnadsskada observeras. C) När du öppnar huden, tillåter färgämnet visualisering av hela bröst duktal träd.

Figur 2. Hel-mount analys av Evans blue-inutsättas körtel. A) representant bild av en dissekerad körtel ut från djuret och sprids på en glasskiva direkt efter injektionen. B) Hela mount färgning av samma körtel med karmin färg efter fett hade rensats. Jämförelse med A) bekräftar att den injicerade lösningen fyller bröst duktal trädet och körteln är anatomiskt intakt.

Figur 3. Intraductal leverans av fluorescerande siRNA. Representant bild av färskt vävnadsprov, utskurna 48 timmar efter injektion.

Discussion

Transgena och knockout-möss är ovärderliga verktyg för att studera den roll in vivo av enskilda gener i bröstcancer. Men det är kostsamt och tidskrävande att generera dessa djur och genen knockdown är oftast allestädes närvarande som ibland hindrar oss från att erkänna de specifika effekterna av denna gen på bröstkörteln. Därför skulle en målinriktad knockdown lindra emissioner av icke-specifika biverkningar och toxicitet i andra organ.

Den intraductal injektion av siRNA presenteras här möjliggör lokaliserade genen knockdown i musen bröstkörteln. Det är en snabb metod för en målinriktad och lokal läkemedelstillförsel till bröstkörteln inte begränsat till siRNA delivery. En sådan bröstkörtelspecifik läkemedelstillförsel undviker ospecifika biverkningar och toxicitet till andra organ och tillåter studier av genförändringar vid specifika tidpunkter under bröstkörtelutveckling och brösttumörbildning. Det finns inga belägg för siRNA partiklar i icke-injicerade körtlar, lever eller andra organ som ger ytterligare belägg för att denna metod ger ett föredraget sätt för lokaliserad gen knockdown i bröstkörteln. Dessutom kan de intraductal injektionerna upprepas varje vecka eller varannan vecka under flera månader för att möjliggöra långtidsövervakning av läkemedel.

Denna teknik öppnar upp möjligheten för att analysera den intraductal leverans av olika reagenser till musen bröstkanalerna. Framsteg inom lokal leverans i väl karakteriserade musmodeller bör påskynda tillämpningen av icke-invasiv, riktade terapeutiska strategier hos människor.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
isoflurane			2-4%
meloxicam			5-10 mg/ml
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129-10G	0.2% in PBS
hair removing cream	Veet		Choose sensitive option
stereoscope	Zeiss	Stemi DV4
micro-dissecting tweezers	Roboz	rs-4976	With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar
Hamilton syringe	Hamilton	7637-01
33-gauge needle	Hamilton	7803-05	point style 4, 12 degree bevel (standard)
siGLO cyclophilin B control siRNA	Dharmacon	D-001610-01-05