Intraductal Injection for Lokalisert Drug Deli til musemelkekjertlene

Summary

En protokoll for den ikke-invasive intraductal levering av vandige reagenser til musemelkekjertlene er beskrevet. Metoden utnytter lokalisert injeksjon i brystvortene av melkekjertlene rettet mot melkegangene spesielt. Denne teknikken kan tilpasses for en rekke forbindelser inkludert siRNA, kjemoterapeutiske midler og små molekyler.

Abstract

Heri beskriver vi en protokoll for å levere ulike reagenser til musemelkekjertlene via intraductal injeksjoner. Lokalisert medikamentavgivelse, og knock-down av gener innenfor melkekjertelepitelet har vært vanskelig å oppnå på grunn av mangel på egnede målsøkende molekyler som er uavhengige av utviklingsstadier slik som graviditet og laktasjon. Heri, beskriver vi en teknikk for lokaliserte levering av reagenser til melkekjertlene på ethvert stadium i voksen alder via intraductal injeksjon i brystvortene av mus. Injeksjoner kan utføres på levende mus, under narkose, og gi rom for en non-invasiv og lokalisert levering av legemidler til melkekjertlene. Videre kan injeksjonene gjentas over flere måneder uten å skade brystvorten. Vital fargestoffer som for eksempel Evans Blå er svært nyttig for å lære teknikken. Ved intraductal injeksjon av det blå fargestoff, blir hele ductal treet synlig for øyet. Videre fluorescensmerkede reagenser også tillatevisualisering og distribusjon innenfor melkekjertlene. Denne teknikken kan tilpasses for en rekke forbindelser inkludert siRNA, kjemoterapeutiske midler, og små molekyler.

Introduction

The mouse mammary gland er sammensatt av en kompleks ductal-alveolar tre som konvergerer inn i en sentral kanal i nippelen. Hos mus så vel som mennesker, de fleste av brystsvulster oppstår i epitelceller lining melkekanalene. Dagens tilgjengelige behandlinger inkluderer intravenøs kjemoterapi, stråling og kirurgi. Lokaliserte intraductal behandlinger har blitt utforsket ^1-3 og gi betydelige fordeler i form av reduserte toksisitet og bivirkninger. Men flere utfordringer gjenstår før disse kan brukes mer allment. Evnen til å utføre tilsvarende prosedyrer i musen melkekjertlene forenkler karakterisering av intraductal intervensjoner. Her presenterer vi en ikke-invasiv metode for levering av reagenser direkte inn i musemelkekanalen.

Intraductal levering av kjemoterapeutika i begge brystkreftpasienter og musemodeller har tidligere vist seg å være svært effektiv med ingen bevis forsystemisk toksisitet eller langsiktig histopatologiske forandringer ^3-6. Videre har tumorcelle-injeksjon og lentiviral vektor levering av onkogener tidligere påvist å være mulig via intraductal injeksjon ^7-10.

I tillegg til levering av legemidler, er denne prosedyren nyttig for lokal stanse av brystkjerteltumorer gener gjennom intraductal injeksjon av siRNA. Injeksjon av små mengder siRNA løsningen er effektiv uten å endre anatomi og fysiologi av melkekjertlene. I vårt laboratorium har vi nylig vist seg vellykket stanse av nøkkel-mediator gener i transgene mus som spontant utvikler brysttumorer som resulterer i forhindring av tumorprogresjon (Brock et al. Upublisert). Vi har vært i stand til å gjenta annenhver uke injeksjoner i de samme brystvortene opp til syv ganger i 2-ukers intervaller uten synlige vevsskade eller toksisitet.

Intraductal injeksjoner kan være tidsbestemt i en voksen mus å ta utvikopmentally-spesifikke hendelser som er relevante for melkekjertlene utvikling under graviditet, amming, og involusjon eller å målrette senere stadier under tumor utvikling og progresjon. Virgin kvinner så unge som åtte ukers alder har blitt injisert non-invasiv i vårt laboratorium.

Protocol

En. Forberedelse av injeksjonsløsning

1. Forbered 0,2% Evans blått fargestoff i fosfatbufret saltvann (PBS) eller annet vandig oppløsning av interesse. Dette viktige fargestoff er nyttig for å vurdere hvor vellykket intraductal injeksjoner og anbefales som en visualisering hjelpemiddel ved utvikling av kompetanse i teknikken.

Volumet som kreves vil avhenge av antallet og plasseringen av de kjertler som skal injiseres. Alle 10 brystkjertlene til hunnmus kan injiseres, men på grunn av den mindre nippel størrelsen er kjertel parene 1 og 5 typisk injisert med 10 ul av oppløsning. Alle andre melke parene er injisert med 20 mL. Disse volumene er tilstrekkelig til å fylle hele ductal treet.

2. Preoperativ forberedelse

1. Ta opp kroppsvekt av hver mus. Som med alle prekliniske studier, bør dyre vekter overvåkes regelmessig (to ganger i uken eller mer) for å vurdere potensielle toksisitet.
2. Anesthetize mouse bruke en isofluran kammer og påfør øyen smøremiddel. Under prosedyren mus vil fortsette å bli bedøvet ved hjelp av inhalert 2-4% konsentrasjon av isofluran i oksygen via en nesekonus. Overvåke nøye musen for endringer i respirasjonsfrekvens, å justere nivået av isofluran deretter.
3. Injiser meloksikam (5-10 mg / kg) subkutant før prosedyren som analgesi.
4. Påfør en over-the-counter hårfjerning krem ​​til brystvorten området. Vent fem minutter og forsiktig fjerne løse hår med en bomulls-tip applikator med sirkelbevegelser. Fjern kremen med fuktige tørkepapir fuktet med varmt vann. Barbering er ikke anbefalt på grunn av risikoen for å skade brystvortene.
5. Fest musen under stereoskop ved forsiktig taping ned ekstremiteter.
6. Rengjør injeksjonssteder med spritservietter.

Tre. Intraductal injeksjon

1. Finn aktuelle brystvorter som skal injiseres under stereoskop. Bruk fin mikro-dissekere tweezers å fjerne død hud som dekker brystvorten åpning.
2. Laste 10-20 pl av injeksjonsløsningen i en 50 mL sprøyte med en 33 G nål festet metall knutepunkt. Noen ganger etter injeksjon, kan små mengder (1 mL eller mindre) lekke ut av nippelen ved å trekke ut nålen. Derfor anbefales det å injisere 11 eller 21 mL henholdsvis å redegjøre for det potensielle tapet.
3. Hold brystvorten forsiktig med de fine pinsett og løft den litt for å plassere den for injeksjon. Det er ikke nødvendig å skjære brystvorten.
4. Injiser oppløsningen sakte for å minimalisere potensiell skade forårsaket av hurtig bevegelige fluidum innenfor duktale lumen. Injeksjonshastigheten bør bli opprettholdt ved omtrent 40 pl / min.

4. Postoperativ Care

1. Observer injeksjonsstedet. Det bør ikke være noen tegn på traumer til brystvorten region eller omliggende vev. Hevelse i området rundt brystvorten sannsynlig indikerer et melkefettpute injeksjon Rather enn en vellykket intraductal injeksjon.
2. Ta dyret fra nesepartiet og flytte til et eget bur for å bli frisk. Plasser buret under en varmelampe for å hindre nedkjøling og bistå i utvinningen. Mus er plassert enkeltvis og vil bli overvåket nøye før de gjenvinne bevissthet og mobilitet.

5. Analyse av melkekjertlene

1. Ved fullførelse av undersøkelsen, blir musene avlivet ved cervikal dislokasjon etter _CO2 komprimert gass i et isolert kammer. Brystkjertlene blir skåret ut og kan benyttes for hele fjellet preparat ^11, histologi, eller RNA og protein isolert.

Representative Results

Brystvortene kan enkelt lokaliseres ved hjelp av en stereo når håret har blitt fjernet i området rundt det (figur 1A). Å mestre den injeksjonsteknikken, er det anbefalt å injisere Evans blått fargestoff og overvåke integriteten av kjertelen (Tall 1B og C). Denne fremgangsmåten gir også mulighet for bestemmelse av passende volumer til å bli injisert inn i hver gland som man kan visuelt vurdere om fargestoffet når hele ductal systemet (figurene 1C og 2A). Et bilde av den injiserte Evans blått bilde kan så bli sammenlignet med hele montert melkekjertlene, hvor hele ductal treet er farget med Carmine alun fargestoff (figur 2B).

Vær oppmerksom på at robustheten dette injeksjon metoden er svært avhengig av operatøren. For eksempel vil perforere røret resulterer i et melkefettpute-injeksjon, og injisering av oppløsningen for fort, kan skade ductal epithelial cells og provosere en inflammatorisk respons. Vellykket intraductal injeksjon gjør at lokaliserte levering av legemidler til melkekjertlene og reduserer uspesifikke bivirkninger ofte observert på annen måte.

Et eksempel bilde av en gland injisert med fluorescensmerket siRNA rettet cyclophilin (en ikke-essensiell genet) er vist i figur 3..

Figur 1. En lyskemelkekjertlene injiseres gjennom brystvorten med Evans blått fargestoff. A) Utseende av brystvorten før injeksjon og B) etter injeksjon med 20 mL Evans blått fargestoff. Ingen svelling eller vevsskade er observert. C) Ved åpning av hud, tillater at fargestoffet visualisering av hele melke ductal treet.

Figur 2. Hel-mount analyse av Evans blue-inVi anslår kjertel. A) Representant bilde av en dissekert kjertel fjernet fra dyret og spredt på et glass lysbilde umiddelbart etter injeksjon. B) Whole mount farging av samme kjertel med karmin fargestoff etter fett hadde blitt fjernet. Sammenligning med A) bekrefter at den injiserte løsning fyller melke ductal treet og kjertelen er anatomisk intakt.

Figur 3. Intraductal levering av fluorescerende siRNA. Representant bilde av fersk vevsprøve, fjernet 48 hr postinjection.

Discussion

Transgene og knockout mus er uvurderlige verktøy for å studere in vivo rollen individuelle gener i brystkreft. Det er imidlertid kostbart og tidkrevende å generere disse dyrene og genet knockdown er vanligvis allestedsnærværende, som av og til umulig å foreta oss å gjenkjenne den spesifikke virkninger av genet i melkekjertlene. Derfor ville en målrettet knockdown avhjelpe problemene med ikke-spesifikke bivirkninger og toksisitet i andre organer.

Den intraductal injeksjon av siRNA presenteres her gjør det lokaliserte genet knockdown i musen melkekjertlene. Dette er en hurtig metode for en målrettet og lokalisert levering av legemidler til melkekjertlene ikke begrenset til siRNA levering. En slik melkekjertlene-spesifikk levering av legemidler unngår uspesifikke bivirkninger og toksisitet til andre organer, og gjør det mulig for studiet av genet endringer ved bestemte tidspunkter i løpet av melkekjertlene utvikling og brysttumordannelse. Det er ingen tegn på siRNA partikler i ikke-injisert kjertler, lever eller andre organer som gir ytterligere bevis på at denne metoden presenterer en foretrukket metode for lokaliserte genet knockdown i melkekjertlene. Videre kan intraductal injeksjoner gjentas hver uke eller annenhver uke i løpet av flere måneder for å tillate langtidsovervåkning av terapeutiske midler.

Denne teknikken åpner opp muligheten for å analysere den intraductal leveranse av forskjellige reagenser til musemelkekanalene. Fremskritt i lokaliserte levering i godt karakterisert musemodeller bør akselerere bruken av ikke-invasiv, målrettede terapeutiske strategier hos mennesker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
isoflurane			2-4%
meloxicam			5-10 mg/ml
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129-10G	0.2% in PBS
hair removing cream	Veet		Choose sensitive option
stereoscope	Zeiss	Stemi DV4
micro-dissecting tweezers	Roboz	rs-4976	With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar
Hamilton syringe	Hamilton	7637-01
33-gauge needle	Hamilton	7803-05	point style 4, 12 degree bevel (standard)
siGLO cyclophilin B control siRNA	Dharmacon	D-001610-01-05