Dette notatet beskriver prosedyrene for taktil stimulering av rotteunger og påfølgende Golgi-Cox farging av neuronal morfologi. Tactile stimulering er en positiv opplevelse som administreres i perinatalperioden ved å stryke unger med en husholdning duster. Golgi-cox farging er en pålitelig prosedyre tillater visualisering av hele nerveceller.
For å generere mer langsiktige endringer i atferd, må opplevelsene være produsere stabile endringer i neuronal morfologi og synaptiske tilkobling. Tactile stimulering er en positiv tidlig erfaring som etterligner mors slikker og stell i rotte. Utsette rotteunger til denne positive opplevelsen kan gjennomføres enkelt og kostnadseffektivt ved hjelp av svært tilgjengelig materialer som en husholdning duster. Ved hjelp av en cross-kullet design, er valpene enten strøk eller venstre uforstyrret, for 15 minutter, tre ganger per dag gjennom hele perinatalperioden. For å måle de neuroplastic endringer knyttet til denne positive tidlig erfaring, er Golgi-Cox farging av hjernevev utnyttet. På grunn av det faktum at Golgi-Cox impregnering flekker et diskret antall nerveceller i stedet for alle cellene, farging av gnagerhjerne med Golgi-Cox løsningen tillater visualisering av hele neuronale elementer, inkludert cellekroppen, dendritter, aksoner og dendrittutløperne. Den fargingsprosedyre is gjennomført over flere dager, og krever at forskeren være oppmerksom på detaljer. Men når fargingen er fullført, hele hjernen har blitt impregnert og kan bevares på ubestemt tid for løpende analyse. Derfor er Golgi-Cox flekker en verdifull ressurs for å studere erfaring avhengig plastisitet.
Selv om det er mange rapporterte og benyttes teknikker for undersøkelse av negative tidlige erfaringer på hjernens modning, for eksempel perinatal stresset 1,2, sensorisk deprivasjon tre, og narkotika toksisitet 4, er det svært få metoder som benyttes for å undersøke effekten av positive opplevelser i denne tidsperioden. Bortsett fra miljøberikelse, er taktil stimulering en av få hjernen styrke behandlinger med demonstrert effekter fem. Tactile stimulering er en metode for sensorisk stimulering til huden som etterligner mors rotte atferd, slikker og grooming. Sin generelle aksept som en positiv manipulasjon oppstår fra studier som indikerer at taktil stimulering forbedret modning av premature barn og nyfødte rotter seks. I tillegg har forskning i Meaney laboratoriet 7 viste at høyere nivåer av mors slikker og grooming er knyttet til positive resultater i avkom. På grunn av these positive påvirkninger, taktil stimulering raskt utviklet seg til et avbøtende strategi som tar sikte på å redusere angst 8, bedre utfall assosiert med hjerneskade 9-11, og dempe narkotika allergi 12. Som sådan, er taktil stimulering en verdifull teknikk for å fremme positive tidlige erfaringer, med en bevist evne til dramatisk reorganisere neuronal morfologi og synaptiske tilkobling av utviklingen av hjernen.
For å undersøke og kvantifisere endringer i neuronal morfologi, er det nødvendig for å visualisere intakte neuroner. Golgi-Cox farging prosedyre er en modifikasjon av Camillo Golgi teknikk publisert i slutten av 1800-tallet som gir diskret farging av et lite antall av komplette nevroner 13. Selv om fremgangsmåten synes å flekke nevroner tilfeldig og reproduserbarhet blir vanligvis omtalt som store feil, den lille impregnerings sats tillatelser visualisering av hele neuronal element, inklusive cell organer, dendritter, dendrittutløperne og aksoner. Tilsvarende har den tiden som kreves for å impregnere et gitt hjernen med Golgi løsning også vært nevnt som en undergang. Imidlertid, gitt at når fargingen er fullført vev kan bevares på ubestemt tid, og tiden mellom perfusjon av hjernen og visualisering av neuroner med et mikroskop kan fullføres på mindre enn 21 dager er ikke urimelig tidsperioden. I tillegg, med mindre modifikasjoner i protokollen, Golgi-Cox flekker kan være effektivt brukes til å impregnere hjernen hos gnagere fra alle aldersgrupper. Som endringer på strukturelt nivå har vært knyttet til vedvarende endringer i atferds-og psykologiske funksjon, gir Golgi-Cox farging teknikk forskere med et verdifullt verktøy for å måle nevroplastisitet.
På grunn av den åpen plastisitet av utviklingen av hjernen, er det viktig at eksperimentelle prosedyrer som involverer tidligere erfaringer blir grundig gjennomgått, og det gjøres forsøk på å kontrollere for alle mellomliggende variabler. Av denne grunn er en tverr kull utforming som er anvendt i den taktile stimuleringsprosedyre for å sikre at unger får lignende erfaringer i alle andre områder av utvikling. I tillegg er det også viktig at flere pups fra flere kull blir valgt for analyse for å unngå muligheten for at virkningene skyldes en skjevhet i en enkelt pup eller kull.
Taktil stimulering er antatt å etterligne naturlig fore mors oppførsel, slikking og stell, som er antatt å være fordelaktig å utvikle avkom. Selv om tidligere forskning har lagt vekt på den første uken av livet (P0-P7) for å være en kritisk periode for slikking og stell 16, identifisert selve omfanget av endring etter 18 dager med TActile stimulering kan innebære at selv om sensitive ganger eksisterer, er overlegen lengre eksponering. Det er også viktig å merke seg at valpene får taktil stimulering i denne eksperimentelle paradigmet også oppleve slikker og stell av sine mødre, derav taktil stimulering er i tillegg til vanlig stimulering administreres av moren. Til slutt må man også være bevisste på regionens avhengige endringer. Selv om taktil stimulering under utvikling økt dendrittiske kompleksiteten i prefrontal cortex, betyr dette ikke garantere at strukturelle endringer av denne art vil være tydelig i alle områder av hjernen. Det er mulig at neuronal morfologi i andre områder av hjernen som parietal cortex, ville svare på en påfallende forskjellig måte til den samme opplevelsen. Men fordi den taktile stimuleringen måles enkelt administreres og utgjør ingen risiko for avkommet eller demninger, har det potensial til å fungere som et verdifullt verktøy for mange forskningsstudier for å bedre utviklingal utfall.
Med hensyn til Golgi-Cox farging av hjernevev, de kritiske trinn for vellykket visualisering av neuronale celler er som følger: 1) det må være tilstrekkelig perfusjon av hjernen med saltløsning. Feilaktig eller utilstrekkelig perfusjon av hjernen vev resulterer i blod fartøyet gjenstander som gjør det vanskelig å faktisk visualisere nerveceller gjennom labyrinten av blodårene, mens også kompliserer muligheten til å fotografere farget nevroner. 2) perfundert hjerner skal oppbevares i Golgi-Cox-løsning og sukrose-løsning i mørket. Lagring av hjernevevet i mørke reduserer bakgrunnsfarging av vev, igjen øker sjansen for suksess visualisere kvalitets neuronale celler. 3) Brain vev lagres i sukrose-løsning etter 14 dagers lagring i Golgi-Cox-løsning. Når vevet er neddykket i 30% sukrose-løsning i 2-5 dager, hjerner er mer ettergivende som hindrer knusing og rive av seksjonene nårskjæring. Det er viktig å hindre at hjernevev fra gjenværende i sukroseløsning for økte tidsperioder (mindre sukroseløsning blir kontinuerlig erstattet med frisk oppløsning), fordi lengre tids lagring i sukrose reduserer fargingskvalitet. 4) Til slutt, når lysbilder har blitt farget og dekselet gled, de bør gis tilstrekkelig tid til å tørke før visualisering med et mikroskop. Hvis lysbilder er ikke tillatt å tilstrekkelig lufttørke, kan vevet mørkere, redusere vellykket visualisering av kortikale nevroner.
Stabile endringer i psykologisk funksjon og adferdsmessige responser som forekommer som respons på erfaringer antas å lettes ved omorganisering av neuronal morfologi og synaptisk tilkobling 17.. Ettersom disse strukturelle endringer gi en målbar kilde til erfaring avhengig plastisitet, er bruken av en pålitelig fargingsprosedyre viktig. Dette vibratome basert Golgi-Cox flekker prosedyre gir pålitelig flekkening av fine grener og dendrittutløperne som kanskje ikke er tydelig med andre protokoller som celloidin-embedding. Den egenart av Golgi-Cox fremgangsmåte kommer av dens evne til bare å sette flekker på en liten brøkdel av neuronal elementer (1-10%), som tillater sporing av enkelt neuroner for lange avstander. Til tross for at bare en liten brøkdel av nevroner er impregnert med flekken, celler som gjengis synlig, vedlikeholde alle funksjoner, inkludert cellen kroppen, dendritter, dendrittutløperne og axons. Dessuten, når farging prosedyren utføres riktig, de fargede cellene skiller seg ut klart og tydelig mot en gjennomsiktig bakgrunn fordi andre kortikale strukturer forblir unstained og gjennomsiktig. På grunn av den erkjennelse at varige endringer i ytre funksjon må være relatert til plastisitet i nervesystemet, det vil si evnen til nerveceller til å endre sin struktur og tilkoblingsmuligheter, gir Golgi-Cox farging prosedyre forskere med etpålitelig teknikk for å visualisere og kvantifisere denne plastisitet.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet er finansiert av NSERC tilskudd til BK og RG. Forfatterne vil også takke Kehe Xie og Russell Hosain for deres Golgi-Cox flekker kompetanse.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
Permount | Fisher | Sp15 | |
Slides | VWR | 160004-365 | |
Coverslips | VWR | 062011-9 |