Dit artikel beschrijft de procedures voor de tactiele stimulatie van pups rat en de daaropvolgende Golgi-Cox kleuring van neuronale morfologie. Tactiele stimulatie is een positieve ervaring die wordt toegediend in de perinatale periode door strelen pups met een huishouden stofdoek. Golgi-cox kleuring is een betrouwbare procedure waardoor de visualisatie van hele neuronen.
Om op langere termijn veranderingen in gedrag te genereren, moeten ervaringen produceren stabiele veranderingen in neuronale morfologie en synaptische connectiviteit. Tactiele stimulatie is een positieve eerste ervaringen dat nabootst maternale likken en verzorgen bij de rat. Blootstellen van jonge ratten aan deze positieve ervaring kan gemakkelijk en kosteneffectief worden ingevuld met behulp van zeer toegankelijke materialen zoals een huishouden stofdoek. Met behulp van een cross-nest ontwerp, worden pups ofwel streelde of met rust gelaten, gedurende 15 minuten, drie keer per dag gedurende de perinatale periode. Om de plastische veranderingen met betrekking tot dit positieve vroege ervaring te meten, wordt Golgi-Cox kleuring van hersenweefsel benut. Vanwege het feit dat Golgi-Cox impregnatie vlekken een discreet aantal neuronen en niet alle cellen, kleuring van het knaagdier hersenen met Golgi-Cox oplossing maakt de visualisatie van totale neuronale elementen, waaronder het cellichaam, dendrieten, axonen, en dendritische stekels. De kleuringsprocedure is uitgevoerd over meerdere dagen en vereist dat de onderzoeker besteden veel aandacht aan detail. Echter, na kleuring is voltooid, de gehele hersenen is geïmpregneerd en kan onbeperkt worden bewaard voortdurende analyse. Daarom Golgi-Cox kleuring is een waardevolle bron voor het bestuderen van ervaring-afhankelijke plasticiteit.
Hoewel er veel gemeld en gebruikt technieken voor het onderzoek van negatieve vroege ervaringen op ontwikkeling van het brein, zoals perinatale spanning 1,2, sensorische deprivatie 3, en toxiciteit van geneesmiddelen 4, er zijn maar weinig methoden toegepast om de effecten van positieve ervaringen in onderzoeken deze periode. Afgezien van het milieu verrijking, tactiele stimulatie is een van de weinige hersenen verbeteren behandelingen met bewezen effecten 5. Tactiele stimulatie is een methode van sensorische stimulatie van de huid die het gedrag van de moeder rat nabootst, likken en verzorgen. De algemene acceptatie als een positieve manipulatie komt voort uit studies waaruit blijkt dat tactiele stimulatie betere rijping van premature baby's en pasgeboren ratten 6. Bovendien is onderzoek in het laboratorium Meaney 7 aangetoond dat hogere niveaus van maternale likken en verzorging zijn verbonden met positieve resultaten bij nakomelingen. Door tHese positieve invloeden, tactiele stimulatie snel uitgegroeid tot een corrigerende strategie gericht op het verminderen van angst 8, verbetering van de resultaten in verband met hersenletsel 9-11 en verzachtende drug sensibilisatie 12. Als zodanig, tactiele stimulatie is een waardevolle techniek voor de bevordering van positieve vroege ervaringen, met een bewezen vermogen om drastisch te reorganiseren neuronale morfologie en synaptische connectiviteit van de zich ontwikkelende hersenen.
Om te onderzoeken en kwantificeren veranderingen in neuronale morfologie, moet intacte neuronen te visualiseren. Het Golgi-Cox kleuring procedure is een modificatie techniek Camillo Golgi gepubliceerd in de late jaren 1800 die discrete kleuren van een klein aantal neuronen volledige 13 verschaft. Hoewel de procedure lijkt neuronen vlekken willekeurig en reproduceerbaarheid wordt vaak aangehaald als belangrijke tekortkoming, de kleine impregneren tarief vergunningen visualisatie van het gehele neuronale element, inclusief cell lichamen, dendrieten, vertakte stekels, en axonen. Ook de tijd die nodig is om een gegeven hersenen te impregneren met Golgi oplossing ook aangehaald als een nadeel. Echter, gezien het feit dat zodra kleuring is voltooid weefsel kan onbeperkt worden bewaard, en de tijd tussen perfusie van de hersenen en visualisatie van neuronen met een microscoop kan in minder dan 21 dagen worden afgerond, de tijd is niet onredelijk. Daarnaast, met kleine aanpassingen aan het protocol, Golgi-Cox kleuring effectief kan worden gebruikt om de hersenen van knaagdieren impregneren uit alle leeftijdscategorieën. Veranderingen op structureel niveau zijn gekoppeld aan aanhoudende aanpassingen aan gedrags-en psychisch functioneren, het Golgi-Cox kleuringstechniek biedt onderzoekers een waardevol instrument om neuroplasticiteit te meten.
Door de openlijke plasticiteit van de ontwikkelende hersenen, is het belangrijk dat experimentele procedures waarbij vroege ervaringen grondig beoordeeld en men tracht controleren voor alle tussenliggende variabelen. Daarom is een kruis draagstoelontwerp toegepast tijdens de tactiele stimulatieprocedure opdat pups vergelijkbare ervaringen krijgen in alle andere gebieden van ontwikkeling. Daarnaast is het ook belangrijk dat meerdere pups van meerdere nesten geselecteerd voor analyse naar de mogelijkheid dat gevolgen voortvloeien uit een voorspanning in een pup en strooisel voorkomen.
Tactiele stimulatie wordt beschouwd als de natuurlijk voorkomende moederlijk gedrag nabootsen, likken en verzorgen, die wordt verondersteld gunstig nakomelingen ontwikkeling. Hoewel eerder onderzoek heeft gewezen op de eerste week van het leven (P0-P7) aan een kritieke periode voor likken en verzorgen 16 zijn, de enorme omvang van de verandering geïdentificeerd na 18 dagen van tactile stimulatie kan betekenen dat hoewel voor gevoelige tijden bestaan, langere belichtingstijd is superieur. Het is ook belangrijk op te merken dat pups ontvangen tactiele stimulatie in deze experimentele paradigma ook last likken en verzorgen van hun moeders, vandaar de tactiele stimulatie naast de normale stimulatie door de moeder toegediend. Ten slotte moet men ook bewust van regio-afhankelijke veranderingen. Hoewel tactiele stimulatie tijdens de ontwikkeling toegenomen dendritische complexiteit in de prefrontale cortex, is dit geen garantie dat structurele veranderingen van deze aard zal blijken in alle gebieden van de hersenen. Het is mogelijk dat neuronale morfologie in andere hersengebieden zoals de pariëtale cortex, zou reageren in een opvallend verschillende wijze dezelfde ervaring. Echter, omdat de tactiele stimulatie procedure is eenvoudig te beheren en vormt geen risico voor de nakomelingen of dammen, het heeft het potentieel om te dienen als een waardevol instrument voor veel studies gericht op het verbeteren ontwikkelingal uitkomsten.
Wat Golgi-Cox kleuring van hersenweefsel, de kritische stappen voor een succesvolle visualisatie van neuronale cellen zijn als volgt: 1) dient voldoende perfusie van de hersenen met zoutoplossing zijn. Onjuiste of onvoldoende doorbloeding van het hersenweefsel leidt bloedvat artefacten die het moeilijk om daadwerkelijk visualiseren neuronale cellen door de doolhof van bloedvaten, terwijl ook complicerende de mogelijkheid om neuronen gekleurd fotograferen. 2) geperfuseerde hersenen moeten worden bewaard in Golgi-Cox-oplossing en sucrose-oplossing in het donker. Het opslaan van het hersenweefsel in het donker vermindert de achtergrond kleuring van het weefsel, opnieuw verhogen van de kans op kwaliteit neuronale cellen succesvol visualiseren. 3) Hersenweefsel wordt opgeslagen in sucrose-oplossing na de 14 dagen opslag in Golgi-Cox oplossing. Wanneer het weefsel wordt ondergedompeld in de 30% sucrose oplossing voor 2-5 dagen, hersenen zijn meer plooibaar die verbrijzelen en scheuren van secties voorkomt wanneersnijden. Het is belangrijk om te voorkomen hersenweefsel blijft in de sacharoseoplossing voor verhoogde tijdsperioden (tenzij de sacharoseoplossing continu vervangen door verse oplossing) omdat langdurige opslag in sucrose vermindert de kleurafgevend. 4) Ten slotte, wanneer dia's zijn gekleurd en deksel gleed, ze zou moeten krijgen voldoende tijd om te drogen voordat visualisatie met een microscoop. Als dia's niet zijn toegestaan om adequaat de lucht drogen, kan het weefsel donkerder, waardoor succesvolle visualisatie van corticale neuronen.
Stabiele veranderingen in het psychisch functioneren en gedragsmatige reacties die optreden als reactie op ervaringen worden verondersteld te worden vergemakkelijkt door de reorganisatie van neuronale morfologie en synaptische connectiviteit 17. Omdat deze structurele veranderingen bieden een meetbare bron voor ervaringsafhankelijke plasticiteit, het gebruik van een betrouwbare kleuring procedure belangrijk. Dit vibratome gebaseerd Golgi-Cox kleuringsprocedure biedt betrouwbare vleking van fijne takken en dendritische stekels die niet duidelijk kunnen zijn met andere protocollen zoals celloïdine-inbedding. Het onderscheidend vermogen van het Golgi-Cox procedure voort uit zijn vermogen om slechts vlekken een kleine fractie van neuronale elementen (1-10%), waarbij traceren enige neuronen mogelijk maakt voor lange afstanden. Ondanks het feit dat slechts een kleine fractie van neuronen worden geïmpregneerd met de vlek, cellen die zichtbaar zijn gemaakt, handhaven alle kenmerken zoals cellichaam, dendrieten, dendritische en axonen. Bovendien, wanneer de kleuring procedure correct wordt uitgevoerd, de gekleurde cellen opvallen helder en duidelijk tegen een transparante achtergrond, omdat andere corticale structuren blijven unstained en transparant. Door het besef dat blijvende veranderingen in buitenwaartse werking moet worden gerelateerd aan de plasticiteit van het zenuwstelsel, dat wil zeggen het vermogen van neuronen om hun structuur en connectiviteit wijzigen, het Golgi-Cox kleuring procedure voorziet onderzoekers metbetrouwbare techniek om te visualiseren en te kwantificeren deze plasticiteit.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk wordt gefinancierd door NSERC subsidies aan BK en RG. De auteurs willen ook graag Kehe Xie en Russell Hosain bedanken voor hun Golgi-Cox kleuring expertise.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
Permount | Fisher | Sp15 | |
Slides | VWR | 160004-365 | |
Coverslips | VWR | 062011-9 |