Detta dokument beskriver förfaranden för taktil stimulering av råttungar och efterföljande Golgi-Cox färgning av neuronal morfologi. Taktil stimulering är en positiv upplevelse som administreras under den perinatala perioden genom strök valpar med en hushållsdammtrasa. Golgi-cox färgning är en pålitlig procedur möjliggör visualisering av hela nervceller.
För att generera långsiktiga beteendeförändringar, måste erfarenheter att producera stabila förändringar i neuronal morfologi och synaptic anslutningar. Taktil stimulering är ett positivt tidiga erfarenheter som härmar maternal slickar och grooming i råtta. Exponera råttungar till denna positiva erfarenhet kan slutföras enkelt och kostnadseffektivt sätt med hjälp av mycket tillgängliga material såsom en hushållsdammvippa. Med hjälp av en cross-kullen designen är valpar antingen strök eller lämnas orörd, för 15 minuter, tre gånger per dag under hela den perinatala perioden. För att mäta de neuroplastic förändringar i samband med denna positiva tidiga erfarenheter, är Golgi-Cox färgning av hjärnvävnad används. På grund av det faktum att Golgi-Cox impregnering fläckar ett diskret antal neuroner snarare än alla de celler, färgning av gnagare hjärnan med Golgi-Cox lösning medger visualisering av hela neuronala element, inklusive cellkroppen, dendriterna, axoner, och Dendritutskotten. Färgningsförfarandet is genomförts under flera dagar och kräver att forskaren ägna stor uppmärksamhet på detaljer. Men när färgning är klar, hela hjärnan har impregnerats och kan bevaras i oändlighet för löpande analys. Därför är Golgi-Cox färgning en värdefull resurs för att studera erfarenheter beroende plasticitet.
Även om det finns många rapporterade och utnyttjade metoder för granskning av negativa tidiga erfarenheter på hjärnans mognad, såsom perinatal stressen 1,2, sensorisk deprivation 3, och läkemedelstoxicitet 4, det finns mycket få metoder som används för att undersöka effekterna av positiva upplevelser i denna tidsperiod. Bortsett från miljöberikning, är taktil stimulering en av ett fåtal hjärna förbättra behandlingar med påvisade effekter 5. Taktil stimulering är en metod för sensorisk stimulering på huden som efterliknar moderns rat beteende, slickar och grooming. Dess allmänna acceptans som en positiv manipulation uppkommer från studier som visar att taktil stimulering förbättrade mognaden av för tidigt födda barn och nyfödda råttor 6. Dessutom har forskning i Meaney laboratoriet 7 visade att högre nivåer av mödraslickande och grooming är kopplade till positiva resultat i avkomman. På grund av tessa positiva influenser, taktil stimulering snabbt utvecklats till en stödstrategi som syftar till att minska ångest 8, förbättra resultat i samband med hjärnskada 9-11, och dämpa drog sensibilisering 12. Som sådan, är taktil stimulering en värdefull teknik för att främja positiva tidiga erfarenheter, med en bevisad förmåga att dramatiskt omorganisera neuronal morfologi och synaptiska uppkoppling av den växande hjärnan.
För att undersöka och kvantifiera förändringar i neuronal morfologi, är det nödvändigt att visualisera intakta nervceller. Golgi-Cox färgningsförfarande är en modifikation av Camillo Golgi teknik som publicerades i slutet av 1800-talet som ger diskret färgning av ett litet antal kompletta nervceller 13. Även om förfarandet förefaller att färga nervceller på måfå och reproducerbarhet brukar framhållas som stor brist, den lilla impregneringshastighet tillåter visualisering av hela neuronala elementet, inklusive cella organ, dendriter, Dendritutskotten och axoner. På samma sätt har den tid som krävs för att impregnera en viss hjärna med Golgi-lösning också nämnts som en undergång. Men med tanke på att när färgningen är klar vävnad kan bevaras på obestämd tid, och tiden mellan perfusion av hjärnan och visualisering av nervceller med ett mikroskop kan genomföras på mindre än 21 dagar, är inte orimligt tidsperioden. Dessutom, med smärre ändringar i protokollet, Golgi-Cox färgning effektivt kan användas för att impregnera hjärnan hos gnagare från alla åldrar. Eftersom förändringar på strukturell nivå har varit kopplade till ihållande ändringar till beteende och psykologisk funktion, ger Golgi-Cox färgningsteknik forskare med ett värdefullt verktyg för att mäta neuroplasticitet.
På grund av det öppna plasticitet i den växande hjärnan, är det viktigt att experimentella förfaranden med tidiga erfarenheter är grundligt och försök görs för att kontrollera för alla mellanliggande variabler. Därför är ett kors kull konstruktion anställd under taktil stimulering förfarande för att se till att valparna får liknande erfarenheter i alla andra områden av utveckling. Dessutom är det också viktigt att multipla pups från flera kullar väljs för analys för att undvika möjligheten att effekter resulterar från en förspänning i en enda pup eller kull.
Taktil stimulering tros efterlikna naturligt förekommande moderns beteende, slickar och grooming, som är tänkt att vara till nytta för avkomma utveckling. Även tidigare forskning har betonat den första levnadsveckan (P0-P7) för att vara en kritisk period för att slicka och grooming 16, den stora omfattningen av förändring identifierades efter 18 dagar av TActile stimulering kan innebära att även känsliga tider finns, är längre exponering överlägsen. Det är också viktigt att notera att valpar som får taktil stimulering i denna experimentella paradigm upplever också slicka och grooming av sina mödrar, därav taktil stimulering är utöver normal stimulering administreras av mamman. Slutligen måste man också vara medveten om regionberoende förändringar. Även om taktil stimulering under utveckling ökade dendritiska komplexiteten i prefrontala cortex, innebär detta inte garantera att strukturella förändringar av detta slag kommer att vara tydlig i alla områden i hjärnan. Det är möjligt att neuronal morfologi i andra områden i hjärnan, såsom den parietala cortex, skulle reagera på ett påfallande annorlunda sätt att samma upplevelse. Men eftersom det taktil stimulering förfarandet är lätt att administrera och inte utgör någon risk för avkomman eller dammar, har den potential att fungera som ett värdefullt verktyg för många forskningsstudier för att förbättra utvecklingenal-resultat.
När det gäller Golgi-Cox färgning av hjärnvävnad, de kritiska stegen för lyckad visualisering av neuronala celler är följande: 1) Det måste finnas tillräcklig perfusion av hjärnan med koksaltlösning. Felaktig eller otillräcklig perfusion av hjärnvävnad leder till blodkärls artefakter som gör det svårt att faktiskt visualisera neuronala celler genom en labyrint av blodkärl, samtidigt som komplicerar möjligheten att fotografera färgade nervceller. 2) perfuserade hjärnor bör förvaras i Golgi-Cox-lösning och sackaros lösning i mörker. Förvaring av hjärnvävnad i mörker minskar bakgrundsfärgning av vävnaden, vilket återigen ökar chansen till framgångsrikt visualisera kvalitets neuronala celler. 3) Hjärnvävnad lagras i sackaros lösning efter 14 dagars lagring i Golgi-Cox-lösning. När vävnaden är nedsänkt i 30% sackaros lösning för 2-5 dagar, hjärnor är mer följsamma som förhindrar splittring och riva av delarna närskärning. Det är viktigt att förhindra hjärnvävnad från står i sackaroslösning för ökade tidsperioder (såvida sackaroslösningen kontinuerligt ersätts med färsk lösning) eftersom det vid långvarig lagring i sukros minskar färgningskvalitet. 4) Slutligen, när slides har målat och omslaget halkade, de bör ges tillräcklig tid att torka innan visualisering med ett mikroskop. Om glider inte tillåts att adekvat lufttorka, kan vävnaden mörkna, minska lyckad visualisering av kortikala neuroner.
Stabila förändringar i psykisk funktion och beteendemässiga reaktioner som uppstår till följd av upplevelser tros underlättas genom omorganisation av neuronal morfologi och synaptic anslutningar 17. Eftersom dessa strukturella förändringar ger en mätbar resurs för erfarenhet beroende plasticitet, är viktigt att använda en tillförlitlig färgningsförfarande. Denna vibratome baserade Golgi-Cox färgningsprocedur ger tillförlitlig fläckning av fina grenar och Dendritutskotten som kanske inte är uppenbara med andra protokoll såsom celloidin-inbäddning. Särskiljningsförmåga Golgi-Cox proceduren härrör från dess förmåga att bara färga en liten del av neuronala element (1-10%), vilket medger spårning av enstaka nervceller för långa avstånd. Trots att endast en liten del av nervceller är impregnerade med fläcken, celler som återges synligt, behålla alla funktioner, inklusive cellkroppen, dendriter, Dendritutskotten och axoner. Dessutom, när färgningsproceduren utförs korrekt, de färgade cellerna framträda klart och tydligt mot en transparent bakgrund eftersom andra kortikala strukturer förblir ofärgade och genomskinliga. På grund av insikten att ihållande förändringar i yttre funktion måste relateras till plasticitet i nervsystemet, det vill säga förmågan att nervceller att ändra sin struktur och anslutningsmöjligheter, ger Golgi-Cox färgningsförfarande forskare med entillförlitlig teknik för att visualisera och kvantifiera denna plasticitet.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansieras av NSERC bidrag till BK och RG. Författarna vill också tacka Kehe Xie och Russell Hosain för deras Golgi-Cox färgning expertis.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
Permount | Fisher | Sp15 | |
Slides | VWR | 160004-365 | |
Coverslips | VWR | 062011-9 |