Dieser Beitrag beschreibt die Verfahren für die taktile Stimulation von Rattenjungen und anschließende Golgi-Cox-Färbung der neuronalen Morphologie. Taktile Stimulation ist eine positive Erfahrung, die in der Perinatalperiode durch Streicheln Welpen mit einem Haushalts duster verwaltet wird. Golgi-Färbung cox ist ein zuverlässiges Verfahren ermöglicht die Visualisierung der gesamten Neuronen.
Um längerfristige Verhaltensänderungen zu erzeugen, muss Erfahrungen produzieren stabile neuronale Morphologie und synaptische Verbindungen. Taktile Stimulation ist eine positive Erfahrung, die frühen ahmt Müttern lecken und Pflege bei der Ratte. Offenlegen von Rattenjungen zu dieser positiven Erfahrung kann leicht und kostengünstig durch den Einsatz hoch zugänglichen Materialien, wie ein Hausstaubtuch abgeschlossen sein. Mit einem Kreuz-Wurf-Design, sind Jungtiere entweder strich oder ungestört, für 15 min, drei Mal pro Tag während der perinatalen Periode. Um die neuroplastische Veränderungen zu dieser positiven ersten Erfahrungen im Zusammenhang zu messen, wird Golgi-Cox-Färbung von Hirngewebe eingesetzt. Aufgrund der Tatsache, dass Golgi-Cox Imprägnieren färbt eine diskrete Anzahl von Neuronen und nicht alle der Zellen, Färbung von Nagetiergehirn mit Golgi-Cox-Lösung ermöglicht die Visualisierung der gesamten neuronalen Elemente, einschließlich der Zellkörper, Dendriten, Axonen, und dendritischen Dornen. Das Färbeverfahren is durchgeführt über mehrere Tage und erfordert, dass der Forscher achten auf Details. Sobald jedoch Färbung abgeschlossen ist, das gesamte Gehirn wurde imprägniert und kann unbegrenzt fortlaufenden Analyse konserviert werden. Daher ist Golgi-Cox-Färbung eine wertvolle Ressource für das Studium erfahrungsabhängige Plastizität.
Obwohl es viele gemeldet und genutzt Techniken für die Prüfung der negativen frühen Erfahrungen auf die Hirnreifung, wie perinatalen Stress 1,2, sensorische Deprivation 3 und Medikamententoxizität 4, gibt es eingesetzt, um die Auswirkungen der positiven Erfahrungen nur sehr wenige Methoden untersuchen diese Zeit. Abgesehen von ökologischen Bereicherung ist taktile Stimulation einer der wenigen Gehirn Verbesserung Behandlungen mit nachgewiesener Wirkung 5. Taktile Stimulation ist eine Methode der sensorischen Stimulation der Haut, die das mütterliche Verhalten nachahmt, Ratte, Lecken und Putzen. Die allgemeine Akzeptanz als eine positive Manipulation ergibt sich aus Studien, dass taktile Stimulation verbessert die Reifung von Früh-und Neugeborenen-Ratten 6. Darüber hinaus Forschung im Labor Meaney 7 hat gezeigt, dass höhere Mütter lecken und Pflege sind, um positive Ergebnisse bei den Nachkommen verbunden. Aufgrund tiese positive Einflüsse, taktile Stimulation rasch entwickelte sich zu einem Sanierungsstrategie zur Minderung der Angst 8, die Verbesserung der Ergebnisse mit Hirnverletzung 9-11 zugeordnet und Dämpfen Drogen Sensibilisierung 12 ausgerichtet. Als solches ist taktile Stimulation eine wertvolle Technik für die Förderung der positiven ersten Erfahrungen, mit einem bewährten Fähigkeit, dramatisch neu zu organisieren neuronale Morphologie und synaptische Konnektivität des sich entwickelnden Gehirns.
Um zu untersuchen und zu quantifizieren, Veränderungen in der neuronalen Morphologie, ist es notwendig, intakten Neuronen zu visualisieren. Der Golgi-Cox-Färbung Verfahren ist eine Modifikation von Camillo Golgi der Technik, die in den späten 1800er Jahren, die diskrete Färbung von einer kleinen Anzahl von Neuronen komplette 13 liefert. Obwohl das Verfahren scheint Neuronen zufällig und Reproduzierbarkeit wird allgemein als Hauptfehler, den kleinen Imprägnierungsrate ermöglicht die Visualisierung der gesamten neuronalen Elements, einschließlich ce genannten Fleckll Körper, Dendriten dendritischen Dornen, und Axone. Ebenso hat die erforderliche Zeit, um eine vorgegebene Gehirn mit Golgi-Lösung zu imprägnieren auch als Gang zitiert. Da jedoch einmal Färbung abgeschlossen Gewebe kann unbegrenzt aufbewahrt werden, und die Zeit zwischen der Durchblutung des Gehirns und Visualisierung von Neuronen mit einem Mikroskop kann in weniger als 21 Tagen durchgeführt werden, ist die Zeit nicht unvernünftig. Zusätzlich mit kleinen Änderungen zum Protokoll, Golgi-Cox-Färbung kann effektiv genutzt werden, um Gehirn von Nagetieren aus allen Altersgruppen zu imprägnieren. Da die Veränderungen auf der strukturellen Ebene haben, anhaltende Änderungen an Verhaltens-und psychologische Funktionieren gebracht worden, stellt der Golgi-Cox-Färbetechnik Forschern ein wertvolles Werkzeug, um Neuroplastizität messen.
Aufgrund der offenen Plastizität des sich entwickelnden Gehirns, ist es wichtig, dass die experimentellen Verfahren, die früheren Erfahrungen werden sorgfältig überprüft und wird versucht, für alle dazwischenliegenden Variablen zu steuern. Aus diesem Grund wird ein Quer Wurf-Design während der taktile Stimulation Verfahren eingesetzt, um sicherzustellen, dass Welpen erhalten ähnliche Erfahrungen in allen anderen Bereichen der Entwicklung. Darüber hinaus ist es auch wichtig, dass mehrere Jungtiere aus mehreren Würfen sind für die Analyse ausgewählt, um die Möglichkeit, dass Effekte resultieren aus einer Vorspannung in einem einzigen Wurf Welpen oder zu vermeiden.
Taktile Stimulation wird angenommen, dass die natürlich vorkommende mütterliche Verhalten nachahmen, Lecken und Putzen, die vermutlich von Vorteil für Nachkommen Entwicklung zu sein. Obwohl frühere Forschung hat betont, die erste Woche des Lebens (P0-P7), um eine kritische Periode für Lecken und Putzen 16 sein, nach 18 Tagen der ta die schiere Größe der Veränderung identifiziertctile Stimulation kann bedeuten, dass, obwohl sensiblen Zeiten gibt, ist längere Belichtungs überlegen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Jungtiere Empfangen taktile Stimulation in diesem experimentellen Paradigma erleben auch lecken und Pflege von ihren Müttern, damit die taktile Stimulation ist zusätzlich zu den normalen Stimulation durch die Mutter verabreicht. Schließlich muss man sich auch bewusst Region abhängige Änderungen. Obwohl taktile Stimulation während der Entwicklung erhöht dendritischen Komplexität im präfrontalen Kortex, bedeutet dies nicht garantieren, dass strukturelle Veränderungen dieser Art wird sich in allen Hirnregionen sein. Es ist möglich, dass neuronale Morphologie in anderen Hirnregionen wie dem parietalen Kortex, würde in einem auffallend andere Art und Weise auf die gleiche Erfahrung zu reagieren. , Weil die taktile Stimulation Verfahren ist leicht verwaltet und stellt keine Gefahr für den Nachwuchs oder Absetzbecken, die das Potenzial, als ein wertvolles Werkzeug für viele Forschungsstudien zur Verbesserung der Entwicklung zum Ziel zu dienen hat jedochal Ziele.
Bezüglich Golgi-Cox-Färbung von Hirngewebe sind die entscheidenden Schritte zur erfolgreichen Visualisierung von neuronalen Zellen, wie folgt: 1) Es muss eine ausreichende Durchblutung des Gehirns mit Kochsalzlösung sein. Falsche oder unzureichende Perfusion der Hirngewebe führt zu Blutgefäß-Artefakte, die es schwierig, tatsächlich neuronale Zellen sichtbar durch das Labyrinth der Blutgefäße, aber auch kompliziert die Fähigkeit, Neuronen zu fotografieren Malerei zu machen. 2) perfundierten Gehirn sollte in Golgi-Cox-Lösung und Saccharose-Lösung im Dunkeln gelagert werden. Speichern des Hirngewebe im Dunkeln reduziert die Hintergrundfärbung des Gewebes, was wiederum die Wahrscheinlichkeit des erfolgreichen Visualisierung Qualität neuronalen Zellen. 3) Das Hirngewebe ist in Saccharose-Lösung nach der 14 Tage Lagerung im Golgi-Cox-Lösung gespeichert. Wenn das Gewebe in 30% Saccharose-Lösung für 2-5 Tage eingetaucht, sind die Köpfe biegsamer bewegend und Reißen der Abschnitte verhindert, wennSchneiden. Es ist wichtig, Hirngewebe von der Saccharose-Lösung für eine erhöhte Zeitperioden verbleibenden verhindern (es sei denn, die Saccharoselösung kontinuierlich durch frische Lösung ersetzt), weil längerer Lagerung in Saccharose verringert die Qualität der Färbung. 4) Schließlich, sobald Folien wurden gebeizt und Abdeckung gerutscht, sollten sie genügend Zeit, um vor der Anzeige mit einem Mikroskop trocknen gegeben werden. Wenn Folien dürfen nicht ausreichend trockene Luft, kann das Gewebe zu verdunkeln, wodurch erfolgreiche Visualisierung von kortikalen Neuronen.
Stabile Änderungen in psychologische Funktion und Verhaltens-Reaktionen, die in Reaktion auf Erfahrungen auftreten, werden vermutlich durch Reorganisation neuronaler Morphologie und synaptischer Verbindungen 17 erleichtert werden. Da diese Strukturänderungen eine messbare Ressource für erfahrungsabhängige Plastizität, ist die Verwendung eines zuverlässigen Färbeverfahren wichtig. Diese Vibratoms basierend Golgi-Cox Färbeverfahren bietet zuverlässige Fleckening von feinen Ästen und dendritischen Dornen, die nicht offensichtlich sein, kann mit anderen Protokollen wie Celloidin-Einbettung. Die Besonderheit des Golgi-Cox-Verfahren beruht auf seiner Fähigkeit, nur einen kleinen Teil der neuronalen Elemente (1-10%), die Rückverfolgung einzelner Neuronen für große Entfernungen ermöglicht färben. Trotz der Tatsache, dass nur ein kleiner Bruchteil der Neuronen mit dem Farbstoff imprägniert, Zellen, sichtbar gemacht werden, halten alle Funktionen, einschließlich Zellkörper, Dendriten, Axonen und Dendriten. Wenn darüber hinaus das Färbungsverfahren korrekt durchgeführt wird, werden die gefärbten Zellen zeichnen sich klar und deutlich gegen einen transparenten Hintergrund, weil andere kortikalen Strukturen bleiben ungefärbt und transparent. Aufgrund der Erkenntnis, dass die anhaltende Veränderungen in der äußeren Funktionieren muß die Plastizität des Nervensystems, dh die Fähigkeit von Neuronen, ihre Struktur und Konnektivität zu ändern, stellt die Golgi-Cox Färbeverfahren Forscher mitzuverlässige Technik zu visualisieren und quantifizieren diese Plastizität.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird durch NSERC Zuschüsse an BK und RG finanziert. Die Autoren möchten auch Kehe Xie und Russell Hosain für ihre Golgi-Cox-Färbung Expertise danken.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
Permount | Fisher | Sp15 | |
Slides | VWR | 160004-365 | |
Coverslips | VWR | 062011-9 |