Este documento descreve os procedimentos para a estimulação tátil de filhotes de ratos e posterior coloração de Golgi-Cox da morfologia neuronal. A estimulação tátil é uma experiência positiva que é administrada no período perinatal por acariciar filhotes com um espanador doméstico. Coloração de Golgi-cox é um processo fiável que permite a visualização dos neurónios inteiras.
Para gerar mudanças de longo prazo no comportamento, experiências devem ser estáveis produzindo mudanças na morfologia neuronal e conectividade sináptica. A estimulação tátil é uma experiência inicial positiva que imita materna lambendo e aliciamento no rato. Expondo filhotes de ratos para esta experiência positiva pode ser concluída de forma fácil e econômica, utilizando materiais altamente acessíveis, tais como um espanador doméstico. Usando um projeto cross-ninhada, os filhotes são ou acariciou ou deixado em repouso, por 15 minutos, três vezes por dia durante o período perinatal. Para medir as mudanças de neuroplasticidade relacionados com esta experiência inicial positiva, é utilizado Golgi-Cox coloração do tecido cerebral. Devido ao facto de Golgi-Cox impregnação cora um número discreto de neurónios, em vez de todas as células, a coloração do cérebro de roedores com solução de Golgi-Cox permite a visualização de elementos neuronais inteiros, incluindo o corpo da célula, os dendritos, axónios e espinhas dendríticas. O procedimento i coloraçãos realizados ao longo de vários dias e exige que o pesquisador preste muita atenção aos detalhes. No entanto, uma vez que a coloração é concluído, a totalidade do cérebro foi impregnada e pode ser preservado indefinidamente para análise contínua. Portanto, a coloração de Golgi-Cox é um recurso valioso para o estudo de dependentes de experiência plasticidade.
Embora existam muitas técnicas relatadas e utilizados para a análise das primeiras experiências negativas na maturação do cérebro, como o stress perinatal 1,2, privação sensorial 3 e toxicidade de drogas 4, há muito poucas metodologias empregadas para examinar os efeitos de experiências positivas em este período de tempo. Além de enriquecimento ambiental, estimulação táctil é um dos poucos cérebro, melhorando os tratamentos com efeitos demonstrados 5. A estimulação tátil é um método de estimulação sensorial para a pele que imita o comportamento de ratos materna, lambendo e aliciamento. Sua aceitação geral como uma manipulação positiva surge a partir de estudos que indicam que a estimulação tátil melhorado maturação de recém-nascidos prematuros e ratos recém-nascidos 6. Além disso, a pesquisa no laboratório Meaney 7 demonstrou que os níveis mais elevados de lamber materna e aliciamento estão ligados a resultados positivos na prole. Devido a tinfluências positivas stas, estimulação tátil evoluiu rapidamente em uma estratégia de remediação que visa reduzir a ansiedade 8, melhorando os resultados associados com lesão cerebral 9-11, e atenuação de sensibilização da droga 12. Como tal, a estimulação tátil é uma técnica valiosa para a promoção de primeiras experiências positivas, com uma capacidade comprovada para reorganizar drasticamente morfologia neuronal e conectividade sináptica do cérebro em desenvolvimento.
De modo a examinar e quantificar as alterações na morfologia neuronal, é necessário visualizar os neurónios intactos. O procedimento de coloração de Golgi-Cox é uma modificação da técnica de Camillo Golgi publicado no final de 1800 que fornece coloração discreta de um pequeno número de neurônios completos 13. Embora o procedimento parece manchar os neurônios de forma aleatória e reprodutibilidade é comumente citado como grande falha, a visualização permite taxa de impregnação pequena de todo o elemento neuronal, incluindo cecorpos ll, dendritos, espinhas dendríticas e axônios. Da mesma forma, o tempo necessário para impregnar um dado cérebro com solução de Golgi, também tem sido citado como uma queda. No entanto, dado que uma vez que a coloração é tecido completo pode ser preservado indefinidamente, e o tempo entre a perfusão do cérebro e da visualização dos neurónios com um microscópio pode ser completado em menos de 21 dias, o período de tempo não é razoável. Além disso, com pequenas modificações no protocolo, a coloração de Golgi-Cox pode ser efetivamente usado para impregnar cérebros dos roedores de todas as faixas etárias. Como as mudanças no nível estrutural têm sido associados a modificações persistentes para funcionamento comportamental e psicológica, a técnica de coloração de Golgi-Cox fornece aos pesquisadores uma ferramenta valiosa para medir a neuroplasticidade.
Devido à plasticidade ostensiva do cérebro em desenvolvimento, é importante que os procedimentos experimentais envolvendo as primeiras experiências são analisadas e são feitas tentativas para controlar todas as variáveis intervenientes. Por este motivo, uma concepção cruzada maca é utilizada durante o procedimento de estimulação táctil ao garantir que os filhotes são recebem experiências similares em todos os outros domínios de desenvolvimento. Além disso, é também importante que os vários filhotes de ninhadas múltiplas são seleccionadas para análise a fim de evitar a possibilidade de que os efeitos resultar de um desvio num cão ou maca.
Estimulação táctil é acreditado para mimetizar o comportamento maternal que ocorre naturalmente, lamber e preparação, que se pensa ser benéfica para o desenvolvimento de descendência. Embora pesquisas anteriores tem enfatizado a primeira semana de vida (P0-P7) para ser um período crítico para lamber e aliciamento 16, a magnitude da mudança identificada de acordo com 18 dias de taestimulação ctile pode implicar que, apesar de existir momentos sensíveis, mais tempo de exposição é superior. Também é importante notar que os filhotes receberam estimulação táctil neste paradigma experimental também experimentar lambendo e preparação de suas mães, por conseguinte, a estimulação táctil é, para além da estimulação normal, administrados pela mãe. Finalmente, é preciso também estar ciente das mudanças depende de cada região. Embora a estimulação tátil durante o desenvolvimento do aumento da complexidade dendrítica no córtex pré-frontal, isso não garante que as mudanças estruturais desta natureza será evidente em todas as regiões do cérebro. É possível que a morfologia neuronal em outras regiões do cérebro tais como o córtex parietal, que respondem de uma maneira notavelmente diferente para a mesma experiência. No entanto, porque o procedimento de estimulação tátil é facilmente administrado e não representa qualquer risco para a prole ou barragens, que tem o potencial para servir como uma ferramenta valiosa para muitos estudos de investigação que visam melhorar o desenvolvimentoal resultados.
No que diz respeito ao Golgi-Cox coloração de tecidos do cérebro, os passos críticos para visualização bem-sucedida de células neuronais são como se segue: 1) não tem de ser adequada a perfusão do cérebro com uma solução salina. Perfusão inadequada ou insuficiente dos tecidos cerebrais resultados em artefatos dos vasos sanguíneos que o tornam difícil de realmente visualizar células neuronais através do labirinto de vasos sanguíneos, além de complicar a capacidade de fotografar neurônios manchadas. 2) cérebros perfundido deve ser armazenado em solução de Golgi-Cox e a solução de sacarose no escuro. Armazenar o tecido cerebral no escuro reduz a coloração do tecido base, mais uma vez aumentando a oportunidade de visualizar com sucesso células neuronais qualidade. 3) O tecido cerebral é armazenado em solução de sacarose a seguir a 14 dias de armazenamento em solução de Golgi-Cox. Quando o tecido é imerso na solução de sacarose a 30% durante 2-5 dias, os cérebros são mais flexíveis que impede quebra e rasgamento das secções quandocorte. É importante evitar que o tecido cerebral de que permanece na solução de sacarose, por períodos de tempo aumentados (a não ser que a solução de sacarose é continuamente substituída com solução fresca), porque o armazenamento prolongado em sacarose, reduz a qualidade da coloração. 4) Finalmente, uma vez que as lâminas foram manchadas e tampa deslizado, eles devem ser dado tempo suficiente para secar antes de visualização com um microscópio. Se os slides não são permitidas para o ar seco adequadamente, o tecido pode escurecer, reduzindo a visualização bem-sucedida de neurônios corticais.
Mudanças estáveis no funcionamento psicológico e respostas comportamentais que ocorrem em resposta a experiências são acreditados para ser facilitada pela reorganização da morfologia neuronal e conectividade sináptica 17. Como estas alterações estruturais proporcionar um recurso para mensurável dependente da experiência plasticidade, a utilização de um procedimento de coloração de confiança é importante. Procedimento de coloração de Golgi-Cox baseado Este vibratome fornece mancha confiáveling de galhos finos e espinhas dendríticas que podem não ser evidentes com outros protocolos como celoidina-incorporação. A peculiaridade do processo de Golgi-Cox decorre de sua capacidade de manchar apenas uma pequena fração dos elementos neuronais (1-10%), o que permite o rastreamento de neurônios individuais para longas distâncias. Apesar do fato de que apenas uma pequena fração dos neurônios são impregnadas com a mancha, as células que são processados visível, manter todos os recursos, incluindo corpo celular, dendritos, espinhas dendríticas e axônios. Além disso, quando o procedimento de coloração é realizado corretamente, as células marcadas destacam-se claramente e distintamente contra um fundo transparente, porque outras estruturas corticais permanecem unstained e transparente. Devido à constatação de que alterações persistentes no funcionamento exterior deve estar relacionada com a plasticidade do sistema nervoso, ou seja, a capacidade dos neurônios para modificar sua estrutura e conectividade, o procedimento de coloração de Golgi-Cox fornece aos pesquisadores umatécnica confiável para visualizar e quantificar essa plasticidade.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho é financiado por doações NSERC para BK e RG. Os autores também gostariam de agradecer Kehe Xie e Russell Hosain por seus conhecimentos coloração Golgi-Cox.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
Permount | Fisher | Sp15 | |
Slides | VWR | 160004-365 | |
Coverslips | VWR | 062011-9 |