Эта статья описывает процедуры для тактильной стимуляции крысят и последующего Гольджи-Кокса окрашивания нейронов морфологии. Тактильная стимуляция положительный опыт, который вводят в перинатальном периоде поглаживая щенков с бытовыми тряпкой. Окрашивание Гольджи-Кокса является надежным процедура выдачи разрешений визуализацию целых нейронов.
Для создания долгосрочных изменений в поведении, опыт должен быть получения устойчивых изменений в нейронной морфологии и синаптической связи. Тактильная стимуляция является положительным ранний опыт, который имитирует материнской лизать и уход на крысах. Разоблачение крысят в этот положительный опыт может быть завершена легко и экономически эффективно с помощью высоко доступные материалы, такие как домашнее тряпкой. Использование перекрестный дизайн мусора, щенки либо погладил или не трогать, в течение 15 мин, три раза в день в течение всего перинатального периода. Для измерения neuroplastic изменения, связанные с этой позитивной раннего опыта, Гольджи-Кокса окрашивание ткани мозга используется. Благодаря тому, что Гольджи-Кокса пропитка окрашивает дискретный количество нейронов, а не все клетки, окрашивание мозге грызунов с раствором Гольджи-Кокса позволяет визуализировать целых нейронных элементов, включая теле клетки, дендриты, аксоны и дендритных шипиков. Процедура я окрашиваниес осуществляется в течение нескольких дней и требует, чтобы исследователь обратить пристальное внимание к деталям. Однако, как только окрашивание завершена, весь мозг был пропитан и может быть сохранена на неопределенный срок для текущего анализа. Поэтому окрашивание Гольджи-Кокса является ценным ресурсом для изучения опыта зависит от пластичности.
Хотя есть много сообщалось и используемые методы для рассмотрения отрицательных раннего опыта на созревание мозга, таких как перинатальный стресс 1,2, сенсорной депривации 3 и наркотиков токсичности 4, существует очень мало методик, применяемых для изучения влияния положительного опыта в период это время. Помимо обогащения среды, тактильная стимуляция является одним из нескольких мозга увеличивая процедуры с продемонстрировали эффекты 5. Тактильная стимуляция является методом сенсорной стимуляции к коже, который имитирует материнское поведение крыс, облизывая и холить. Его общее признание в качестве положительного манипуляции возникает из исследований, указывающих, что тактильная стимуляция улучшилось созревание недоношенных детей и новорожденных крыс 6. Кроме того, исследования в лаборатории Meaney 7 показал, что более высокие уровни материнской лизать и ухода связаны с положительными результатами в потомстве. Благодаря тHESE положительное влияние, тактильная стимуляция быстро превратилась в процессуальной стратегии, направленной на снижение тревожности 8, улучшения результатов, связанных с черепно-мозговой травмой 9-11, и снижение уровня наркотиков раздражение 12. Таким образом, тактильная стимуляция является ценным методом для популяризации позитивных раннего опыта, с проверенной способностью резко реорганизации нейронов морфологию и синаптическую связь развивающегося мозга.
С целью изучения и количественного изменения в нейронной морфологии, необходимо визуализировать неповрежденные нейроны. Процедура окрашивания Гольджи-Кокса является модификацией методики Камилло Гольджи, опубликованной в конце 1800-х, которая обеспечивает дискретную окрашивание небольшого числа полных нейронов 13. Хотя процедура, кажется, пятно нейроны наугад и воспроизводимость обычно приводится в качестве большой недостаток, визуализации разрешений небольшой скорости пропитка всей нейронной элемента, в том числе сеLL органы, дендриты, дендритных шипиков, и аксоны. Аналогичным образом, время, необходимое для пропитки данную мозг раствором Гольджи также приводится в качестве падению. Однако, учитывая, что как только окрашивание завершения ткани могут быть сохранены на неопределенный срок, а время между перфузии головного мозга и визуализации нейронов с помощью микроскопа может быть завершена менее чем за 21 дней, период времени не является необоснованным. Кроме того, с незначительными изменениями в протоколе, окрашивание Гольджи-Кокса может быть эффективно использован для пропитки мозги грызунов из всех возрастных диапазонах. Как изменения на структурном уровне были связаны с стойких изменений в поведенческих и психологического функционирования, техника окрашивания Гольджи-Кокса предоставляет исследователям ценный инструмент для измерения нейропластичность.
В связи с явной пластичности развивающегося мозга, важно, что экспериментальные процедуры, связанные ранние переживания тщательно рассмотрены и делаются попытки контролировать для всех промежуточных переменных. По этой причине конструкции с поперечными помет используется в течение тактильной стимуляции процедуры для того, чтобы щенки получают аналогичный опыт во всех других областях развития. Кроме того, важно также, что несколько щенков из нескольких пометов выбираются для анализа, чтобы избежать возможности того, что эффекты возникнуть в результате уклоном в одном щенка или подстилки.
Тактильная стимуляция, как полагают, чтобы имитировать естественные материнское поведение, облизывая и холить, которые, как полагают, быть полезным для развития потомства. Хотя предыдущие исследования подчеркнул первую неделю жизни (P0-P7), чтобы быть критическим периодом для облизывая и уход 16, сами масштабы изменения выявлены следующие 18 дней таctile стимуляция может означать, что, хотя существуют чувствительные раз, больше воздействие превосходит. Важно также отметить, что щенки, получающие тактильных ощущений в этой экспериментальной парадигмы также испытывают лизать и холить их матерями, следовательно, тактильная стимуляция в дополнение к обычной стимуляции ведении матери. Наконец, нужно также иметь представление о регионе зависит от изменений. Хотя тактильная стимуляция во время разработки увеличились дендритных сложность в префронтальной коре, это не гарантирует, что структурные изменения такого характера будет видно во всех областях мозга. Вполне возможно, что морфология нейронов в других областях мозга, таких как теменной коре, будет реагировать в поразительно различным образом в том же опыте. Однако, поскольку тактильные процедура стимуляции легко управляется и не представляет риска для потомства или плотин, у него есть потенциал, чтобы служить в качестве ценного инструмента для многих научных исследований, направленных на улучшение развитияаль результатов.
В отношении Гольджи-Кокса окрашивания ткани головного мозга, критические шаги для успешного визуализации нервных клеток являются: 1) должно быть достаточно перфузии головного мозга с физиологическим раствором. Неправильное или недостаточное кровоснабжение результатов ткани головного мозга в артефактов кровеносных сосудов, которые делают его трудно на самом деле визуализировать нервных клеток через лабиринт кровеносных сосудов, в то же время усложняет возможность сфотографировать окрашенных нейронов. 2) перфузии мозг следует хранить в растворе Гольджи-Кокса и раствора сахарозы в темноте. Хранение ткани мозга в темноте снижает фоновый окрашивание ткани, снова увеличивая шанс успешно визуализации нервных клеток качества. 3) Мозговая ткань сохраняется в растворе сахарозы после 14-дневного хранения в растворе Гольджи-Кокса. Когда ткань погружают в 30% раствор сахарозы в течение 2-5 дней, мозг более податливыми, который предотвращает разрыв и разрушая секций когдарезка. Важно, чтобы предотвратить мозговую ткань из оставшихся в растворе сахарозы для увеличенных периодов времени (если раствор сахарозы не непрерывно заменен свежим раствором), потому что длительное хранение в сахарозы снижает качество окрашивания. 4) Наконец, когда слайды были запятнанным и крышка поскользнулся, им должно быть предоставлено достаточно времени, чтобы высохнуть, прежде чем визуализации с помощью микроскопа. Если слайды не разрешается адекватно высохнуть на воздухе, ткань может темнеть, уменьшая успешной визуализации корковых нейронов.
Стабильные изменения в психической деятельности и поведенческих реакций, которые происходят в ответ на опыте, как считается, способствует реорганизации нейронной морфологии и синаптической связи 17. Поскольку эти структурные изменения обеспечить измеримую ресурс для опыта в зависимости от пластичности, использование надежной процедуры окрашивания имеет важное значение. Это Vibratome основе Гольджи-Кокса процедура окрашивания обеспечивает надежную пятноIng мелких ветвей и дендритных шипиков, которые могут не видно с другими протоколами, такими как целлоидин-вложения. Своеобразие процедуры Гольджи-Кокса проистекает из его способности только окрашивать малую часть нейронных элементов (1-10%), что позволяет отслеживание отдельных нейронов на большие расстояния. Несмотря на то, что только небольшая часть нейронов, пропитанной пятно, клетки, которые сделаны различимыми, а поддерживать все функции, включая тела клетки, дендритов, дендритных шипиков и аксонов. Более того, когда процедура окрашивания проводится правильно, окрашенные клетки выделяются ясно и отчетливо на прозрачном фоне, потому что другие корковые структуры остаются запятнаны и прозрачным. Вследствие реализации, что стойкие изменения в внешней функционирования должны быть связаны с пластичности нервной системы, то есть способности нейронов, чтобы изменить их структуру и связи, процедура окрашивания Гольджи-Кокса предоставляет исследователямнадежная техника для визуализации и количественной оценки этого пластичность.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансируется NSERC грантов BK и RG. Авторы также хотели бы поблагодарить Kehe Се и Рассел Hosain за их опыт окрашивания Гольджи-Кокса.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Potassium Dichromate | Fisher | P188 | |
Mercuric Chloride | Fisher | M1561 | |
Potassium Chromate | Fisher | P220 | |
Ammonium Hydroxide | Fisher | A669-500 | |
Kodak Rapid Fix | Vistek | Kodak 146 4016 | |
EtOH-95 & Anhydrous | Commercial Alcohols | No Cat Numbers | All other Et-OH are dilutions |
Swiffers- Soft Feather-Like dusters | Safeway | Can be found at most grocery stores | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S-9378 | |
HemoDe | Electron Microscopy Sciences | 23410 | |
Permount | Fisher | Sp15 | |
Slides | VWR | 160004-365 | |
Coverslips | VWR | 062011-9 |