Summary
वसा ऊतकों (एटी) तीव्र प्रतिरक्षा सेल सक्रियण और बातचीत का एक साइट है. प्रतिरक्षा प्रणाली की लगभग सभी कोशिकाओं में मौजूद हैं और उनके अनुपात मोटापे से बदल रहे हैं. प्रतिरक्षा सेल आबादी एटी के समुचित अलगाव, मात्रा का ठहराव, और लक्षण वर्णन immunometabolic रोग में उनकी भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं.
Abstract
मोटे rodents और मानव की वसा ऊतकों में वृद्धि हुई बृहतभक्षककोशिका घुसपैठ (एटी) की खोज की स्थानीय और प्रणालीगत इंसुलिन प्रतिरोध करने के लिए प्रतिरक्षा सेल योगदान में ब्याज की एक गहनता के लिए प्रेरित किया. दुबला और मोटे एटी में अलग प्रतिरक्षा सेल आबादी के अलगाव और मात्रा का ठहराव अब immunometabolism प्रयोगशालाओं में एक सामान्य उपयोग तकनीक है, अभी तक अत्यधिक ध्यान प्राप्त आंकड़ों विश्वसनीय और व्याख्या है ताकि स्ट्रोमल संवहनी सेल अलगाव में और प्रवाह cytometry विश्लेषण में दोनों लिया जाना चाहिए . इस वीडियो में हम, कीमा पचा, और प्रतिरक्षा सेल समृद्ध स्ट्रोमल संवहनी अंश अलग करने के लिए कैसे प्रदर्शित करता है. बाद में, हम एंटीबॉडी लेबल मैक्रोफेज और टी lymphocytes और कैसे प्रवाह cytometry प्रयोगों में उन पर ठीक से फाटक को दिखाने के लिए कैसे. कम वसा से सिंचित दुबला और उच्च वसा खिलाया मोटे चूहों से प्रतिनिधि प्रवाह cytometry भूखंडों प्रदान की जाती हैं. इस विश्लेषण का एक महत्वपूर्ण तत्व है कि एंटीबॉडी का इस्तेमाल होता हैमैक्रोफेज में स्वाभाविक रूप से autofluorescent हैं जहां चैनलों, साथ ही उचित मुआवजा नियंत्रण के उपयोग में नहीं प्रतिदीप्ति.
Introduction
ऐतिहासिक, वसा ऊतकों (एटी) ऊर्जा संतुलन के जवाब में फैलता है और अनुबंध जो लिपिड भंडारण, के एक आभ्यांतरिक अंग के रूप में देखा गया है. अब हम पर सक्रिय रूप से सीधे खिला व्यवहार और प्रणालीगत ग्लूकोज homeostasis को प्रभावित करती है, जो हार्मोन, के एक नंबर का स्राव करता है कि एक गतिशील अंत: स्रावी अंग का प्रतिनिधित्व करता है समझते हैं. इसके अलावा, पिछले एक दशक में स्ट्रोमल संवहनी अंश SVF (), साथ ही समस्थिति में उनके योगदान के लिए एटी में रहने प्रतिरक्षा कोशिकाओं के कई आबादी के लिए एक बढ़ती हुई सराहना की गई है.
पहली बार 1964 में 1 Rodbell द्वारा वर्णित किया गया था वसाकोशिका और SVF एक collagenase पचाने का उपयोग करने पर अलग करने की क्षमता अंतर centrifugation द्वारा पीछा किया. Collagenase द्वितीय सबसे अक्सर वसाकोशिका इंसुलिन रिसेप्टर्स 1 के रखरखाव के कारण वसाकोशिका और SVF अलग होने के लिए प्रयोग किया जाता है. एटी के शुरू में, एंजाइमी विभाजन मुख्यतः adipo अध्ययन करने के लिए नियुक्त किया गया थाचयापचय एक प्रत्यय जिसका अर्थ कोशिका है और preadipocytes अलग करने के लिए. अभी हाल ही में प्रवाह cytometers की व्यापक उपलब्धता और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध फ्लोरोफोरे संयुग्मित एंटीबॉडी की बढ़ती संख्या के साथ संयुक्त इस तकनीक, प्रतिरक्षा कोशिकाओं एटी के लक्षण वर्णन में मदद की है.
एटी सूजन में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उपस्थिति पहले से 2 में वर्णित किया गया था, Weisberg एट अल द्वारा लाभदायक कागजात. और जू एट अल. प्रकाशित 2003 में भड़काऊ साइटोकिन्स छिपाना और एटी विशेष और प्रणालीगत इंसुलिन प्रतिरोध 3,4 साथ सहसंबंधी जो मोटापे में मैक्रोफेज एटी का संचय (एटीएम), दस्तावेज़ पहले थे. इन टिप्पणियों की जांच पड़ताल के एक नए क्षेत्र का आधार हाल ही में, "immunometabolism," 5 गढ़ा के रूप में सेवा की है और वृक्ष के समान कोशिकाओं 6, मस्तूल कोशिकाओं 7, टी कोशिकाओं 8 सहित विभिन्न प्रतिरक्षा सेल आबादी, implicating अध्ययन के द्वारा पीछा किया गया है -10, बी कोशिकाओं 11, NKT कोशिकाओं 12, इयोस्नोफिल्स 13, और neutrophils मोटापा जुड़े इंसुलिन प्रतिरोध के विकास में 14,15.
इस अनुच्छेद के लक्ष्य SVF एटी की कोशिकाओं को अलग करने के लिए और एटीएम विशेषताएँ और प्रवाह के माध्यम से टी कोशिकाओं पर करने के लिए इस्तेमाल collagenase पचाने तकनीक का विस्तृत विवरण उपलब्ध कराने के लिए है. इस प्रोटोकॉल पर माउस के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन, दर्शकों 16 एटी मानव के लिए इस तकनीक का उपयोग पर व्यापक विस्तार प्रदान करने के लिए एक उत्कृष्ट लेख को पढ़ने से लाभ हो सकता है. इस लेख के लक्षित दर्शकों के सीमित अनुभव पर माउस के साथ काम कर रहा है और प्रवाह cytometry प्रदर्शन के साथ जांचकर्ताओं शामिल हैं. समय और संसाधनों के साथ सेलुलर उपज और व्यवहार्यता के बीच संतुलन साधने के लिए कई व्यावहारिक दृष्टिकोण प्रतिरक्षा सेल आबादी में निस्र्पक के लिए के रूप में अच्छी तरह से इष्टतम प्रवाह नियंत्रण के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. हमारे प्रोटोकॉल के अलावा, पाठकों referr हैंउचित नियंत्रण और मुआवजा 17 शामिल करने के लिए प्रवाह cytometry के तकनीकी पहलुओं में से कुछ का एक उत्कृष्ट चर्चा के लिए बसु एट अल. द्वारा हाल ही में जौव लेख को एड.
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Protocol
1. अभिकर्मकों और आपूर्ति
इससे पहले प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की शुरुआत करने के लिए, निम्नलिखित अभिकर्मकों तैयार:
- 70% इथेनॉल
- 1X पीबीएस
- 1X DPBS (सीए और मिलीग्राम के बिना) 0.5% बीएसए के साथ पूरक
- FACS बफर: 1X DPBS (सीए और मिलीग्राम के बिना), 2 मिमी EDTA, और 1% एफसीएस
- एसीके बफर: 150 मिमी एनएच 4 सीएल, 10 मिमी KHCO 3, और पानी में 0.1 मिमी ना 2 EDTA
2. वसा ऊतकों की कटाई और तैयारी
- प्रत्येक संस्था के लिए विशिष्ट IACUC को मंजूरी दी प्रक्रियाओं के अनुसार चूहों euthanize.
- अच्छी तरह से 70% इथेनॉल के साथ फर गीला.
- असिरूप प्रक्रिया के स्तर (उरोस्थि के निचले भाग) पर एक चीरा बनाने के लिए और किसी भी प्रमुख रक्त वाहिकाओं को तोड़ने के लिए नहीं ख्याल रख रही है, दिल का पर्दाफाश करने के वक्ष गुहा खुला.
नोट: इस बिंदु पर, जितना डायाफ्राम बरकरार छोड़ने के लिए भी सहायक हैसंभव है और रक्त की अनुमति और वक्ष गुहा के बाहर प्रवाह perfusate को रिब पिंजरे के दाईं ओर से एक पायदान को काटने के लिए.
- रक्त की अनुमति है और संचार प्रणाली से बचने के लिए perfusate को सही आलिंद क्लिप.
नोट: एटी मोटे चूहों, अतिरिक्त पेरिकार्डियल के साथ काम करते हैं दिल के लिए उपयोग की अनुमति के लिए हटा दिया जाना पड़ सकता है.
- संदंश के साथ दिल समझ और धीरे सुप्रीम माध्यम बाएं वेंट्रिकल में एक सुई डालने. धीरे धीरे 15 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस के साथ माउस छिड़कना.
नोट: फेफड़ों को भरने और विस्तार करने के लिए शुरू अगर छिड़काव की दर कम करें.
- Peritoneal गुहा खोलें और किसी भी जननांगों ऊतकों से बचने के लिए ध्यान का उपयोग कर perigonadal वसा पैड हटा दें.
- एक में वसा पैड जगह 0.5% बीएसए के साथ पूरक 2 मिलीलीटर 1X DPBS (मिलीग्राम या सीए के बिना) युक्त बर्फ पर नाव तौलना, और ठीक टुकड़ों में एटी कीमा.
नोट: प्रति एटी की राशि की सीमा 1.2 ग्राम के लिए नाव तौलना. एटी की मात्रा 1.2 ग्राम से अधिक है, दो तौलना नावों के बीच समान रूप से विभाजित है.
- बर्फ पर नमूने पर रखें और 0.5% बीएसए, 10 मिमी 2 CaCl, और 4 मिलीग्राम / एमएल collagenase, प्रकार द्वितीय के साथ पूरक 1X DPBS के मिलकर नमूना एटी प्रति 3 मिलीग्राम collagenase पचाने समाधान तैयार करते हैं.
3. Collagenase पाचन
- Homogenate घनघोर और 1 मिलीलीटर DPBS (0.5% बीएसए) और 3 मिलीग्राम collagenase द्वितीय पचाने समाधान के साथ नाव तौलना rinsing से कम 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर स्थानांतरण.
- 20 मिनट के लिए 37 पर एक घूर्णी प्रकार के बरतन (200 आरपीएम) डिग्री सेल्सियस में homogenate पर सेते हैं.
- बर्फ पर शंक्वाकार ट्यूबों और जगह से 10 मिलीलीटर DPBS (0.5% बीएसए) जोड़ें.
- एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कई बार homogenate Triturate, और एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 100 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से सेल निलंबन गुजरती हैं.
- 4 एवं विकास पर 10 मिनट के लिए 500 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्रजैसे, सी.
- छानना सतह पर तैरनेवाला और resuspend SVF सेल गोली 3 मिलीग्राम एसीके बफर में एरिथ्रोसाइट्स contaminating lyse लिए.
- 4 में 10 मिनट के लिए 500 XG पर 12 मिलीलीटर FACS बफर और अपकेंद्रित्र सेल निलंबन जोड़ें डिग्री सेल्सियस
- FACS बफर में छानना सतह पर तैरनेवाला और resuspend SVF सेल गोली.
नोट: सेल गोली 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के नीचे शामिल किया गया है, 0.5-1 एमएल FACS बफर उपयोग अंदर resuspend को कितना FACS बफर के लिए एक गाइड के रूप में सेल गोली के आकार का उपयोग करें, अन्यथा, 0.25-0.5 में resuspend मिलीलीटर.
- जगह बर्फ पर नमूने और मिश्रण 40 μl FACS बफर, 50 μl trypan नीले समाधान (0.2%), और 10 μl सेल निलंबन से सेल गिनती के लिए प्रत्येक नमूने के 1:10 कमजोर पड़ने aliquots तैयार करते हैं.
- Trypan नीले बहिष्कार पर आधारित व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना और 5-10 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए सेल निलंबन पतला.
4. सेल सतह एंटीजन का धुंधला हो जाना
नोट: एक उदाहरण के रूप में, F4/80 और CD11b, निम्नलिखित मुआवजा और FMO नियंत्रण के आधार पर एटीएम के अनुपात बढ़ाता जब तैयार करने की आवश्यकता होगी:
- बेदाग (कोशिकाओं)
- DAPI या propidium आयोडाइड (पीआई) एकल दाग (कोशिकाओं, 5.1 कदम जब तक व्यवहार्यता डाई जोड़ नहीं है)
- F4/80 एपीसी दाग एकल (कोशिकाओं या मुआवजा मोती)
- CD11b FITC (दाग एकल कक्षों यामुआवजा मोती)
- FMO 1 (कोशिकाओं): चूहा IgG2a κ निर्धारण नियंत्रण एपीसी + CD11b FITC + व्यवहार्यता डाई (5.1 कदम पर जोड़ा)
- FMO 2 (कोशिकाओं): F4/80 एपीसी + चूहा IgG2b κ निर्धारण नियंत्रण FITC + व्यवहार्यता डाई (5.1 कदम पर जोड़ा)
- (अभिकर्मकों और सामग्री की तालिका देखें) उपयुक्त एकाग्रता में फ्लोरोफोरे संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी और / या निर्धारण नियंत्रण जोड़ें.
- 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश और सेते से नमूने को सुरक्षित रखें.
- 4 में 5 मिनट के लिए 500 XG पर 2 मिलीलीटर FACS बफर और अपकेंद्रित्र सेल निलंबन जोड़ें डिग्री सेल्सियस
- 2 मिलीलीटर FACS बफर में छानना सतह पर तैरनेवाला और resuspend SVF सेल गोली.
- ≥ 400 μl FACS बफर में 5 4 डिग्री सेल्सियस पर मिनट, और resuspend SVF सेल गोली के लिए सेल निलंबन 500 XG अपकेंद्रित्र.
- एक 35 सुक्ष्ममापी सेल झरनी ट्यूब टॉप से लैस 12 x 75 मिमी polystyrene दौर नीचे ट्यूबों के लिए नमूने स्थानांतरण.
- 4 में रोशनी, और दुकान के नमूने से बचाने डिग्री सेल्सियस FACS विश्लेषण तक.
नोट: इष्टतम परिणामों के लिए कोशिकाओं immeadiately विश्लेषण किया जाना चाहिए, लेकिन, इस प्रोटोकॉल के साथ FACS विश्लेषण सफलतापूर्वक 4 डिग्री सेल्सियस से कम 1-2 घंटे के लिए FACS बफर में संग्रहीत लेबल की कोशिकाओं पर आयोजित किया गया है कोशिकाओं को भंडारण के समय को बढ़ाने के लिए तय होने की जरूरत है, लेबल कोशिकाओं FACS विश्लेषण करने से पहले 24 घंटे के लिए 4 में 2% paraformaldehyde के डिग्री सेल्सियस के साथ तय किया जा सकता है. एंटीबॉडी कंपनियों के लेबल की कोशिकाओं से एक सप्ताह तक के लिए भंडारित किया जा सकता है कि सुझाव है, तथापि, यह इस प्रक्रिया के संदर्भ में परीक्षण नहीं किया गया.
5. FACS विश्लेषण
- पिछले FACS विश्लेषण करने, मृत / रहते सेल भेदभाव के लिए अनुमति देने के लिए नमूने और उचित नियंत्रण करने के लिए व्यवहार्यता डाई जोड़ें.
नोट: कई व्यवहार्यता रंजक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, लेकिन DAPI और पीआई / उत्तेजना उत्सर्जन मुनाफे के आधार पर की सिफारिश की हैफ्लोरोफोरे संयुग्मित एंटीबॉडी का iles इस्तेमाल किया जा रहा है. DAPI और Propidium आयोडाइड 0.2 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में प्रत्येक नमूने के लिए जोड़ रहे हैं.
- ब्याज की सेल की आबादी (एस) के पैमाने पर कर रहे हैं ताकि ओर तितर बितर (एसएससी) और आगे तितर बितर (एफएससी) को समायोजित करने के लिए, प्रयोगात्मक नमूने के रूप में एक ही ऊतक से अलग एक बेदाग नकारात्मक नियंत्रण नमूना, अधिमानतः कोशिकाओं का उपयोग करें.
नोट: SVF कोशिकाओं एटी के विश्लेषण के लिए, यह एसएससी एक रैखिक पैमाने में एफएससी बनाम एक लॉग पैमाने में प्रदर्शित किया कि सिफारिश की है. अक्सर बहुत बड़े और बारीक हैं जो एटीएम, जब विश्लेषण एसएससी के लिए एक लॉग पैमाने का उपयोग विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.
- विश्लेषण किया जा रहा सेल (एस) के प्रकार के आधार पर एक प्रारंभिक प्रकाश बिखराव फाटक ड्रा, और बेदाग कोशिकाओं तक (लगभग 10 2 पर केन्द्रित) एक एकल पैरामीटर हिस्टोग्राम के छोड़ दिया पर कर रहे हैं ताकि photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) लाभ को समायोजित उचित चैनलों के लिए. </ ली>
नोट: यह लिम्फोसाइटों और मैक्रोफेज (या अन्य माइलॉयड कोशिकाओं) के कारण autofluorescence में अंतर करने के लिए अलग से विश्लेषण करने की सिफारिश की है.
- बहु रंग मुआवजा प्रदर्शन करने के लिए एक दाग नियंत्रण या एंटीबॉडी कब्जा मुआवजा मोतियों का प्रयोग करें.
नोट: मुआवजा मोतियों के उपयोग की सिफारिश की है, लेकिन, प्रत्येक एंटीबॉडी की अनुकूलता सुनिश्चित किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, मुआवजा मोती अलग कक्षों के लिए एक उपयुक्त एकल दाग नियंत्रण प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं, जो मामले में खरगोश एंटीबॉडी के साथ पार प्रतिक्रिया नहीं हो सकता है.
- संशोधित FMO नियंत्रण पर आधारित प्रयोगात्मक द्वार निर्धारित करें.
- ब्याज की आबादी के प्रसार पर आधारित घटनाओं की उचित संख्या में एकत्र और प्रयोगात्मक डेटा रिकॉर्ड करने के लिए प्रवाह cytometer सेट करें.
- निर्यात FCS डेटा ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए फ़ाइलें. प्रवाह cytometr के लिए उपलब्ध कई कार्यक्रम कर रहे हैंy डेटा विश्लेषण. हम Cytobank, investigatores इंटरनेट का उपयोग 18 के साथ किसी भी कंप्यूटर से आंकड़ों को संग्रहीत और विश्लेषण डेटा और उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है एक वेब आधारित प्लेटफार्म की सलाह देते हैं. इसके अतिरिक्त, Cytobank डेटा सार्वजनिक सुलभ बनाने के लिए या सहयोगियों के लिए उपयोग को प्रतिबंधित करने की क्षमता प्रदान करता है.
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Representative Results
अंतर centrifugation द्वारा पीछा एटी की collagenase पाचन एक कम वसा (वसा से 10% किलो कैलोरी) या उच्च वसा (वसा से 60% किलो कैलोरी) आहार (LFD और HFD खिलाया पुरुष C57BL/6J चूहों की अधिवृषणी वसा पैड से SVF अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था , क्रमशः) के 16 सप्ताह के लिए. SVF की कोशिकाओं तो FACS विश्लेषण के माध्यम से व्यवहार्य एटीएम (चित्रा 1) के और टी कोशिकाओं (चित्रा 2) एटी अनुपात यों तो फ्लोरोफोरे संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ लेबल रहे थे. प्रकाश बिखराव, नक़ल भेदभाव, और व्यवहार्यता द्वार सहित प्रारंभिक gating, आंकड़े 1 ए और 2A में चित्रित कर रहे हैं. यह चित्रा 2A में प्रारंभिक प्रकाश बिखराव गेट autofluorescent माइलॉयड कोशिकाओं सहित बचने के क्रम में लिम्फोसाइट आबादी तक सीमित है कि जोर दिया जाना चाहिए. संशोधित FMO का उपयोग करने का एक उदाहरण चित्रा 1 बी में दिखाया गया है प्रयोगात्मक द्वार स्थापित करने के लिए नियंत्रित करता है. इस उदाहरण में, F4/80 (बाएँ स्तंभ) और CD11b (सही कॉलम) एंटीबॉडी autofluorescence और गैर विशिष्ट बंधन के लिए खाते में उचित निर्धारण नियंत्रण के साथ प्रतिस्थापित कर रहे हैं. चक्र द्वार तो पहचान करने के लिए तैयार कर रहे हैं व्यवहार्य एटीएम (F4/80 + CD11b +). सीडी 4 + और टी कोशिकाओं में सीडी 8 + के लिए gating चित्रा 2B में दिखाया गया है. लिम्फोसाइटों एटी व्यवहार्य TCRβ के लिए पहली gated हैं (बाएँ स्तंभ). बाद में, TCRβ + एटी टी कोशिकाओं CD4 और CD8 (सही कॉलम) के लिए gated हैं.
चित्रा 1. वसा ऊतक मैक्रोफेज. SVF पुरुष C57BL/6J चूहों की एटी अधिवृषणी से पृथक किया गया collagenase डाइजेस्ट प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए 16 सप्ताह के लिए एक कम वसा या उच्च वसा आहार खिलाया. Subsequently, SVF कोशिकाओं F4/80 और CD11b के दाग थे और FACS विश्लेषण एटीएम की पहचान करने के लिए एक प्रवाह cytometer का उपयोग किया गया था. (ए) के प्रारंभिक प्रकाश बिखराव और व्यवहार्यता द्वार. (बी) के संशोधित FMO F4/80 और CD11b के लिए निर्धारण एंटीबॉडी शामिल चतुर्थ भाग द्वार संरेखित करने के लिए इस्तेमाल किया गया नियंत्रित करता है. (सी) के एटी कम वसा और उच्च वसा खिलाया चूहों से F4/80 + CD11b + एटीएम के अनुपात की तुलना करें. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. वसा ऊतकों टी कोशिकाओं. SVF पुरुष C57BL/6J चूहों की अधिवृषणी वसा ऊतकों से अलग किया गया था टी का उपयोग करते हुए 16 सप्ताह के लिए एक कम वसा या उच्च वसा आहार खिलायावह collagenase डाइजेस्ट प्रोटोकॉल. बाद में, SVF कोशिकाओं TCRβ, सीडी 4 के लिए दाग रहे थे, और CD8a और FACS विश्लेषण टी कोशिकाओं में चिह्नित करने के लिए एक प्रवाह cytometer का उपयोग किया गया था. (ए) के प्रारंभिक प्रकाश बिखराव और व्यवहार्यता द्वार. के अनुपात में (ईसा पूर्व) तुलना TCRβ + टी कोशिकाओं (बाएँ स्तंभ) और सीडी 4 + और सीडी 8 (बी) के कम वसा और (सी) उच्च वसा खिलाया चूहों की एटी. से + टी कोशिकाओं (सही कॉलम) के लिए यहां क्लिक करें बड़ा आंकड़ा देखने .
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Discussion
मोटापे की चयापचय परिणामों में प्रतिरक्षा प्रणाली की भूमिका में बढ़ती रुचि एटी की प्रतिरक्षा कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए प्रवाह cytometry के व्यापक उपयोग के लिए प्रेरित किया है. सटीक प्रोटोकॉल अपने अनुभव और उपलब्ध उपकरणों के आधार पर प्रयोगशालाओं के बीच भिन्न होंगे, महत्वपूर्ण कदम collagenase पाचन, अंतर अपकेन्द्रण, और कोशिका की सतह प्रतिजन लेबलिंग में शामिल हैं. वर्तमान अनुच्छेद के लक्ष्य पर और / या प्रवाह cytometry प्रदर्शन के साथ काम सीमित अनुभव के साथ जांचकर्ताओं को SVF एटी के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल और व्यावहारिक मार्गदर्शन प्रदान करने के लिए है.
किसी भी प्रयोगात्मक तकनीक के साथ के रूप में, या काफी वांछित परिणाम को प्रभावित नहीं हो सकता है कि कई बदलाव कर रहे हैं. हमारे अनुभव के आधार पर, प्रोटोकॉल विस्तृत यहां समय, संसाधन, सेलुलर उपज, और सेल व्यवहार्यता के बीच सबसे कुशल tradeoff का प्रतिनिधित्व करता है. उदाहरण के लिए, हम है कि बढ़ती पाया हैcollagenase के समान मात्रा में collagenase द्वितीय पाचन की अवधि के रूप में ज्यादा के रूप में 60 मिनट सेलुलर उपज पर एक नगण्य प्रभाव पड़ता है, इस प्रकार, हम collagenase जोखिम की लंबाई कम करने के लिए एक 20 मिनट पाचन उपयोग. Collagenase द्वितीय वसा ऊतकों digestions के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया collagenase है. अलग collagenases और उनके प्राथमिक उपयोग के सभी का विवरण सिग्मा की वेबसाइट पर पाया जा सकता है. ऊपर प्रोटोकॉल से विशिष्ट सेलुलर पैदावार 2-3 कर रहे हैं 10 x 6 और 4-5 चूहों से कम 6 कोशिकाओं / जी के लिए एक कम वसा (वसा से 10% किलो कैलोरी) और उच्च वसा (वसा से 60% किलो कैलोरी) आहार खिलाया एक्स 10 16 सप्ताह, क्रमशः. Collagenase पचाने बार बदलती के अलावा, आहार उपचार सहित, प्रयोग किया जा रहा प्रयोगात्मक मॉडल के आधार पर मौजूदा प्रोटोकॉल के लिए संभावित संशोधनों के एक नंबर रहे हैं. सबसे पहले, कोलेस्ट्रॉल या संतृप्त फैटी एसिड के लिए समृद्ध आहार खिलाया चूहों से एटी कटाई, जब एक वजह क़ीमा को बर्फ पर नमूने पूर्व रखने से बचेंटी जमना और क़ीमा मुश्किल कर देगा. दूसरा, हमारे प्रोटोकॉल एक एरिथ्रोसाइट सेल कदम (3.6) भी शामिल है, लेकिन, एक सफल प्रारंभिक छिड़काव अक्सर यह कदम अनावश्यक बनाता है. तीसरा, देखभाल collagenase पचाने समाधान (5 मिमी अंतिम एकाग्रता) को 2 CaCl से अधिक 10 मिमी जोड़ नहीं लिया जाना चाहिए, अधिक से अधिक कैल्शियम की सांद्रता एक कैल्शियम फॉस्फेट वेग के गठन में हो सकता है. इस वेग प्रारंभिक centrifugation कदम (3.5) के बाद रूपों हैं, वेग को दूर करने के लिए एरिथ्रोसाइट lysis के कदम से पहले 20 मिलीलीटर FACS बफर (EDTA युक्त) के साथ दो धोने कदम जोड़ें. चौथा, हम SVF अलग जब जांचकर्ताओं ने कम से कम एक पूरे perigonadal वसा पैड का उपयोग करें. हम नहीं क्योंकि सेलुलर उपज में सीमाओं की इस सिफारिश करते हैं, लेकिन विभिन्न सेल आबादी 19 विभिन्न क्षेत्रीय वितरण को प्रदर्शित करता है. Perigonadal वसा पैड के केवल एक हिस्से हमें है जब इस प्रकार, परिणाम पक्षपातपूर्ण हो सकता हैएड में रहने प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने के लिए. पूरे वसा पैड 1.2 ग्राम से बड़ा है, तो दुम छोर तक विजय - स्तम्भ से अनुलंबीय वसा ऊतकों विभाजित करते हैं. इस आधे रास्ते में विभाजित है, प्रत्येक आधा कोशिकाओं का एक प्रतिनिधि जनसंख्या प्रदान करना चाहिए और आम तौर पर 1.2 ग्राम से कम होना चाहिए. हालांकि, इस मामले में यह अभी भी अधिक से अधिक 1.2 ग्राम है कि, हम अलग ट्यूबों में 1.2 ग्राम क्षेत्रों के collagenase digestions प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं, और फिर प्रवाह cytometry के लिए SVF कोशिकाओं के सभी संयोजन. इसके अलावा, दुबला चूहों के लिए, यह प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए पर्याप्त SVF कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए 2 या 3 चूहों से वसा पैड गठबंधन करने के लिए आवश्यक हो सकता है. अतिरिक्त चूहों के लिए की जरूरत प्रयोगों जब डिजाइनिंग के लिए जिम्मेदार होना चाहिए. अंत में, डेटा प्रदर्शित करने के लिए एक और रास्ता ऊतक के ग्राम प्रति कोशिकाओं की संख्या है. सेल घनत्व वांछित है, एटी क़ीमा और पाचन से पहले तौला जाना चाहिए.
प्रवाह cytometry, दो के माध्यम से SVF कोशिकाओं एटी निस्र्पक करने का संबंध हैअंक पर जोर दिया जाना चाहिए. पहला, सभी फ्लोरोफोरे संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी SVF कोशिकाओं एटी के साथ उपयोग के लिए मान्य किया जाना चाहिए और ठीक से titrated. हम मोतियों के साथ मुआवजे का प्रदर्शन हालांकि, हम पहले से SVF एटी के साथ इन एंटीबॉडी titrated था. मैक्रोफेज निस्र्पक है, हम इन रंगों को संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करते समय हम एटीएम के गैर विशिष्ट बंधन के लिए सम्मान के साथ मिश्रित परिणाम मिला है, के रूप में (जैसे पीई Cy7) मिलकर रंगों के इस्तेमाल के खिलाफ सलाह देते हैं. इसके अलावा, इस तरह के पीई और FITC रूप fluorophores ही ऊपर वर्णित के रूप में सावधान अनुमापन के बाद किया जाना चाहिए. हम आमतौर पर की सिफारिश की सांद्रता के साथ SVF कोशिकाओं पर विशेषताएँ इस्तेमाल विशिष्ट एंटीबॉडी की एक सूची तालिका 1 में प्रदान में पाया जा सकता है. एक उच्च एकाग्रता में प्रयोग किया जाता है जब एटीएम प्रदर्शनी मजबूत autofluorescence और एंटीबॉडी के एक नंबर गैर विशिष्ट बंधन के एक निम्न स्तर प्रदर्शित दूसरा, क्योंकि, हम संशोधित FMO के उपयोग प्रयोगात्मक फाटकों सेट करने के लिए नियंत्रण की सलाह देते हैं.FMO नियंत्रण प्रयोगात्मक नमूने 20 लेबल इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के सभी पर एक साथ नियंत्रण के नमूने का एक सेट धुंधला द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. हम एक उचित फ्लोरोफोरे संयुग्मित निर्धारण नियंत्रण के बजाय सिर्फ इसे दूर करने के साथ एंटीबॉडी के एक बदलने के लिए हमारे प्रोटोकॉल में FMO नियंत्रण संशोधित किया है. अभ्यास में, यह सकारात्मक और नकारात्मक आबादी के बीच असाधारण जुदाई प्रदान कि एंटीबॉडी के लिए FMO नियंत्रण छोड़ करने के लिए स्वीकार्य हो सकता है. इन नियंत्रणों के अलावा, आप आगे और पक्ष बिखराव के आधार पर लिम्फोसाइट और बृहतभक्षककोशिका आबादी के लिए कि एंटीबॉडी पर gating के लिए पहले, हम पहिले से चयन ध्यान दें. ऐसे FITC और मिलकर रंगों के रूप में fluorophores के साथ लिम्फोसाइट आबादी का विश्लेषण करने पर यह autofluorescent मैक्रोफेज का पता लगाने को समाप्त होगा.
विस्तृत प्रोटोकॉल इस लेख के दायरे से परे हैं, वर्णित अलगाव तकनीक चरित्र के उद्देश्य से कई तकनीकों के लिए एक महत्वपूर्ण पहला कदम के रूप में कार्य करता हैएटी में रहने प्रतिरक्षा कोशिकाओं terizing. उदाहरण के लिए, ऊपर अलगाव और धुंधला प्रोटोकॉल mRNA के जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के लिए अलग किया जा सकता है, जिसमें से विशिष्ट आबादी की छंटाई की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, प्रोटोकॉल को सरल संशोधनों एटीएम के पूर्व vivo उपचार की अनुमति के लिए बनाया जा सकता है. इस तरह के संशोधनों तो दो बार धोया और एक उचित सेल संस्कृति मीडिया में resuspended किया जाएगा जो SVF, प्राप्त करने के लिए बाँझ तकनीक का उपयोग शामिल है. बल्कि सेल सतह एंटीजन दाग फ्लोरोफोरे संयुग्मित एंटीबॉडी जोड़ने से यह भी पालन कर सकते हैं fibroblasts और preadipocytes के रूप में एक शुद्ध आबादी होने का दावा नहीं किया जा सकता है, हालांकि SVF (प्लास्टिक पालन के माध्यम से एटीएम के लिए समृद्ध करने के लिए गैर इलाज ऊतक संस्कृति प्लेटों को जोड़ा जा सकता है ). इस संवर्धन द्वारा 37 में 2-4 घंटे के लिए SVF पूरा किया है डिग्री सेल्सियस गैर पक्षपाती कोशिकाओं को दूर करने के लिए दो वाशिंग कदम के द्वारा पीछा किया. एटीएम फिर उसके अनुसार व्यवहार किया और एक ईडीटीए आधारित सेल हदबंदी तो उपयोग कर काटा जा सकता हैप्रवाह cytometry या क्रमशः शाही सेना या प्रोटीन के अलगाव के लिए Trizol या RIPA बफर में lysed लिए lution. बावजूद बहाव के आवेदन की, पहले 1964 में 1 Rodbell द्वारा वर्णित adipocytes और SVF कोशिकाओं को अलग करने के लिए collagenase पचाने तकनीक प्रतिरक्षा कोशिकाओं और मोटापे की चयापचय परिणाम के लिए उनके योगदान एटी के लक्षण वर्णन के लिए एक अमूल्य उपकरण होना जारी है.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
JSO एक एनआईएच रुथ एल Kirschstein एनआरएसए (F32 DK091040) द्वारा समर्थित है, एके अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन (7-10-एमआई 05) से एक Postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित है, और आह एक अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन स्थापित अन्वेषक पुरस्कार द्वारा समर्थित है (12EIA8270000). प्रवाह cytometry प्रयोगों वीएमसी फ्लो साझा संसाधन में प्रदर्शन किया गया. वीएमसी फ्लो साझा संसाधन वेंडरबिल्ट पाचन रोग अनुसंधान केंद्र (DK058404) द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
| mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
| V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents. |
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References
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