Summary
Fettgewebe (AT) ist ein Ort der intensiven Immunzellaktivierung und Interaktion. Fast alle Zellen des Immunsystems sind in AT und ihre Verhältnisse werden durch Fettleibigkeit verändert. Proper Isolierung, Quantifizierung und Charakterisierung von AT Immunzellpopulationen sind entscheidend für das Verständnis ihrer Rolle in immunometabolic Krankheit.
Abstract
Die Entdeckung erhöht Makrophageninfiltration im Fettgewebe (AT) von übergewichtigen Nagern und Menschen hat zu einer Intensivierung des Interesses an Immunzellen Beitrag zur lokalen und systemischen Insulinresistenz geführt. Isolierung und Quantifizierung der verschiedenen Immunzellpopulationen in schlanken und adipösen AT ist heute ein häufig genutzt Technik in immunometabolism Laboratorien; noch extremer Sorgfalt muss sowohl in Stromazellen vascular cell Isolation und in der Durchflusszytometrie-Analyse gemacht werden, so dass die erhaltenen Daten zuverlässig und interpretierbar ist . In diesem Video zeigen wir, wie man Hackfleisch, verdauen, und zu isolieren, das Immunsystem Zellen angereicherte Stromazellen vaskulären Fraktion. Anschließend zeigen wir, wie man Antikörper Label Makrophagen und T-Lymphozyten und wie man richtig Tor auf sie in der Durchflusszytometrie Experimente. Repräsentative Durchflusszytometrie Plots aus fettarm-fed schlank und fettreichen-fed fettleibigen Mäusen vorgesehen sind. Ein wichtiges Element dieser Analyse ist die Verwendung von Antikörpern, die zu tunfluoresziert nicht in Kanälen, in denen AT Makrophagen sind natürlich autofluoreszierenden, sowie die Verwendung der richtigen Kompensation Kontrollen.
Introduction
Historisch ist das Fettgewebe (AT) als inertes Organ Lipidspeicherung, die expandiert und kontrahiert in Reaktion auf Energiebilanz betrachtet. Wir verstehen jetzt, dass bei einem dynamischen endokrine Organ, das aktiv sondert eine Reihe von Hormonen, die direkten Einfluss auf das Fressverhalten und systemische Glukosehomöostase darstellt. Darüber hinaus in den letzten zehn Jahren hat es eine zunehmende Wertschätzung für die zahlreichen Populationen von Immunzellen mit Wohnsitz in der AT Stromazellen vaskulären Fraktion (SVF), sowie ihren Beitrag zur AT-Homöostase.
Die Fähigkeit, die AT Adipozyten und SVF Verwendung einer Kollagenase-Verdau trennen gefolgt durch differentielle Zentrifugation wurde zuerst von Rodbell 1964 1 beschrieben. Collagenase II wird am häufigsten für Adipozyten und SVF Trennung aufgrund von Wartungsarbeiten von Adipozyten Insulin-Rezeptoren 1 verwendet. Schon früh, enzymatische Fraktionierung von AT wurde in erster Linie eingesetzt, um adipo studierenCyte Stoffwechsel und Präadipozyten zu isolieren. In jüngerer Zeit hat diese Technik, mit der weit verbreiteten Verfügbarkeit von Durchflusszytometern und der ständig steigenden Anzahl von kommerziell erhältlichen fluorophorkonjugierten Antikörper kombiniert, die Charakterisierung von AT Immunzellen erleichtert.
Obwohl die Anwesenheit von Immunzellen im entzündeten AT hatte zuvor 2 beschrieben, die bahnbrechenden Arbeiten von Weisberg et al. und Xu et al. veröffentlicht im Jahr 2003 waren die ersten, die Anhäufung von AT Makrophagen (ATMs) in Fettleibigkeit, die inflammatorische Zytokine sezernieren und korrelieren mit AT-spezifische und systemische Insulinresistenz 3,4 dokumentieren. Diese Beobachtungen diente als Grundlage für ein neues Forschungsfeld vor kurzem geprägt, "immunometabolism", 5 und wurden von Studien implizieren verschiedene Immunzellen Bevölkerungsgruppen, einschließlich dendritischen Zellen 6, 7 Mastzellen, T-Zellen 8 gefolgt -10, B-Zellen 11, 12 NKT-Zellen, Eosinophile 13 und Neutrophilen 14,15 in der Entwicklung von Adipositas Insulinresistenz.
Das Ziel dieses Artikels ist es, eine detaillierte Beschreibung der Kollagenase Digest Technik verwendet, um Zellen des AT SVF zu isolieren und zu charakterisieren Geldautomaten und AT T-Zellen über Durchflusszytometrie bieten. Dieses Protokoll wurde für Maus optimiert wurde AT, aber die Zuschauer können von der Lektüre einen ausgezeichneten Artikel bieten umfangreiche Detail auf die Optimierung dieser Technik für den menschlichen AT 16 profitieren. Die Zielgruppe dieses Artikels enthält Ermittler mit begrenzter Erfahrung im Umgang mit Maus und AT Durchführung Durchflusszytometrie. Mehrere praktische Überlegungen zum Ausgleich zellulären Ertrag und Rentabilität mit Zeit und Ressourcen sowie eine optimale Durchflusszytometrie Kontrollen zur Charakterisierung AT Immunzellpopulationen vorgestellt. Zusätzlich zu unserem Protokoll werden die Leser referred einer aktuellen JoVE Artikel von Basu et al. für eine ausgezeichnete Diskussion über einige der technischen Aspekte der Durchflusszytometrie, um eine ordnungsgemäße Kontrollen und Kompensationen 17 umfassen.
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Protocol
1. Reagenzien und Zubehör
Vor Beginn dieses experimentelle Protokoll, bereiten Sie die folgenden Reagenzien:
- 70% Ethanol
- 1X PBS
- 1X DPBS (ohne Ca und Mg) mit 0,5% BSA ergänzt
- FACS-Puffer: 1X DPBS (ohne Ca und Mg), 2 mM EDTA und 1% FCS
- ACK-Puffer: 150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3 und 0,1 mM Na 2 EDTA in Wasser
2. Ernte und Herstellung von Fettgewebe
- Euthanize Mäusen nach IACUC genehmigten Modalitäten der einzelnen Institution.
- Gründlich benetzen das Fell mit 70% Ethanol.
- Einen Einschnitt auf der Ebene des Xiphoidbasis (unterer Teil des Brustbeins) und öffnen Sie die Brusthöhle, um das Herz aussetzen, kümmert sich nicht um irgendwelche großen Blutgefäße durchtrennen.
Hinweis: An dieser Stelle ist es auch hilfreich, um die Membran intakt lassen so viel wiemöglich und eine Kerbe geschnitten aus der rechten Seite des Brustkorbs, um Blut zu ermöglichen und Perfusat zu fließen aus der Brusthöhle.
- Befestigen Sie den rechten Vorhof, um Blut zu ermöglichen und um das Perfusat Kreislaufsystem zu entkommen.
Hinweis: Beim Umgang mit übergewichtigen Mäusen, überschüssige pericardial AT müssen entfernt werden, um Zugang zum Herzen zu ermöglichen.
- Fassen Sie das Herz mit einer Pinzette vorsichtig und legen Sie eine Nadel in die linke Herzkammer durch den Scheitelpunkt. Langsam versorgen die Maus mit 15 ml sterilem PBS.
Hinweis: Reduzieren Sie die Anzahl der Perfusion, wenn die Lunge zu füllen und zu erweitern beginnen.
- Öffnen Sie die Bauchhöhle und entfernen Sie die perigonadal Fettpolster mit Sorgfalt, um alle gonadal Gewebe zu vermeiden.
- Zeigen Fettpolster in ein Wiegeschiffchen auf Eis mit 2 ml 1X DPBS (ohne Mg oder Ca) mit 0,5% BSA ergänzt, und zerkleinern das AT in feine Stücke.
Hinweis: Begrenzen Sie die Menge von AT pro wiegen Boot bis 1,2 g. Wenn die Menge von mehr als 1,2 g, teilen sie gleichmäßig zwischen zwei Booten wiegen.
- Halten AT Proben auf Eis und bereiten 3 ml Kollagenase Abbaulösung pro AT Probe, bestehend aus 1X DPBS mit 0,5% BSA, 10 mM CaCl 2 und 4 mg / ml Collagenase Typ II ergänzt.
3. Kollagenaseverdau
- Übertragen AT bis 50 ml konische Röhrchen, indem die Homogenat und Spülen das Boot mit 1 ml DPBS (0,5% BSA) und 3 ml Collagenase II Abbaulösung wiegen.
- Inkubieren bei Homogenat in einer Rotationsrichtung Schüttler (200 Upm) bei 37 ° C für 20 min.
- 10 ml DPBS (0,5% BSA) auf konische Röhrchen und auf Eis.
- Man reibt Homogenat mehrmals mit einer serologischen Pipette 10 ml, und übergeben Zellsuspensionen durch 100 um-Filter in einer neuen 50 ml konischen Röhrchen.
- Zentrifuge Zellsuspension bei 500 g für 10 min bei 4 & dz. B., C.
- Dekantieren Überstand und resuspendieren SVF Zellpellet in 3 ml ACK-Puffer zur Lyse verunreinigen Erythrozyten.
- In 12 ml FACS-Puffer und Zentrifuge Zellsuspension bei 500 × g für 10 min bei 4 ° C.
- Dekantieren Überstand und resuspendieren SVF Zellpellet in FACS-Puffer.
Hinweis: Verwenden Sie die Größe des Zellpellets als Leitfaden für wie viel FACS Puffer resuspendieren in. Wenn das Zellpellet bedeckt den Boden des 50 ml konischen Röhrchen, verwenden 0,5-1 ml FACS-Puffer, andernfalls in 0,25-0,5 resuspendieren ml.
- Proben auf Eis stellen und bereiten 1:10 Verdünnung Aliquots jeder Probe zur Zellzählung durch Mischen von 40 ul FACS-Puffer, 50 ul Trypanblau-Lösung (0,2%), und 10 ul Zellsuspension.
- Anzahl lebensfähiger Zellen basierend auf Trypanblauausschluß und verdünnte Zellsuspensionen zu einer Endkonzentration von 5-10 x 10 6 Zellen / ml.
4. Die Färbung der Zelloberflächenantigene
Hinweis: Als ein Beispiel, bei der Quantifizierung des Anteils von Geldautomaten auf F4/80 und CD11b, die folgende Vergütung und FMO Kontrollen basieren, müssen vorbereitet werden:
- Unstained (Zellen)
- DAPI oder Propidiumiodid (PI) einzigen Fleck (Zellen, fügen Sie nicht Lebensfähigkeit Farbstoff bis Schritt 5.1)
- F4/80 APC einzigen Fleck (Zellen oder Entschädigung Perlen)
- CD11b FITC einzigen Fleck (Zellen oderEntschädigung Perlen)
- FMO 1 (Zellen): Ratte IgG2a κ Isotypenkontrolle APC + CD11b FITC + Lebensfähigkeit Farbstoff (aufgenommen bei Schritt 5.1)
- FMO 2 (Zellen): F4/80 APC + Ratte IgG2b κ Isotypenkontrolle FITC + Lebensfähigkeit Farbstoff (aufgenommen bei Schritt 5.1)
- In fluorophorkonjugierten Primärantikörper und / oder Isotypkontrollen in der entsprechenden Konzentration (siehe Tabelle von Reagenzien und Materialien).
- Schützen Proben aus Licht und Inkubation bei 4 ° C für 30 min.
- 2 ml FACS-Puffer und Zentrifuge Zellsuspension bei 500 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
- Dekantieren Überstand und resuspendieren SVF Zellpellet in 2 ml FACS-Puffer.
- Zentrifuge Zellsuspension 500 xg für 5 min bei 4 ° C und resuspendieren SVF Zellpellet in ≥ 400 ul FACS-Puffer.
- Übertragen Proben bis 12 x 75 mm Polystyrol Rundbodengefäße mit einer 35 um Zellsieb tube tops ausgestattet.
- Vor Licht und Aufbewahrung der Probe bei 4 ° C bis FACS-Analyse.
Hinweis: Für optimale Ergebnisse sollte immeadiately Zellen analysiert werden, jedoch FACS-Analyse mit diesem Protokoll wurde erfolgreich auf markierten Zellen in FACS-Puffer gespeichert 1-2 h durchgeführt bei 4 ° C. Wenn Zellen, die an Lagerzeit zu erhöhen, dann können markierten Zellen mit 2% Paraformaldehyd bei 4 ° C für 24 Stunden vor der FACS-Analyse fixiert werden. Antikörper Unternehmen deuten darauf hin, dass für die markierten Zellen gespeichert werden können bis zu einer Woche, aber dies nicht im Rahmen dieses Verfahrens geprüft.
5. FACS-Analyse
- Vor FACS Analyse hinzuzufügen Lebensfähigkeit Farbstoff und entsprechende Kontrollen für Live / Dead Zelldiskriminierung ermöglichen.
Hinweis: Zahlreiche Lebensfähigkeit Farbstoffe sind im Handel erhältlich, aber DAPI und PI empfohlen je nach Anregung / Emission Prof.iles der Fluorophor-konjugierten Antikörpern verwendet wird. DAPI und Propidiumiodid werden zu jeder Probe in einer Endkonzentration von 0,2 mg / ml zugegeben.
- Verwenden Sie einen ungefärbten negativen Kontrollprobe, vorzugsweise Zellen aus dem gleichen Gewebe wie die experimentellen Proben isoliert, um Seitwärtsstreuung (SSC) und Forward Scatter (FSC) so einstellen, dass die Zell-Population (n) von Interesse auf der Skala sind.
Hinweis: Für die Analyse von AT SVF Zellen, es wird empfohlen, dass SSC in einer logarithmischen Skala gegen FSC in einer linearen Skala angezeigt werden. Die Verwendung einer logarithmischen Skala für SSC ist besonders wichtig bei der Analyse von ATMs, die oft sehr groß und Granulat.
- Zeichnen Sie eine erste Lichtstreuung Tor von der Art der Zelle (n), die analysiert basierend, und stellen Sie den Photomultiplier (PMT) gewinnen, so dass die ungefärbte Zellen auf der anderen von einem einzigen Parameter-Histogramm nach links (etwa auf 10 2 zentriert) sind für die entsprechenden Kanäle. </ Li>
Hinweis: Es wird empfohlen, Lymphozyten und Makrophagen (oder anderen myeloischen Zellen) gesondert aufgrund von Unterschieden in Autofluoreszenz analysiert werden.
- Benutzen gefärbten Kontrollen oder Antikörper-Einfang Entschädigung Perlen Multi-Color-Kompensation durchzuführen.
Hinweis: Die Verwendung der Entschädigung Perlen wird empfohlen, jedoch Verträglichkeit jedes Antikörpers muss gewährleistet sein. Zum Beispiel kann eine Entschädigung Perlen nicht mit Kaninchen-Antikörper, in welchem Fall isolierten Zellen erforderlich ist, um eine angemessene Kontrolle einzigen Fleck erhalten werden Kreuzreaktion.
- Set experimentellen Toren auf modifizierten FMO Kontrollen.
- Stellen Sie die Durchflusszytometer, die entsprechende Anzahl von Ereignissen über die Prävalenz der Bevölkerung von Interesse basierend sammeln und aufzuzeichnen experimentellen Daten.
- Export FCS-Dateien für die Offline-Analyse. Es gibt zahlreiche Programme für Durchfluss cytometry Datenanalyse. Wir empfehlen Cytobank, eine web-basierte Plattform, die investigatores zu speichern und zu analysieren und erzeugen Bilder von jedem Computer mit Internet-Zugang 18 erlaubt. Darüber hinaus bietet Cytobank die Fähigkeit, Daten öffentlich zugänglich sind oder der Zugriff auf Mitarbeiter.
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Representative Results
Collagenase Verdauung von AT durch differentielle Zentrifugation wurde die SVF von Nebenhoden Fettpolster männlichen C57BL/6J-Mäusen isolieren zugeführt einer fettarmen (10% kcal aus Fett) oder hohen Fett (60% kcal aus Fett) Ernährung (LFD und HFD , jeweils) für 16 Wochen. Zellen des SVF wurden dann mit einem Fluorophor konjugiert primären Antikörpern markiert, um den Anteil von lebensfähigen Geldautomaten (1) und T-Zellen (2) über FACS-Analyse quantifiziert. Initial Gating, einschließlich Lichtstreuung, Wams Diskriminierung und Lebensfähigkeit Tore sind in den 1A und 2A dargestellt. Es sollte betont werden, dass die anfängliche Lichtstreuung Tor in 2A der Lymphozyten-Population wird eingeschränkt, um darunter autofluoreszierenden myeloischen Zellen zu vermeiden. Ein Beispiel der Verwendung von modifizierten FMO steuert experimentelle Gatter eingestellt ist in 1B dargestellt. In diesem Beispiel ist die F4/80 (linke Spalte) und CD11b (rechte Spalte) Antikörper sind mit geeigneten Isotypenkontrollen zu berücksichtigen Autofluoreszenz und unspezifische Bindung ersetzt. Quadrant Tore werden dann gezogen, um lebensfähig zu identifizieren ATMs (F4/80 + CD11b +). Gating für CD4 + und CD8 + T-Zellen AT ist in 2B gezeigt. Tragfähige AT Lymphozyten sind erste gated für TCR (linke Spalte). Anschließend werden TCR +-T-Zellen AT gated für CD4 und CD8 (rechte Spalte).
Abbildung 1. Fettgewebe Makrophagen. Die SVF wurde aus dem Nebenhoden AT männlicher C57BL/6J-Mäusen isoliert zugeführt eine fettarme oder fettreiche Diät für 16 Wochen mit dem Kollagenase Digest-Protokoll. Anschliequently wurden die Zellen für SVF F4/80 und CD11b gefärbt und FACS-Analyse wurde mit einem Durchflußzytometer um Geldautomaten zu identifizieren. (A) Initial Lichtstreuung und Lebensfähigkeit Toren. (B) Modified FMO steuert Einbeziehung Isotyp Antikörper für F4/80 und CD11b wurden verwendet, um Quadranten Toren auszurichten. (C) Vergleich des Anteils der F4/80 + CD11b + Geldautomaten von den AT fettarme und fettreiche gefütterten Mäusen. Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 2. Fettgewebe T-Zellen. Die SVF wurde vom Nebenhodenfettgewebe der männlichen C57BL/6J-Mäusen isoliert zugeführt eine fettarme oder fettreiche Diät für 16 Wochen mit ter Kollagenase Digest-Protokoll. Anschließend wurden die Zellen für SVF TCR, CD4 gefärbt und CD8a und FACS-Analyse wurde unter Verwendung eines Durchflusszytometers bei T-Zellen charakterisieren. (A) Initial Lichtstreuung und Lebensfähigkeit Toren. (BC) Vergleich der Anteil der TCR + T-Zellen (linke Spalte) und der CD4 + und CD8 + T-Zellen (rechte Spalte) aus dem AT von (B) und fettarm (C) fettreiche gefütterten Mäusen. Klicke hier, um eine größere Abbildung .
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Discussion
Das zunehmende Interesse an der Rolle des Immunsystems in den metabolischen Konsequenzen der Adipositas hat die weit verbreitete Verwendung von Durchflusszytometrie, um Immunzellen des AT charakterisieren geführt. Obwohl die genaue Protokoll zwischen den Labors auf ihre eigene Erfahrung und die Ausstattung variieren, bezogen wird, sind die kritischen Schritte Kollagenaseverdau, differentielle Zentrifugation und Zelloberflächenantigen Kennzeichnung. Das Ziel des vorliegenden Artikels ist es, ein detailliertes Protokoll und praktischer Leitfaden für die Isolierung der AT SVF den Ermittlern mit begrenzter Erfahrung in der Arbeit mit AT und / oder Durchführung der Durchflusszytometrie bieten.
Wie bei jeder experimentellen Technik gibt es zahlreiche Varianten, oder nicht wesentlich beeinflussen das gewünschte Ergebnis. Basierend auf unserer Erfahrung, stellt das Protokoll detaillierte hierin die effizienteste Kompromiss zwischen Zeit, Ressourcen zellulären Ertrag, und die Lebensfähigkeit der Zellen. Zum Beispiel haben wir gefunden, dass die Erhöhung derDauer der Collagenase II Verdauung bis zu 60 min bei ähnlichen Konzentrationen von Collagenase hat einen vernachlässigbaren Einfluss auf die zelluläre Ausbeute; so, haben wir eine 20 min Verdauung, um die Länge von Kollagenase Belastung zu verringern. Collagenase II ist die am häufigsten verwendeten Collagenase Fettgewebe Aufschlüsse. Eine Beschreibung aller der verschiedenen Kollagenasen und ihre wichtigsten Anwendungen auf Sigma-Website zu finden. Typische Ausbeuten von zellulären dem obigen Protokoll sind 2-3 x 10 6 und 4-5 x 10 6 Zellen / g AT von Mäusen mit niedrigem Fettgehalt (10% kcal aus Fett) und fettreiche (60% kcal aus Fett) Diät 16 Wochen jeweils. Neben unterschiedlichen Kollagenase Digest Zeit gibt es eine Reihe von möglichen Änderungen des aktuellen Protokolls in Abhängigkeit von der experimentellen Modell verwendet wird, einschließlich der diätetischen Behandlung. Erstens, bei der Ernte von AT Mäusen eine Diät für Cholesterin oder gesättigten Fettsäuren angereichert, zu vermeiden halten die Proben auf Eis vor Hacken, weil die AT wird erstarren und machen Hacken schwierig. Zweitens umfasst unser Protokoll eine Erythrozytenlyse Schritt (3.6), aber ein erfolgreicher anfänglichen Perfusion oft macht dieser Schritt nicht notwendig. Drittens muss darauf geachtet werden nicht noch mehr als 10 mM CaCl 2 der Kollagenase Digest-Lösung (5 mM Endkonzentration) werden, größer Calciumkonzentration kann zur Bildung eines Kalziumphosphat Niederschlag führen. Wenn dieser Niederschlag bildet nach dem ersten Zentrifugationsschritt (3.5) noch zwei Waschschritten mit 20 ml FACS-Puffer (enthaltend EDTA) vor der Erythrozyten-Lyse, um den Niederschlag zu entfernen. Viertens, empfehlen wir, dass die Ermittler mindestens eine gesamte perigonadal Fettpolster zu verwenden, wenn die Isolierung des SVF. Wir machen diese Empfehlung nicht aufgrund von Einschränkungen in der zellulären Ausbeute, sondern weil verschiedene Zellpopulationen zeigen unterschiedliche regionale Verteilungen 19. Somit können die Ergebnisse vorgespannt ist, wenn nur ein Teil des perigonadal Fettpolster ist unsed zu isolieren Immunzellen mit Wohnsitz in der AT. Wenn die gesamte Fettpolster ist größer als 1,2 Gramm, teilen Sie die Fettgewebe in Längsrichtung von der rostral nach kaudal endet. Wenn in der Hälfte dieser Weise aufgeteilt, sollte jeder Hälfte eine repräsentative Population von Zellen und sollte in der Regel weniger als 1,2 Gramm. Doch in dem Fall, dass dies immer noch mehr als 1,2 Gramm, empfehlen wir die Durchführung Kollagenase Aufschlüsse von 1,2 Gramm Segmente in getrennten Röhren, und dann die Kombination von all den SVF Zellen für die Durchflusszytometrie. Darüber hinaus ist für magere Mäuse, kann es notwendig sein, Fettpolster von 2 oder 3 Mäusen zu kombinieren, um genug SVF Zellen für die durchflusszytometrische Analyse zu erhalten. Die Notwendigkeit für zusätzliche Mäuse sollten bei der Gestaltung Experimente berücksichtigt werden. Schließlich ist ein weiterer Weg, um die Daten anzuzeigen Anzahl der Zellen pro Gramm Gewebe. Wenn Zelldichte gewünscht wird, sollte die AT vor dem Hacken und Verdauung abgewogen werden.
In Bezug auf die Charakterisierung AT SVF Zellen via Durchflusszytometrie, zweiPunkte sollten hervorgehoben werden. Erstens sollten alle fluorophorkonjugierten Primärantikörper zur Verwendung mit SVF Zellen validiert und richtig titriert. Trotz Entschädigung demonstriert mit Perlen, hatten wir zuvor diese Antikörper mit AT SVF titriert. Bei der Charakterisierung der Makrophagen, empfehlen wir gegen den Einsatz von Tandem-Farbstoffe (z. B. PE-Cy7), da hatten wir gemischte Ergebnisse in Bezug auf nicht-spezifische Bindung von Geldautomaten bei der Verwendung von Antikörpern, die an diesen Farbstoffen. Darüber hinaus sollte Fluorophore wie PE und FITC erst nach sorgfältiger Titration, wie oben beschrieben verwendet werden. Eine Liste von spezifischen Antikörpern wir häufig verwendet, um AT SVF Zellen zusammen mit empfohlenen Konzentrationen charakterisieren kann in der in Tabelle 1 zu finden. Zweitens, weil Geldautomaten zeigen eine starke Autofluoreszenz und eine Reihe von Antikörpern eine geringe unspezifische Bindung angezeigt wird, wenn bei einer hohen Konzentration verwendet wird, empfehlen wir die Verwendung von modifizierten FMO steuert auf experimentelle Toren gesetzt.FMO Kontrollen werden durch Färben einer Reihe von Kontrollproben mit allen außer einer der Antikörper zum Benennen experimentellen Proben 20 erzeugt. Wir haben den FMO Kontrollen im Protokoll modifiziert werden, um einer der Antikörper mit einem geeigneten fluorophorkonjugierten Isotyp-Kontrolle statt einfach entfernen zu ersetzen. In der Praxis kann es akzeptabel sein FMO Steuerungen für Antikörper, die außergewöhnliche Trennung zwischen positiven und negativen Populationen schützt verzichten. Zusätzlich zu diesen Kontrollen, werden Sie bemerken, dass vor Gating auf die Antikörper, Vorauswahl, die wir für Lymphozyten und Makrophagen Populationen auf Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht basiert. Dadurch wird die Erkennung von autofluoreszierenden Makrophagen bei der Analyse von Lymphozyten-Populationen mit Fluorophoren wie FITC und Tandem-Farbstoffe.
Obwohl detaillierte Protokolle über den Rahmen dieses Artikels sind, dient die Isolierung beschriebene Technik als wichtigen ersten Schritt für eine Vielzahl von Techniken zur Charakterisierung richtetkennzeichnenden Immunzellen mit Wohnsitz in der AT. Zum Beispiel kann die oben Isolierung und Färbeprotokoll zur Sortierung von spezifischen Populationen von denen mRNA isoliert, um die Genexpression analysiert werden können erleichtern. Darüber hinaus können einfache Änderungen des Protokolls stattfinden, um ex vivo-Behandlung von Geldautomaten zu ermöglichen. Solche Änderungen würden unter Verwendung sterilen Techniken, um den SVF, die dann gewaschen würde zweimal gewaschen und in einem geeigneten Zellkultur-Medien zu erhalten. Anstatt Zugabe fluorophorkonjugierten Antikörper gegen Zelloberflächenantigene Fleck kann der SVF zu nicht behandelten Zellkulturplatten hinzugefügt werden, um für Geldautomaten über Kunststoffadhärenz bereichern (obwohl dies nicht behauptet werden kann, um eine reine Population als Fibroblasten und Präadipozyten auch halten kann werden ). Dies wird durch das Kultivieren der SVF für 2-4 Stunden bei 37 ° C durchgeführt, gefolgt von zwei Waschschritten, um nicht adhärente Zellen zu entfernen. Geldautomaten kann dann entsprechend behandelt werden geerntet und mit einem EDTA-basierte Zelldissoziationslösung soLösung für die Durchflusszytometrie oder lysiert in Trizol oder RIPA-Puffer für die Isolierung von RNA oder Protein. Unabhängig von der nachgeschalteten Anwendung setzt die Kollagenase Digest Technik zur Isolierung von Adipozyten und SVF Zellen zunächst durch Rodbell 1964 1 beschrieben ein unschätzbares Werkzeug zur Charakterisierung von AT Immunzellen und ihren Beitrag zu den metabolischen Konsequenzen der Adipositas sein.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
JSO durch ein NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040) unterstützt wird, ist AK durch ein Postdoc-Stipendium von der American Diabetes Association (7-10-MI-05) unterstützt und wird durch einen AHH American Heart Association Gegründet Investigator Awards unterstützt (12EIA8270000). Durchflusszytometrie Experimente wurden in der VMC Durchflusszytometrie Shared Resource durchgeführt. Der VMC Durchflusszytometrie Shared Resource wird von der Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
| mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
| V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents. |
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References
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- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
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