Summary
Yağ dokusu (AT) yoğun bağışıklık hücre aktivasyonu ve etkileşim bir sitedir. Bağışıklık sisteminin hemen hemen tüm hücreleri AT mevcut olan oranını obezite etkilenir. Bağışıklık hücre popülasyonlarının AT uygun izolasyon, miktar ve karakterizasyonu immunometabolic hastalık rolleri anlamak için önemlidir.
Abstract
Obez kemirgenler ve insanların yağ dokusunda artış makrofaj infiltrasyonu (AT) keşfinden lokal ve sistemik insülin direnci ile bağışıklık hücre katkı ilgi yoğunlaşmasına yol açmıştır. Yalın ve obez AT farklı bağışıklık hücre popülasyonlarının izolasyonu ve miktar şimdi immunometabolism laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılan bir tekniktir; henüz çok dikkatli elde edilen verilerin güvenilir ve yorumlanabilir bir şekilde stromal vasküler hücre izolasyonu ve akım sitometri analizi hem alınmalıdır . Bu videoda, kıyma sindirmek ve bağışıklık hücre ile zenginleştirilmiş stromal vasküler kısmını izole nasıl gösterilmektedir. Daha sonra, biz antikor etiket makrofajlar ve T lenfositler ve nasıl akım sitometri deneylerde onlara doğru kapı için nasıl gösterir. Az yağlı beslenen yalın ve yüksek yağ ile beslenen obez fareler Temsilcisi akım sitometri araziler sağlanmaktadır. Bu analizin önemli bir unsuru, mutlaka antikorların kullanımımakrofajlar AT doğal autofluorescent kanallar, hem de uygun tazminat kontrollerin kullanımı floresan değil.
Introduction
Tarihsel olarak, yağ dokusu (AT) enerji dengesi yanıt olarak genişler ve sözleşmeleri lipid depo, bir asal organı olarak incelendi. Şimdi AT aktif doğrudan beslenme davranışları ve sistemik glikoz dengesini etkileyen hormonlar, bir dizi salgılar dinamik bir endokrin organı temsil anlıyorum. Buna ek olarak, son on yıl içinde stromal vasküler fraksiyonu (SVF) yanı sıra, homeostasis katkıları için AT ikamet eden bağışıklık hücrelerinin çok sayıda nüfus için artan bir takdir olmuştur.
Ilk olarak 1964 1'de Rodbell tarafından tanımlanmıştır adiposit ve SVF bir kollajenaz sindirimi kullanma yeteneği ayrı ve ardından diferansiyel santri. Kollajenaz II genellikle adiposit insülin reseptörlerinin 1 bakım nedeniyle adiposit ve SVF ayrılması için kullanılır. AT erken, enzimatik fraksiyon öncelikle adipo çalışma istihdam edildimetabolizması Eritrosit ve preadipositlerden izole etmek. Daha yakın zamanlarda, akış sitometrelerinde yaygın olarak kullanılması ve ticari fluorofor-konjuge antikor giderek artan sayıda ile birlikte bu teknik, bağışıklık hücrelerinin AT karakterizasyonu kolaylaştırmıştır.
AT iltihaplı bağışıklık hücrelerinin varlığı daha önce 2 tarif edilmiş olmasına rağmen, Weisberg ve arkadaşlarının seminal kağıtları. Xu ve ark. yayınlanan 2003 yılında inflamatuvar sitokinler salgılarlar ve AT-özel ve sistemik insülin direnci 3,4 ile ilişkili obezitede makrofajlar AT birikimi (ATM), belgelemek için ilk idi. Bu gözlemler soruşturma yeni bir alan temelinde son zamanlarda, "immunometabolism," 5 icat olarak görev yaptı ve dendritik hücreler 6, mast hücreleri 7, T hücreleri 8 dahil olmak üzere çeşitli bağışıklık hücre popülasyonlarının, karıştığı çalışmalarla takip edilmiştir -10, 11 B hücreleri, NKT hücreleri, 12, 13 eozinofiller ve nötrofiller obezite ilişkili insülin direncinin geliştirilmesinde 14,15.
Bu makalenin amacı SVF AT hücreleri izole etmek ve ATM karakterize ve akış sitometri ile T hücreleri AT için kullanılan kollajenaz özeti tekniğin ayrıntılı bir açıklama sunmaktır. Bu protokol AT fare için optimize edilmiştir, ancak, izleyiciler 16 AT insan için bu tekniğin optimizasyonu hakkında geniş detay veren mükemmel bir makale okuyarak yararlanabilir. Bu makalenin hedef kitlesi sınırlı deneyimi AT fare ile çalışan ve akım sitometri performans ile araştırmacılar içerir. Zaman ve kaynak ile hücresel verim ve canlılığı dengelemek için birkaç pratik hususlar bağışıklık hücre popülasyonlarının AT tanımlamak için de en uygun akım sitometri kontrol grubu olarak sunulmaktadır. Protokolde ek olarak, okuyucu referr vardıruygun kontrolleri ve tazminatlar 17 dahil etmek akım sitometri teknik yönlerini bazı mükemmel bir tartışma için Basu ve ark. tarafından yapılan son vallahi makaleye ed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reaktifler ve Malzemeleri
Bundan önce deneysel protokol başlamadan, aşağıdaki reaktifler hazırlamak:
- % 70 etanol
- 1X PBS
- 1X DPBS (Ca ve Mg olmadan),% 0.5 BSA ile takviye edilmiş
- FACS tamponu: 1X DPBS (Ca ve Mg), 2 mM EDTA,% 1 FCS
- ACK tamponu: 150 mM NH4CI, 10 mM KHCO 3 ve su içinde 0.1 mM EDTA Na2
2. Yağ Doku Hasat ve Hazırlık
- Her kurumun özel IACUC onaylı prosedürlere göre fareler Euthanize.
- Iyice% 70 etanol ile kürk ıslak.
- Kılıç şeklinde sürecinin seviyesinde (sternum alt kısmında) bir kesi yapmak ve herhangi bir büyük kan damarları sever özen, kalp ortaya çıkarmak için göğüs boşluğu açın.
Not: Bu noktada, kadar diyafram olduğu gibi bırakmak da yararlı olurmümkün ve kan izin ve göğüs boşluğu dışına akmasına perfüzat için göğüs kafesinin sağ tarafında bir çentik kesmek için.
- Kan izin ve dolaşım sistemi kaçmak için perfüzat için sağ atrium klibi.
Not: AT obez fareler, aşırı perikard ile uğraşırken kalbe erişime izin vermek için kaldırılması gerekebilir.
- Forseps ile kalp tutun ve yavaşça apeks ile sol ventrikül içine bir iğne takın. Yavaş yavaş 15 ml steril PBS ile perfüze fare.
Not: akciğer doldurmak ve genişletmek başlar eğer perfüzyon oranını azaltın.
- Periton boşluğuna açın ve gonadal dokular önlemek için dikkatli kullanarak perigonadal yağ yastıkları kaldırın.
- Bir yağ pedler,% 0.5 BSA ile takviye edilmiş 2 mi 1X DPBS (Mg veya Ca) olmadan içeren buz üzerinde tekne ağırlığında ve ince parçalar halinde AT kıyma.
Not: başına AT miktarını sınırlandırın 1.2 g tekne tartın. AT miktarı 1.2 g aşarsa, iki tartmak tekne arasında eşit olarak bölmek.
- Buz üzerinde muhafaza edin örnekleri ve% 0.5 BSA, 10 mM CaCl2, ve 4 mg / ml kollajenaz, tip II ile desteklenmiş 1X DPBS içeren örnek hızında başına 3 ml kollajenaz sindirimi solüsyon hazırlanır.
3. Kollajenaz Sindirim
- Homojenat dökme edilir ve 1 ml DPBS (% 0.5 BSA) ve 3 ml kollajenaz sindirimi II çözeltisi ile tekne ağırlığında durulanarak 50 ml konik tüp aktarın.
- 20 dakika boyunca 37 ° C'de döner bir çalkalayıcı (200 devir) ° C Homojenat inkübe edin.
- Buz üzerinde konik tüpler ve yere 10 ml DPBS (% 0.5 BSA) ekleyin.
- 10 ml'lik bir pipet kullanılarak serolojik defalarca homojenatı Karışım, ve yeni bir 50 ml'lik konik bir tüp içinde 100 mikron filtre hücre süspansiyonları geçmektedir.
- 4 ve D 'de 10 dakika boyunca 500 xg'de hücre süspansiyonu santrifüjörneğin; C.
- Durusu süpernatant ve tekrar süspansiyon SVF hücre pelet 3 ml ACK tampon eritrositlerin kirletici lyse.
- 4, 10 dakika boyunca 500 xg'de 12 ml FACS tamponu ve santrifüj hücre süspansiyonu ekleyin ° C
- FACS tampon Durusu süpernatant ve tekrar süspansiyon SVF hücre pelet.
Not: hücre pelet 50 ml konik tüp alt kapsıyorsa, 0.5-1 ml FACS tampon kullanmak içeri tekrar süspansiyon ne kadar FACS tampon için bir kılavuz olarak hücre pelet boyutu kullanın, aksi halde, 0,25-0,5 tekrar süspansiyon haline getirin ml.
- Yer buz üzerinde örnekleri ve karışım 40 ul FACS tampon maddesi, 50 ul tripan mavisi çözeltisi (% 0.2) ve 10 ul hücre süspansiyonu ile hücre sayımı için her bir numunenin 1:10 seyreltme alikotları hazırlamak.
- Tripan mavi dışlama göre canlı hücre sayımı ve 5-10 x 10 6 hücre / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar hücre süspansiyonları seyreltin.
4. Hücre Yüzey Antijen boyanması
Not: Örnek olarak, F4/80 ve CD11b, aşağıdaki tazminat ve FMO kontroller dayalı ATM oranı miktarının zaman hazırlıklı olmak gerekir:
- Boyanmamış (hücreler)
- DAPI veya propidium iyodür (PI) tek leke (hücre; adım 5.1 kadar canlılığı boya eklemeyin)
- F4/80 APC leke tek (hücre veya tazminat boncuk)
- CD11b FITC (tek hücreler veya leketazminat boncuk)
- FMO 1 (hücre): Rat IgG2a κ izotip kontrol APC + CD11b FITC + canlılığı boya (adım 5.1 eklenir)
- FMO 2 (hücre): F4/80 APC + Rat IgG2b κ izotip kontrol FITC + canlılığı boya (adım 5.1 eklenir)
- (Reajanlar ve malzemeler, Tablo bakınız) uygun konsantrasyonda fluorofor konjuge birincil antikor ve / veya izotip kontrolleri ekleyin.
- 30 dakika 4 ° C'de ışık ve inkübe örnekler koruyun.
- 4, 5 dakika boyunca 500 x g'de 2 ml FACS tamponu ve santrifüj hücre süspansiyonu ekleyin ° C
- 2 ml FACS tamponu içinde tekrar süspansiyon ve süzün süpernatant SVF hücre pelletini.
- ≥ 400 ul FACS tamponunda 5 4 ° C de dakika ve tekrar süspansiyon SVF hücre pelletini için hücre süspansiyonu 500 x g'de santrifüjleyin.
- 35 mikron hücre süzgecinden tüp üstleri ile donatılmış 12 x 75 mm polistiren yuvarlak alt tüplere örnekleri aktarın.
- 4 ışık, ve mağaza örneklerinden koruyun ° C FACS analizi kadar.
Not: En iyi sonuçlar için hücreler immeadiately analiz edilmelidir, ancak, bu protokol ile FACS analizi başarılı bir şekilde 4 ° C de 1-2 saat FACS tampon saklanan etiketli hücreleri üzerinde yapılmıştır Hücreler depolama süresi artırmak için sabit olması gerekiyorsa, etiketli hücreleri FACS analizden önce 24 saat 4 de 2% paraformaldehid ° C ile tespit edilebilir. Antikor şirketleri etiketli hücreleri bir haftaya kadar saklanabilir öneririz, ancak bu işlem kapsamında test edilmemiştir.
5. FACS Analizi
- Önce FACS analizi, ölü / canlı hücre ayrımı sağlamak için örnekleri ve uygun kontrollerin için canlılığı boya ekleyin.
Not: Çok sayıda canlılığı boyalar ticari olarak mevcuttur, ancak DAPI ve PI uyarma / emisyon prof bağlı olarak tavsiye edilirfluorofor-konjuge antikor iles kullanılmaktadır. DAPI ve propidyum iyodür 0.2 mg / ml 'lik bir son konsantrasyonda her numuneye eklenir.
- İlgi hücre popülasyonu (ler) ölçeği üzerinde, böylece yan dağılım (SSC) ve öne dağılım (FSC) ayarlamak için, deney örnekleri, aynı doku izole boyanmamış bir negatif kontrol örneği, tercihen de hücreleri kullanır.
Not: SVF hücrelerin AT analizi için, SSC doğrusal bir ölçekte FSC karşı bir günlük ölçekte görüntülenir önerilir. Genellikle çok büyük ve taneli olan ATM'ler, analiz ederken SSC için bir günlük ölçek kullanımı özellikle önemlidir.
- Analiz edilen hücre (ler) türüne göre bir ilk ışık yayılımı kapısı çekmek ve lekesiz hücreler kadar (yaklaşık 10 2 merkezli) bir tek parametre histogram sol üzerinde olacak şekilde photomultiplier tüp (PMT) kazancı ayarlayın uygun kanallar için. </ Li>
Not: Bu lenfositler ve makrofajlar (veya diğer miyeloid hücreleri) nedeniyle otofloresans farklılıkları ayrı ayrı analiz edilmesi tavsiye edilir.
- Çok renkli tazminat gerçekleştirmek için tek lekeli denetimleri veya antikor yakalama tazminat boncuk kullanın.
Not: tazminat boncuk kullanılması tavsiye edilir, ancak, her antikor uyumluluğu sağlanmalıdır. Örneğin, kompanzasyon boncuk izole edilmiş hücreler, uygun bir tek leke kontrol elde etmek için gerekli olduğu durumda, tavşan antikorları ile çapraz reaksiyona olmayabilir.
- Modifiye FMO kontroller dayalı deneysel kapıları ayarlayın.
- Ilgi nüfusunun yaygınlığı dayalı olayların uygun sayıda toplamak ve deneysel veri kaydetmek için akış sitometresi ayarlayın.
- İhracat FCS veri çevrimdışı analiz için dosyaları. Akış cytometr için çok sayıda program vardıry veri analizi. Biz Cytobank, investigatores internet erişimi 18 olan herhangi bir bilgisayardan rakamlar saklamak ve analiz veri ve oluşturmak sağlayan bir web-tabanlı bir platform tavsiye ederiz. Ayrıca, Cytobank veri kamu erişilebilir yapmak veya ortak erişimi kısıtlamak için olanağı sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Diferansiyel santrifüj takip AT kollajenaz sindirim az yağlı (yağ% 10 kcal) veya yüksek yağ (yağ% 60 kcal) diyet (LFD ve YYD beslenen erkek C57BL/6J farelerin epididim yağ yastıkları gelen SVF izole etmek için kullanıldı sırasıyla) 16 hafta boyunca. SVF hücreleri, daha sonra FACS analizi ile uygun bir ATM (Şekil 1) ve T-hücreleri (Şekil 2) oranını ölçmek için bir fluorofor konjuge primer antikorlar ile işaretlenmiştir. Işık yayılımı, çift ayrımcılık ve canlılığı kapıları da dahil olmak üzere ilk yolluk, Şekil 1A ve 2A tasvir edilmektedir. Anlaşılacağı üzere, şekil 2A'da ilk ışık saçma kapı autofluorescent miyeloid hücreler de dahil olmak üzere önlemek amacıyla lenfosit popülasyonu ile sınırlı olduğu vurgulanmalıdır. Modifiye FMO kullanımına bir örnek Şekil 1B gösterilmiştir deneysel kapıları ayarlamak için kontrol eder. Bu örnekte, F4/80 (sol kolon) ile CD11b (sağ kolon) antikorları otofloresans ve non-spesifik bağlanma için hesabına uygun izotip kontrolleri ile değiştirilir. Quadrant kapıları daha sonra belirlemek için çizilir uygun ATM (F4/80 + CD11b +). CD4 + T hücreleri ve CD8 + AT için yolluk Şekil 2B'de gösterilmiştir. Lenfositler AT Canlı TCRβ için ilk kapılı (sol sütun). Daha sonra, TCRβ + AT T hücreleri CD4 ve CD8 (sağ sütun) için kapılı.
Şekil 1. Yağ dokusu makrofajlar. SVF erkek C57BL/6J farelerin AT epididim izole edilmiştir kollajenaz özet protokolünü kullanarak 16 hafta için az yağlı ya da yüksek yağlı diyet beslenen. Subsekim, SVF F4/80 hücre ve CD11b için boyandı ve FACS analizi ATM belirlemek için bir akış sitometrisi kullanılarak gerçekleştirildi. (A) İlk ışık saçılımı ve canlılığı kapıları. (B) Modifiye FMO F4/80 ve CD11b'nin için izotip antikor içeren kadran kapıları hizalamak için kullanılmıştır kontrol eder. (C), AT düşük yağ ve yüksek yağ ile beslenen fareler F4/80 + CD11b + ATM oranı karşılaştırılması. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Yağ dokusu T hücreleri. SVF erkek C57BL/6J farelerin epididimal yağ dokusu izole edildi t ile 16 hafta için az yağlı ya da yüksek yağlı diyet besleneno kollajenaz sindirmek protokolü. Daha sonra, SVF TCRβ hücreleri, CD4 boyandı ve CD8a ve FACS analizi T hücrelerini karakterize etmek için bir akış sitometresi kullanılarak gerçekleştirildi. (A) İlk ışık saçılımı ve canlılığı kapıları. En oranının (BC) Karşılaştırma TCRβ + T hücreleri (sol sütun) ve CD4 + ve CD8 (B) az yağlı ve (C) yüksek yağ beslenen farelerin AT. Gelen + T hücreleri (sağ sütun) için tıklayınız büyük rakam görmek .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Obezite metabolik sonuçlara bağışıklık sisteminin rolü artan ilgi AT bağışıklık hücreleri karakterize etmek için flow sitometri yaygın kullanımı yol açmıştır. Tam protokolü kendi deneyim ve ekipmanları mevcut dayalı laboratuarlar arasında farklılık olsa da, kritik adımlar kollajenaz sindirim, diferansiyel santrifüj, ve hücre yüzey antijeni etiketleme içerir. Bu makalenin amacı AT ve / veya akım sitometri performans ile çalışan sınırlı deneyimi ile araştırmacılara SVF AT ve izolasyonu için ayrıntılı bir protokol ve pratik bir rehber sağlamaktır.
Herhangi bir deney tekniği olduğu gibi, ya da önemli ölçüde istenilen sonucu etkileyebilir olmayabilir pek çok çeşitleri vardır. Bizim deneyime dayalı, protokol ayrıntılı Burada zaman, kaynak, hücresel verimi ve hücre canlılığı arasında en etkili takas temsil eder. Örneğin, bu artan buldukkolajenaz benzer konsantrasyonlarda kollajenaz sindirimi II süresine kadar 60 dakika hücre verimi üzerinde ihmal edilebilir bir etkiye sahiptir, bu yüzden, böylece kolajenaz maruz kalma süresini azaltmak için bir 20 dakika sindirim kullanmaktadır. Kollajenaz II yağ dokusu sindirim için en sık kullanılan kollajenaz olduğunu. Farklı kolajenazlar ve birincil kullanım tüm açıklaması Sigma web sitesinde bulunabilir. Yukarıdaki protokol tipik hücresel verimi 2-3 degil 10 6 ve 4-5 farelerden alınan AT 6 hücre / g az yağlı (yağ% 10 kcal) ve yüksek yağ (yağ% 60 kcal) diyetle beslenen x 10 16 hafta, sırasıyla. Kollajenaz sindirimi farklı zamanlarda ek olarak, diyet tedavisi de dahil olmak üzere, kullanılan deneysel modele bağlı olarak mevcut protokole potansiyel değişiklikler vardır. İlk olarak, kolesterol veya doymuş yağ asitleri için zenginleştirilmiş bir diyetle beslenen farelerden alınan AT hasat zaman, A çünkü kıyma için buz örnekleri önce tutmaktan kaçınınT kuvvetlendirmek ve kıyma zor yapacaktır. İkincisi, bizim protokol bir eritrosit lizis adım (3.6) içerir, ancak, başarılı bir ilk perfüzyon genellikle bu adımı gereksiz kılar. Üçüncü olarak, bakım kollajenaz sindirimi çözeltisi (5 mM son konsantrasyon) CaCl2 daha fazla, 10 mM ekleme alınmalıdır; yüksek kalsiyum konsantrasyonları, kalsiyum fosfat çökelti oluşmasına neden olabilir. Bu çökelti, santrifüj ilk adım (3.5) aşağıdaki biçimlerde ise, çökelti kaldırmak için eritrosit lizis aşamasından önce 20 ml FACS tampon maddesi (EDTA ihtiva eden) ile iki adet yıkama adımları ekleyin. Dördüncü olarak, SVF izole zaman araştırmacılar en az bir bütün perigonadal yağ yastığı kullanmanızı öneririz. Biz çünkü hücresel verim sınırlamalar bu öneri yapmak, ancak çeşitli hücre popülasyonlarının 19 farklı bölgesel dağılımları görüntülemek için. Perigonadal yağ yastığı sadece bir kısmını bize olduğunda Böylece, sonuçlar önyargılı olabilired AT ikamet eden bağışıklık hücreleri izole etmek için. Tüm yağ yastığı 1.2 gram daha büyükse, kaudal ucuna rostral gelen boylamasına yağ dokusu bölün. Yarı bu şekilde bölünmüş, her bir yarım hücre Bir temsili vermelidir ve genel olarak 1.2 gramdan daha az olmalıdır. Bununla birlikte, bu durumda, yine daha fazla 1,2 gram olduğu, böylece ayrı bir tüp içinde 1.2 gram bölümlerinin kolajenaz sindirim performans tavsiye ve daha sonra akış sitometrisi için SVF tüm hücreler birleştirilir. Buna ek olarak, zayıf fareler için, akış sitometrik analiz için yeterli SVF hücreleri elde etmek için 2 ya da 3 farenin yağ pedleri birleştirmek için gerekli olabilir. Ek fareler için ihtiyaç deneyler tasarlarken göz önüne alınmalıdır. Son olarak, veri göstermek için başka bir yol gram doku başına hücre sayısı. Hücre yoğunluğu isteniyorsa, AT kıyma ve sindirim önce tartılarak edilmelidir.
Akım sitometri, iki ile SVF hücre AT karakterize ile ilgili olaraknoktalar vurgulanmalıdır. İlk olarak, tüm fluorofor-konjuge primer antikor SVF hücreleri AT ile kullanım için valide edilmelidir ve düzgün titre. Biz boncuk ile tazminat göstermesine rağmen, daha önce SVF AT ile bu antikorlar titre vardı. Makrofajlar karakterize, biz bu boyalar için konjuge antikorlar kullanırken biz ATM spesifik olmayan bağlanma ile ilgili karışık sonuçlar oldu gibi, (örneğin PE-Cy7) tandem boyaların kullanımına karşı tavsiye ederiz. Buna ek olarak, örneğin PE ve FITC gibi florofor olarak yukarıda tarif edildiği gibi dikkatli bir titrasyon sonrasında kullanılmalıdır. Biz sık önerilen konsantrasyonları ile birlikte SVF hücre karakterize etmek için kullanılan özel bir antikor listesi Tablo 1'de verilmiştir bulunabilir. Yüksek konsantrasyonda kullanıldığında ATM sergi güçlü otofloresans ve antikorlar bir dizi spesifik olmayan bağlanma düşük bir seviye göstergesi çünkü İkincisi, biz modifiye FMO en kullanımı deneysel kapıları ayarlamak için kontrol önerilir.FMO kontroller deney numuneleri 20 etiketlemek için kullanılan antikorların tüm ama biri ile kontrol numuneleri kümesi boyanması tarafından oluşturulur. Biz uygun fluorofor-konjuge izotip kontrol yerine sadece çıkarmadan ile antikorların bir yerine bizim protokolde FMO kontrolleri değiştirdiniz. Uygulamada, pozitif ve negatif nüfus arasındaki olağanüstü ayrımı sağlayan antikorlar için FMO kontrol vazgeçmek için kabul edilebilir. Bu kontrollere ek olarak, ileri ve yan dağılım dayalı lenfosit ve makrofaj nüfus için bu antikorlar üzerinde yolluk önce, biz ön seçilmiş notu olacaktır. Bu FITC ve tandem boyalar gibi fluorophores lenfosit nüfus analiz bu autofluorescent makrofaj algılama ortadan kaldırır.
Ayrıntılı protokoller bu makalenin kapsamı dışındadır olmasına rağmen, açıklanan izolasyon tekniği karakteristik amaçlayan çok sayıda teknikleri için önemli bir ilk adım olarak hizmet vermektedirAT ikamet eden bağışıklık hücrelerinin terizing. Örneğin, yukarıda izolasyonu ve boyama protokolü mRNA gen ekspresyonunu analiz etmek için izole edilebilir belirli popülasyonlarının sıralama kolaylaştırmak için kullanılabilir. Ek olarak, iletişim kuralı, basit modifikasyonlar ATM Ex vivo tedavi izin vermek için yapılabilir. Bu tür modifikasyonlar, daha sonra iki kez yıkandı ve uygun bir hücre kültür ortamı içinde yeniden süspansiyon haline olacağını SVF, elde etmek için steril teknikler kullanılarak içerir. Daha ziyade hücre yüzey antijenleri leke fluorofor-konjuge antikor eklenerek bu daha da uygun olabilir fibroblastlar ve preadipositlerden olarak saf bir nüfus olduğu iddia edilemez ancak, SVF (plastik uyum sağlayarak ATM zenginleştirilmesi için arıtılmamış doku kültür plakaları eklenebilir .) Bu düzenlemeye göre, 37 saat boyunca 2-4 SVF gerçekleştirilir ° C yapışmayan hücreleri çıkarmak için iki yıkama işlemi takip eder. ATM buna göre tedavi ve EDTA-tabanlı cep ayrışma kadar kullanılarak hasat edilebilirakış sitometrisi veya sırasıyla RNA ya da proteininin izolasyonu için Trizol veya RIPA tamponu içinde lize için şu ya. Ne olursa olsun aşağı uygulamanın, ilk 1964 1 Rodbell tarafından açıklanan adipositlerde ve SVF hücreleri izole etmek için kollajenaz özet tekniği bağışıklık hücreleri ve obezite metabolik sonuçları katkıları AT karakterizasyonu için çok değerli bir araç olmaya devam etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
JSO bir NIH Ruth L. Kirschstein NRSA (F32 DK091040) tarafından desteklenen, AK Amerikan Diyabet Derneği (7-10-MI-05) bir Doktora Sonrası Araştırma Bursu tarafından desteklenen ve AHH bir Amerikan Kalp Derneği Kurulmuş Araştırmacı Ödülü tarafından desteklenmektedir (12EIA8270000). Akış sistometri deneyleri VMC Sitometrisi paylaşılan kaynak yapılmıştır. VMC Sitometrisi Paylaşılan Kaynak Vanderbilt Sindirim Hastalıkları Araştırma Merkezi (DK058404) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
| mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
| V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents. |
|||
References
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
- Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
- Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
- Mathis, D., Shoelson, S. E.
- Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
- Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).
- Feuerer, M., et al. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).
- Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
- Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).
- Wu, L., et al. Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).
- Wu, D., et al. Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis. Science. 332, 243-247 (2011).
- Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
- Talukdar, S., et al. Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).
- Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
- Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).
