Summary
Apresenta-se um ensaio de migração de células ex vivo que permite a quantificação precisa do potencial de migração de células de crista neural entérico na presença de vários factores de crescimento.
Abstract
Células da crista neural (NCC) é uma população de células multipotentes transitória e que se origina a partir do tubo neural dorsal e migra extensivamente em todo o embrião de vertebrados em desenvolvimento. Além de proporcionar a glia e os neurónios periféricos, NCC gerar melanócitos, bem como a maior parte do esqueleto crânio-faciais. A migração e diferenciação NCC é controlada por uma combinação da sua origem axial ao longo do tubo neural e sua exposição a estímulos extracelulares regionalmente distintas. Tal contribuição de ligandos extracelulares é especialmente evidente durante a formação do sistema nervoso entérico (ENS), uma rede de complexo interligado de gânglios neurais que controla localmente (entre outras coisas) o movimento do músculo do intestino e motilidade intestinal. A maior parte do ENS é derivado a partir de um pequeno conjunto inicial de NCC que empreender um longo percurso, a fim de colonizar - num rostral para caudal moda - todo o comprimento do intestino prospectivo. Entre as várias vias de sinalização conhecidosinfluenciar colonização NCC entérico, GDNF / sinalização RET é reconhecido como o mais importante. Na verdade, a secreção de espaço-temporalmente controlada do RET ligante GDNF pelo mesênquima intestino é o principal responsável para a atração e orientação de expressar-RET entérico NCC para e dentro do intestino embrionário. Aqui, nós descrevemos um ensaio ex vivo, a migração de células, fazendo uso de uma linha de ratinho transgénico possuindo marcado por fluorescência NCC, que permite a quantificação precisa do potencial de migração entérico NCC na presença de vários factores de crescimento, incluindo o GDNF.
Introduction
Células da crista neural (NCC) são um tipo de célula transitória única de vertebrados que forma muitos derivados durante o desenvolvimento do embrião. Esta população de células surge na fronteira da placa neural, ao lado ectoderma não-neural 1. Durante neurulação, curvatura da placa neural NCC lugares ao longo do bordo dorsal do tubo neural formando. NCC então sofrer uma transição epitelial-mesenquimal, segregar e migrar para longe do tubo neural. NCC colonizar várias estruturas embrionárias, incluindo o tracto digestivo onde formam todo o sistema nervoso entérico (ENS), uma rede interligada de gânglios neurais embutido na parede do intestino. Como recentemente revisou de 2,3, muitos genes foram envolvidos no desenvolvimento desta estrutura intrincada.
A maior parte do ENS é derivado de uma pequena piscina de NCC proveniente do tubo neural vagal (ou seja, em torno do potencial limite rombencéfalo / medula espinal) 4.Estes progenitores neurais chegar ao intestino anterior em torno do dia embrionário (e) 9,0 em ratos e depois migrar caudalmente dentro do mesênquima intestino até aproximadamente e15.0 para colonizar todo o intestino embrionárias. Um subconjunto menor de células progenitoras neurais cólon também é fornecida por sacral NCC, que invadem o intestino posterior na direcção oposta até ao ceco 4. Ambos vagal e sacral NCC requerem múltiplos migração, proliferação, sobrevivência e-sinais de promoção de diferenciação para garantir a formação completa do ENS. A este respeito, os modelos animais - especialmente ratos geneticamente modificados - têm sido fundamentais para a identificação de vários ligandos extracelulares essenciais: GDNF (factor neurotrófico derivado de células gliais),,, (proteínas morfogenéticas do osso) BMPs neurotrofina-3 endotelina-3, Netrin , assim como Sonic e indiano Hedgehog (Shh e Ihh) 5-10. Destes, o GDNF a sinalização através de RET receptor transmembranar da tirosina quinase (Rearranged durante a transfecção), é reconhecido como the caminho mais crítico para a atração e orientação do NCC e para dentro do intestino embrionário. O GDNF é secretada pelo mesênquima intestino e forma um gradiente rosrrocaudal espaço-temporalmente controlado, que é directamente quimioatratante para entérico NCC, que expressam RET 11,12.
Entre outras funções, o ENS regula o movimento no interior do tracto digestivo através da sua interacção com o músculo liso na parede intestinal. Ausência de gânglios neural na região terminal dos resultados intestinais na doença de Hirschsprung: a contração tônica do segmento afetado leva ao bloqueio, a acumulação a montante do material digerido e distensão maciça do intestino e abdômen. Doença de Hirschsprung ocorre cerca de um em 5.000 nascidos vivos. O padrão de migração rostro-caudal de entérico NCC é acreditado para ser o principal fator de contribuição à etiologia da doença de Hirschsprung. O cólon, mais afastada da fonte de migrar NCC e última porção de bowel a ser colonizada, é mais suscetível a defeitos na formação ENS. De acordo com o seu papel crucial na migração NCC entérico, a interrupção da sinalização GDNF / RET é a principal causa genética conhecida da doença de Hirschsprung 13.
Para melhor estudar NCC e desenvolvimento ENS, geramos uma linha de camundongo transgênico - chamado Gata4p [5kb]-GFP 14 - em que migratório NCC são rotulados com Proteína Fluorescente Verde (GFP). A seguir, aperfeiçoou um ensaio ex vivo, a migração celular, adaptado a partir de trabalhos publicados por outros grupos 11,12,15, que agora permite a quantificação precisa do potencial de migração entérico NCC na presença de vários factores de crescimento, tais como o GDNF.
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Protocol
Declaração de Ética
Experimentos envolvendo camundongos foram realizadas seguindo Conselho Canadense de diretrizes de cuidados com animais para o cuidado e manipulação de animais utilizados em pesquisas médicas. Protocolos que envolvem a manipulação de animais foram aprovados pelo comitê de ética institucional da Universidade do Quebec em Montreal (Comité Institutionnel de Proteção des Animaux; número de referência 0512-R3-650-0513).
1. Preparação de Colágeno Gel
Trabalhar de forma estéril, sob uma capa de cultura de tecidos.
- Prepare completa 5x DMEM (meio essencial modificado de Eagle), incluindo antibióticos padrão. Dissolve-se 3,37 g de pó de DMEM e 0,925 g de NaHCO3 em 20 ml de água. Esterilizar por passagem através de um filtro de 0,22 um. Adicionar 2,5 ml de solução estéril de 100x de penicilina / estreptomicina e 25 ml de soro fetal bovino inactivado pelo calor estéril. Armazenar a 4 ° C.
- No gelo, misture 800 mLO colagénio de solução I (3,77 mg / ml em 0,02 N de ácido acético, esterilizada por filtração), 600 ul de DMEM completo 5x e 17 ul de NaOH 1 N. Dilui-se com água estéril para um volume final de 3 ml. Incluir fatores de crescimento relevantes na mistura. Normalmente, utilizar o GDNF a 10 ng / ml para estimular a migração NCC entérico.
- Depositar cerca de 480 mL em cada poço de uma única linha de uma placa de 24 poços. Evite bolhas. As restantes linhas pode ser usado para testar os efeitos de outros factores de crescimento sobre a migração das células.
- Deixe o colagénio polimerizam, pelo menos, 1 hora numa incubadora esterilizada, a 37 ° C.
2. Dissecção de Animais 16
- Configure acasalamentos e verificar se há plugs vaginais na manhã seguinte. E0.5 Day sendo meio-dia no dia a ficha vaginal for encontrado, isolar a fêmea e esperar 12 dias até E12.5.
- Anestesiar ratos grávida com isoflurano e eutanásia por inalação de CO 2.
- Pulverizar o mouse com etanol 70%. Levante as s abdômenparentes e abrir a cavidade abdominal com uma tesoura de dissecação.
- Remover o útero para uma placa de Petri de vidro cheio com PBS gelado (soro fisiológico tamponado com fosfato). Corte o útero transversalmente entre inchaços deciduum individuais para isolar cada local de implantação do embrião.
- Trabalhar em cada local de implantação separadamente em outra placa de Petri de vidro cheio de PBS gelado. Sob um microscópio de dissecação, utilizar uma pinça fina para remover a camada muscular do útero.
- Abrir o saco vitelino visceral e âmnio para revelar o embrião. Tome cuidado ao cortar os vasos sanguíneos se juntar o embrião para a placenta / visceral saco vitelino, como eles estão interligados com os intestinos em desenvolvimento.
- Cortar a cabeça do embrião no pescoço.
- Insira um fórceps fechadas na cavidade abdominal de um embrião, logo acima do fígado de cor vermelho escuro e deixar a pinça aberta de si mesmo (deixar de aplicar pressão) para fazer uma abertura transversal na cavidade abdominal. Puxe as pinças abertas para baixo em direçãoa extremidade posterior do embrião para abrir completamente o abdómen.
- Pegue o tecido conjuntivo por trás do fígado e puxar as tripas para fora do abdômen, tomando cuidado para não quebrar o intestino (cólon é ligado ao ânus).
- Cortar o cólon para libertar as entranhas do resto do embrião. O corte pode ser feito em qualquer local ao longo do cólon. Reserve a parte da cauda para mais tarde.
- Tease do tecido conjuntivo a partir do ceco, em seguida, o resto dos intestinos. Tenha cuidado para não ferir os intestinos ao fazê-lo.
- Cortar o fígado e estômago (na extremidade rostral do intestino delgado), bem como os mesonefros e cristas genitais, se algum estiver presente.
- Isolar o intestino delgado. Mais uma vez, tome cuidado para não cortar o intestino. A partir de agora, a orientação rosrrocaudal do tecido intestinal pode ser monitorado usando a curvatura acentuada presente na extremidade rostral. Deixar o intestino delgado em PBS à temperatura ambiente durante um tempo tão curto quanto possível, antes de incama (veja o passo 3.3).
- Por fim, registrar o número de somitos cauda para cada embrião para determinar com precisão o estágio de desenvolvimento embrionário.
3. Seccionamento das embrionárias Intestines
- Antes de prosseguir com a dissecção de embrião, derreter 1,5 g de agarose em 100 ml de PBS (solução salina tamponada com fosfato) e manter a 50 ° C.
- Despeje agarose fundida num molde de incorporação (por exemplo, um sistema fechado de 2 ml tubo de microcentrífuga que foi cortado longitudinalmente para excisar a cerca de 1/4 da parede do tubo). Deixe a agarose arrefecer para cerca de 42-45 ° C, deve ser apenas ligeiramente quente ao toque.
- Incorporar o intestino embrionário pouco antes das solidifica agarose (esta pode ser avaliada com fórceps dicas e irá ocorrer em torno de 36-38 ° C). Segurando o intestino com uma pinça pela extremidade rostral dobrado, puxá-lo muito lentamente através da agarose ao longo do comprimento do molde. Isso ajuda a manter o intestino reto, enquanto os conjuntos de agarose. Solte o temitir assim que começa a resistir a ser movido. Mantenha o controle da orientação rostral-caudal do intestino.
- Coloque o molde no frigorífico 2-3 minutos, para assegurar que a agarose completamente definido.
- Retire a agarose a partir do molde (deslizando-o para fora do tubo Eppendorf abertas). Com uma lâmina, retirar o excesso de agarose em ambas as extremidades, fazendo cortes perpendiculares para o intestino.
- Cole a extremidade rostral do intestino / agarose a bloquear-se na fase de metal de um micrótomo de lâmina vibrante. Aparar o excesso de agarose sobre os lados do bloco de intestino / agarose.
- Monte a fase de metal na câmara de micrótomo vibrando. Se necessário, ajustar o ângulo da fase de modo que o intestino é mais vertical possível (portanto, perpendicular à lâmina). Cobrir as amostras com PBS gelado. Traga a lâmina de micrótomo até alguns milímetros abaixo da superfície do buffer.
- Fazer 200 mM vibratome transversais cortes do intestino caudal-mais pequenos, garantindo que each fatia agarose contém uma seção intestinal completo.
4. Cultura da Intestinal explantes
- Gentilmente depositar o fatias intestino / agarose recém-cortadas plana para os géis de colágeno, com uma pinça, colocando uma fatia para o meio de cada poço.
- Incubar 3 dias a 37 ° C, em húmido 5% de CO2, para permitir a migração de NCC fora do explante.
- Leve as fatias de intestino / agarose fora do gel de colágeno muito delicadamente com uma pinça. Tome cuidado para não danificar o gel abaixo.
- Evitar tocar directamente o gel de colagénio, durante o tempo de incubação e de lavagem de passos subsequentes, a fim de garantir que o padrão de migração de células não é perturbado. Fixar com 500 mL de 4% PFA (paraformaldeído) (em PBS) por poço 1 hora à temperatura ambiente.
- Substituir o fixador com 500 mL de DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindole) de solução (5 ug / ml em PBS) por poço e incubar 10 min a temperatura ambiente.
- Lave cada poço 3xcom 500 ul de PBS durante 5 min.
- Fotografar as células fluorescentes (canais GFP e DAPI) incorporados no gel de colágeno dentro de cada poço.
5. Análise de Imagem
Fizemos uso extensivo de ImageJ 17 para processar e quantificar as imagens geradas após cultura explante.
- Comece imaginando um slide micrômetro com a mesma ampliação como as fotografias de células fluorescentes. Meça o comprimento de um mícron de pixels (utilizando a ferramenta linha reta).
- Defina a escala (Analyze / Set Scale, o número de entrada de pixels / micron).
- Para cada fotografia GFP fluorescência, mude o formato de imagem para 8 bits em tons de cinza (Image/Type/8-bit).
- Ajuste a intensidade do sinal (Imagem / Ajustar / Brilho / Contraste).
- Subtrair o ruído de fundo, se necessário (Processo / Subtrair fundo, ajustar o raio de bola rolando).
- Definir um limite para destacar as células e aglomerados de células (Imagem / Ajustar / Threshold), on aplicar um divisor de águas para dividir as touceiras (Processo / Binário / Bacia Hidrográfica).
- Analisar partículas para especificar regiões de interesse (ROI) e gerar estatísticas de número de células (Analisar / Analisar Partículas; tamanho conjunto mínimo de excluir restantes pixels).
- Definir opções de medida para incluir o diâmetro de Feret (Analyze / Definir Medidas).
- Grupo ROIs e medir como um todo para determinar o diâmetro de Feret, uma indicação de difusão celular (Análise / Ferramentas / ROI Gerente / Mais / OU, então Gerente de ROI / Adicionar e ROI Gerente / Measure).
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Representative Results
Os seguintes resultados são representativos do que pode ser obtida com a técnica descrita aqui (Figura 1). O uso de factores de crescimento (isto é, de GDNF) estimula a migração dos entérico NCC fora do explante intestinal e no gel de colagénio-expressando GFP (Figura 2). Embora algumas células sair do explante, na ausência de factores de crescimento, estes não são mais marcadas com GFP e representam entrada passiva. É necessário remover a fatia intestinal a partir do gel de colágeno, a fim de registrar os resultados, já que este tecido ainda é densamente povoada por células fluorescentes e, caso contrário, esconder as células que se encontram na colágeno embaixo. A quantificação destes resultados mostra que muitas mais células se encontram dentro do gel de colagénio quando o GDNF está presente, e que a migração activa tem lugar (Figura 3). Com efeito, as células passivas são encontradas imediatamente sob os explantes, dentro do diâmetro de uma fatia intestinal, wher eas células que invadem ativamente o gel de colágeno se afastar de seu ponto de origem e espalhar ainda mais.
Figura 1. Visão geral da técnica de cultura de explante. A) população uniforme fluorescente entérico NCC dentro da pequena região do intestino caudal usado para fazer 200 explantes μ de espessura. Barra de escala:. 200 mM B) O meio de cultura contendo o colagénio é depositada em placas de 24 poços e deixou-se endurecer durante 1 hora. Vibratome fatias de intestinos embrionárias embebidos em agarose são depositados sobre os géis (uma fatia por poço), e fluorescente entérico NCC são deixadas migrar para fora dos explantes durante 3 dias. As fatias são então retiradas antes de imagem das células que invadem os géis de colágeno.s/ftp_upload/50709/50709fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. A migração celular para fora do explante intestinal e no gel de colagénio. Células que migraram a partir de um explante intestinal durante a incubação de 3 dias na ausência ou na presença de 10 ng / mL de GDNF foram fixadas, coradas com DAPI (azul) e fotografado para mostrar marcado com GFP entérico NCC (verde). Ampliação 70X. Barra de escala: 100 um. A linha pontilhada representa o tamanho aproximado e localização do explante, antes de ser retirado do gel. Clique aqui para ver maior figura. Clique here para ver imagem ampliada.
Figura 3. Quantificação do potencial de migração entérico NCC. Número e spread (diâmetro de Feret) de células que expressam GFP migrando de explantes intestinais após 3 dias foi quantificado utilizando o software ImageJ 17. Em ambos os casos, existe uma diferença significativa entre as condições não tratadas e tratadas com GDNF de acordo com o teste t de Student (p <0,001, *). O diâmetro médio das fatias intestinais (linha preta pontilhada: 260 mM) foi incluído para distinguir entre a entrada e a migração passiva activo. NT: não-tratada, n:. Número de explantes processados Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Discussion
Nós mostramos como nosso ex vivo explante técnica de cultura pode ser usada para quantificar com precisão entérico potencial de migração NCC na presença de GDNF. Essa quantificação precisa é muito facilitada usando 200 seções vibratome intestino m de espessura em vez de grandes pedaços de tamanho aproximado, como descrito anteriormente 11,12,15. Na verdade, isso nos permite trabalhar com um número razoável de células em um ambiente altamente reprodutível. De nota, a distribuição uniforme de fluorescência entérico NCC dentro da região caudal-a maior parte do intestino delgado a partir do qual as fatias de explante são cortados também permite a análise de secções múltiplas de um único intestino (Figura 1A). Além disso, dado que tanto entérico NCC e axônios pode sair do tecido em tais ensaios 11, a retirada dos explantes no final do período de cultura nos permite focar exclusivamente migratório NCC.
A maioria das etapas críticas foram descritas no texto do protocolo, porém, como o welfare do explante intestinal é fundamental para a obtenção saudável migrando NCC, um cuidado especial deve ser tomado. Evitar sujeitar os tecidos embrionários a mudanças bruscas de temperatura, particularmente quando o intestino é incorporado em agarose (passo 3.3). Certifique-se que o intestino está na temperatura ambiente ea agarose tão legal quanto possível (mas ainda derretido) para evitar a "cozinhar" o tecido. O explante intestinal deve prosperar no gel de colágeno cheia de meio de cultura, muitas vezes, aumentando de tamanho e derramando-se da fatia de agarose. Se o explante parece insalubre ou pior, tende a perecer durante a incubação, tente substituir o PBS com meios de cultura à temperatura ambiente (por exemplo, HEPES-buffered M2 ou DMEM suplementado com 10% FBS) para ajudar a sustentá-lo durante a dissecção.
Uma das principais limitações para a nossa abordagem é que ela depende da disponibilidade de uma linha de rato conferindo uma etiqueta fluorescente para migrar NCC. Na ausência de tal recurso, um anticorpo contra migrating NCC (por exemplo, anti-Ret ou anti-SOX10) pode ser usado para marcar células que invadiram o gel de colagénio. Além disso, uma vez que o micro-ambiente do intestino é muito mais complexa do que um gel de colágeno simples, os resultados obtidos com este ensaio in vitro podem não refletir totalmente o comportamento de entérico NCC in vivo. Experimentos adicionais que envolvem imagens ao vivo de células são recomendados para avaliar esse comportamento. É também de notar que em adição ao seu papel como um quimioatractor, o GDNF é conhecido para promover a proliferação de migrar entérico NCC 4. Nossa medida de potencial de migração entérico NCC na presença de GDNF é, portanto, provavelmente uma mistura de migração de células e proliferação de células verdade, semelhante aos mecanismos in vivo, levando a colonização NCC dos intestinos. Se uma clara distinção entre estes dois processos é desejado, a adição de um bloqueador do ciclo celular (por exemplo, AZD 5438 18) no meio de cultura pode restringir a análise a migratio célulan.
Esta técnica pode ser expandida para testar vários outros ligandos extracelulares, bem como inibidores de vias específicas de sinalização, e qualquer combinação aí. Outros tecidos também pode, potencialmente, ser dissecado e seccionado, permitindo o estudo da migração NCC em muitas estruturas embrionárias. Combinado com romance e / ou linhagens de camundongos mutantes descaracterizados com possíveis defeitos de desenvolvimento NCC, a nossa técnica pode ser aplicada para a tela rapidamente para deficiências no comportamento migratório em resposta a eventos específicos de sinalização.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos Denis Flipo para o conselho de processamento e análise de imagem, e David W. Silversides em cujo laboratório a linha de rato Gata4p [5kb]-GFP foi gerada. Pesquisas em laboratório Pilon é financiado pelo CIHR, NSERC, FRQS e FRQNT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM powder | Wisent | 219-010-XK | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | Biotechnology grade |
| Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicilin-Streptomycin solution, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 095-150 | High quality grade |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | |
| NaOH | Bioshop | SHY700 | Diluted from 10 N stock then sterile-filtered |
| GDNF | Cedarlane | CLCYT305 | |
| Falcon 24-well Plate | BD biosciences | 353047 | |
| Dissecting scissors | Fisher Scientific | 089515 | |
| Glass Petri dish | VWR | 89000-306 | |
| PBS | Sigma | P5493 | Cell culture grade |
| Dissecting microscope | Leica | M125 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Biotechnology grade |
| Surgical blade | Feather | 21 | |
| All Purpose Instant Krazy Glue Pen | Krazy Glue | KG824 | |
| HM 650V Vibrating-Blade Microtome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
Table of specific reagents and equipment. |
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References
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