En kvantitativ cellmigrationsassay för Murina Enter Neural stamfäder

Summary

Vi presenterar en ex vivo cellmigrationsassay som tillåter exakt kvantifiering av magsaftresistent neural crest cell migration potentialen i närvaro av olika tillväxtfaktorer.

Abstract

Neurallistceller (NCC) är en övergående och multicellpopulation som härstammar från den dorsala neuralröret och vandrar mycket i hela utvecklings ryggradsdjur embryot. Förutom att ge perifera glia och nervceller, NCC genererar melanocyter samt de flesta av kranio-och ansiktsskelett. NCC migration och differentiering styrs av en kombination av deras axiella ursprung längs neuralröret och deras exponering för regionalt distinkta extracellulära signaler. Sådant bidrag cellulära ligander är särskilt tydligt under bildandet av det enteriska nervsystemet (ENS), ett komplext sammankopplade nätverk av neurala ganglierna som lokalt styr (bland annat) gut muskelrörelser och intestinal motilitet. Merparten av ILE är härledd från en liten initial pool av NCC att genomföra en lång resa för att kolonisera - i en rostralt till kaudalt fashion - hela längden av den blivande tarmen. Bland flera signalvägar som är kända förpåverka enter NCC kolonisering, är GDNF / RET signalering erkänd som den viktigaste. Faktum är spatiotemporally kontrollerad utsöndring av RET liganden GDNF av tarmen mesenkymet huvudansvarig för attraktion och vägledning av RET-uttryckenter NCC och inom den embryonala tarmen. Här beskriver vi en ex vivo cell migration assay, med användning av en transgen mus linje besitter fluorescensmärkt NCC, som tillåter exakt kvantifiering av magsaftresistent NCC migrationspotentialen i närvaro av olika tillväxtfaktorer, inklusive GDNF.

Introduction

Neurallistceller (NCC) är en övergående celltyp unik för ryggradsdjur som bildar många derivat under embryoutveckling. Denna cellpopulation uppkommer vid gränsen av det neurala plattan, som gränsar till icke-neural ektoderm ^1. Under neurulation, böjning av de neurala platt ställen NCC längs den dorsala kanten av formnings neuralröret. NCC genomgår sedan en epitelial-mesenkymala övergång, segregerande och migrera bort från neuralrörsdefekter. NCC kolonisera olika embryonala strukturer, bland annat mag-tarmkanalen där de bildar hela det enteriska nervsystemet (ENS), ett sammanlänkat nätverk av neurala ganglierna inbäddad i tarmväggen. Så sent omdömet ^2,3 har många gener som varit inblandade i utvecklingen av denna invecklade struktur.

De flesta av ENS kommer från en liten pool av NCC har sitt ursprung från den vagala neuralrörsdefekter (dvs. runt den blivande hindbrain / ryggmärgen gränsen) ^4.Dessa neurala stamceller når framtarmen kring embryonala dag (e) 9.0 i möss och sedan vandrar kaudalt i tarmen mesenkymet tills ca e15.0 att kolonisera hela embryonala tarmarna. En mindre delmängd av colonic neurala stamceller ges också av sakral NCC, som invaderar den bakre tarmen i motsatt riktning upp till cekum ^4. Både vagala och sakrala NCC kräver flera migration-, spridning-, överlevnad-och differentieringsfrämjande ledtrådar för att garantera fullständig bildandet av ENS. I detta avseende djurmodeller - särskilt genetiskt modifierade möss - har varit avgörande för att identifiera flera viktiga extracellulära ligander: GDNF (gliacell-neurotrofa faktor), endotelin-3, neurotrofin-3, BMP (benmorfogena proteiner), Netrin , samt Sonic och indiska Hedgehog (Shh och Ihh) ^5-10. Av dessa är GDNF signalering via tyrosinkinas membranreceptor RET (ordnas under transfektion) erkänd som the mest kritiska vägen för attraktion och ledning av NCC och inom den embryonala tarmen. GDNF utsöndras av tarmens mesenkym och bildar en spatiotemporally kontrollerad rosrrocaudal gradient som är direkt chemoattractive till enterisk NCC, som uttrycker RET ^11,12.

Bland andra funktioner, ENS reglerar rörligheten inom mag-tarmkanalen genom dess interaktion med glatta muskulaturen i tarmväggen. Frånvaro av neurala ganglierna i terminala regionen i tarmen leder till Hirschsprungs sjukdom: tonisk kontraktion av den påverkade segment leder till blockering, uppströms ackumulering av digererat material och massiv uttänjning av tarmen och magen. Hirschsprungs sjukdom inträffar ungefär en i 5.000 levande födda. Den rostro-caudal migrationsmönster enter NCC tros vara den främsta bidragande faktorn till etiologin av Hirschsprungs sjukdom. Tjocktarmen, längst bort från källan att migrera NCC och sista delen av bowel att koloniseras, är mest mottagliga för defekter i ENS formation. I enlighet med sin avgörande roll i enter NCC migration, är störningar i GDNF / RET signalering den viktigaste kända genetiska orsaken till Hirschsprungs sjukdom ^13.

För att bättre studera NCC och ENS utveckling, vi genererat en transgen mus linje - som heter Gata4p [5kb]-GFP ¹⁴ - där flyttande NCC är märkta med grönt fluorescerande protein (GFP). Vi fulländade bredvid ett ex vivo cellmigrationsassay, anpassat från publicerade verk av andra grupper ^11,12,15, som nu ger en exakt kvantifiering av enter NCC migrationspotentialen i närvaro av olika tillväxtfaktorer, såsom GDNF.

Protocol

Ethics uttalande

Experiment med möss utfördes efter kanadensiska Rådet Animal Care riktlinjer för vård och hantering av djur som används i medicinsk forskning. Protokoll som innebär manipulation av djur godkändes av institutionella etiska kommittén vid University of Quebec i Montreal (Comité Institutionnel de Protection des Animaux, referensnummer 0512-R3-650 till 0513).

1. Beredning av kollagengeler

Arbete på sterilt sätt under en vävnadskultur huva.

1. Förbered komplett 5x DMEM (Eagles modifierade essentiella medium) inklusive standard antibiotika. Lös upp 3,37 g av DMEM pulver och 0,925 g NaHCO ₃ i 20 ml vatten. Sterilisera genom passage genom ett 0,22 pm filter. Tillsätt 2,5 ml steril 100x penicillin / streptomycin och 25 ml sterilt värmeinaktiverat fetalt bovint serum. Förvaras vid 4 ° C.
2. På is, blanda 800 ^ ilav kollagen I-lösning (3,77 mg / ml i 0,02 N ättiksyra, filtersteriliserad), 600 ul av komplett 5x DMEM och 17 | il av en IN NaOH. Späd ut med sterilt vatten till en slutvolym av 3 ml. Inkludera relevanta tillväxtfaktorer i mixen. Vi använder vanligtvis GDNF vid 10 ng / ml för att stimulera enter NCC migration.
3. Avsätta ca 480 | il i varje brunn i en enda rad i en 24-brunnsplatta. Undvik bubblor. De återstående raderna kan användas för att testa effekten av andra tillväxtfaktorer på cellmigration.
4. Låt kollagen polymerisera åtminstone en timme i en steril inkubator vid 37 ° C.

2. Dissektion av djur ¹⁶

1. Inrätta parningar och kontrollera vaginala pluggar nästa morgon. Dag e0.5 är middagstid samma dag vaginal kontakten hittas, isolera honan och vänta 12 dagar tills E12.5.
2. Söva gravida möss med isofluran och avliva av CO ₂ inandning.
3. Spray musen med 70% etanol. Lyft buken sanhöriga och öppna buken hålighet med dissekera sax.
4. Avlägsna livmodern i en glaspetriskål fylld med iskall PBS (fosfatbuffrad saltlösning). Skär livmodern tvären mellan enskilda deciduum svullnader att isolera varje embryo implantation webbplats.
5. Arbetet med varje implanteringsstället separat i ett annat glas petriskål fylld med iskall PBS. Under ett dissektionsmikroskop, använda fin pincett för att avlägsna muskelskiktet av livmodern.
6. Öppna den viscerala gulesäcken och amnion att avslöja embryot. Var försiktig när du bryta blodkärlen att gå embryot till moderkakan / visceral gulesäcken, då de är sammanflätade med utvecklings tarmarna.
7. Sever embryot huvud i nacken.
8. Sätt i en sluten tång i bukhålan av ett embryo, strax ovanför den mörka rödfärgade levern och låt pincetten öppna av sig själv (sluta sätta press) för att göra en tvärgående öppning i buken hålighet. Dra de öppnade pincett ner motden bakre änden av embryot för att öppna buken helt.
9. Ta bindväv bakom levern och dra innanmätet av buken, är noga med att inte bryta tarmarna (kolon är fäst till anus).
10. Skär av kolon för att frigöra innanmätet från resten av embryot. Snittet kan göras var som helst längs med kolon. Reservera den bakre sektionen för senare.
11. Reta ut bindväven från blindtarmen, sedan resten av tarmen. Var noga med att inte sår tarmen medan du gör det.
12. Skär bort levern och magen (på den rostrala änden av tunntarmen), såväl som de mesonephros och genitala åsar om någon är närvarande.
13. Isolera tunntarmen. Återigen, vara noga med att inte kväva tarmen. Från och med nu kan det rosrrocaudal orientering i tarmvävnaden spåras med hjälp av den kraftiga krökning närvarande på den rostrala änden. Lämna tunntarmen i PBS vid rumstemperatur under en så kort tid som möjligt innan emsängkläder (se steg 3.3).
14. Slutligen, registrera antalet svans somites för varje embryo för att exakt fastställa stadium av fosterutvecklingen.

3. Sektionering av embryonala Tarm

1. Innan embryo dissektioner, smälta 1,5 g agaros i 100 ml PBS (fosfatbuffrad saltlösning) och förvara vid 50 ° C.
2. Häll smält agaros i en inbäddning mögel (t.ex. en stängd 2 ml mikrocentrifugrör som har skurits på längden för utklippning av ca 1/4 av röret väggen). Låt agarosen svalna till cirka 42-45 ° C, bör det vara endast något varm vid beröring.
3. Bädda in den embryonala tarmen strax innan agarosen stelnar (detta kan utvärderas med pincett tips och kommer att ske runt 36-38 ° C). Håll i tarmen med pincett genom den vikta rostralt ände, dra det mycket långsamt genom agaros utmed längden av formen. Detta hjälper till att hålla tarmen rak medan agaros uppsättningar. Släpp tutfärda så fort det börjar stå emot flyttas. Håll koll på rostral-kaudala orientering tarmen.
4. Placera formen i kylskåp 2-3 minuter, för att säkerställa agarosen har helt inställd.
5. Ta ut agaros från formen (genom att skjutas ut ur den öppnade Eppendorf-rör). Med ett blad, ta ut den överskotts agaros i båda ändar, vilket gör nedskärningar vinkelrätt mot tarmen.
6. Limma den rostrala änden av tarmen / agaros blockera ner på metall skede av en mikrotom med vibrerande blad. Klipp bort överflödigt agaros på sidorna av tarmen / agaros blocket.
7. Montera metallstadiet på den vibrerande mikrotom kammaren. Vid behov, justera vinkeln på scenen så att tarmen är så vertikalt som möjligt (därav vinkelrätt mot bladet). Täck provet med iskall PBS. Bring mikrotomen bladet ner till några millimeter under buffertytan.
8. Gör 200 um Vibratome tvärgående snitt av den kaudala-mest tunntarmen, se till att each agaros skiva innehåller en full tarm avsnitt.

4. Kultur av Intestinal Explantat

1. Deponera försiktigt nyskurna tarmen / agaros skivor platt på kollagen geler med pincett, placera en bit mot mitten av varje brunn.
2. Inkubera 3 dagar vid 37 ° C i en fuktig 5% _CO2 atmosfär för att medge migrering av NCC av explantatet.
3. Ta tarmen / agaros skivor från kollagengelen mycket försiktigt med pincett. Se till att inte skada gelen nedan.
4. Undvik att röra vid kollagengelen direkt under de efterföljande inkubation och tvättsteg för att säkerställa att cellmigrationsmönstret inte störs. Fixera med 500 ul av 4% PFA (paraformaldehyd) (i PBS) per brunn i 1 h vid rumstemperatur.
5. Ersätt fixativ med 500 | il av DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenylindol)-lösning (5 | ig / ml i PBS) per brunn och inkubera 10 minuter vid rumstemperatur.
6. Tvätta varje brunn 3xmed 500 | il PBS under 5 min.
7. Fotografera de fluorescerande celler (GFP och DAPI kanaler) inbäddade i kollagen gel i varje brunn.

5. Bildanalys

Vi gjorde omfattande användning av ImageJ ¹⁷ att behandla och kvantifiera de bilder som genereras efter Explantation kultur.

1. Börja med att avbilda en mikrometer glida med samma förstoring som de fluorescerande cell fotografier. Mät längden på en mikron i pixlar (med hjälp av rak linjeverktyget).
2. Ställ in skalan (Analyze / Set Skala, ingång antalet pixlar / micron).
3. För varje GFP fluorescens fotografi, ändra bildformatet till 8-bitars gråskala (Image/Type/8-bit).
4. Justera intensiteten i signalen (Bild / Justera / Ljusstyrka / Kontrast).
5. Subtrahera bakgrundsljud vid behov (Process / Subtrahera Bakgrund, justera den rullande bollen radie).
6. Ställ en tröskel för att markera celler och cellklumpar (Bild / Justera / Threshold), denn tillämpa en vattendelare att dela upp klumpar (Process / Binary / Watershed).
7. Analysera partiklar att ange områden av intresse (ROI) och generera cellsifferstatistik (Analyze / analysera partiklar, som storlek minst för att utesluta kvarvarande bildpunkter).
8. Ställ mätalternativ att inkludera Ferets diameter (Analyze / Set mätningar).
9. Grupp ROI och mäta som helhet att avgöra Ferets diameter, en indikation på cellspridning (Analyze / Verktyg / ROI Chef / Mer / OR, sedan ROI chef / Lägg till och ROI chef / Mät).

Representative Results

Följande resultat är representativt för vad som kan uppnås med den teknik som beskrivs här (se figur 1). Användningen av tillväxtfaktorer (dvs. GDNF) stimulerar migrering av GFP-uttryck enterisk NCC ur tarm explantatet och in i kollagen-gel (Figur 2). Även om vissa celler kommer ut från explantatet i frånvaro av tillväxtfaktorer, dessa är oftast inte GFP-märkta och representerar passivt inträde. Det är nödvändigt att ta bort tarm bit från kollagengelen för att registrera resultaten, eftersom denna vävnad är fortfarande starkt befolkas av fluorescerande celler och annars skulle dölja celler som ligger i kollagen under. Kvantifiering av dessa resultat visar att många fler celler finns i kollagen gel när GDNF är närvarande, och att aktivt migration sker (Figur 3). I själva verket är passiva celler hittades omedelbart under explantaten, inom diametern för en intestinal skiva, wher EAS celler som aktivt invaderar kollagengelen röra sig bort från sin utgångspunkt och spred sig vidare.

Figur 1. Översikt av Explantation odlingstekniken. A) Uniform population av fluorescerande enter NCC inom den kaudala tunntarmen region används för att göra 200 μ-tjocka explantat. Scale bar:. 200 ^ m B) Odlingsmediet innehållande kollagen avsätts i 24-brunnsplattor och lämnades att härda under 1 timme. Vibratome skivor av agaros-inbäddade embryonala tarmar avsätts på gelerna (en skiva per brunn), och fluorescerande enter NCC tillåts vandra ut av explantaten i 3 dagar. Skivorna är sedan tas bort innan avbildning av celler som invaderat kollagengeler.s/ftp_upload/50709/50709fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2. Cellmigration av tarm explantatet och inom kollagengel. Cellerna som migrerade ut ur en intestinal explantatet under 3-dagars inkubation i frånvaro eller närvaro av 10 ng / ml GDNF fixerades, färgades med DAPI (blå) och fotograferades för att visar GFP-märkta enterisk NCC (grön). 70X förstoring. Skala bar: 100 nm. Den streckade linjen representerar den ungefärliga storleken och placeringen av Explantation innan det togs bort gelen. Klicka här för att visa en större bild. Klicka here för större bild.

Figur 3. Kvantifiering av enter NCC migrationspotential. Antalet och spridningen (Ferets diameter) av GFP-uttryckande celler migrerar ut ur tarm explants efter 3 dagar kvantifierades med ImageJ programvara ^17. I båda fallen finns det en signifikant skillnad mellan obehandlade och GDNF-behandlade förhållanden i enlighet med ett Students t-test (p <0,001, *). Medeldiametern av intestinala segment (prickade svarta linjen: 260 | im) inkluderades för att skilja mellan passiv inträde och aktiv migration. Nt: obehandlade, n:. Antal explantat bearbetade Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Vi visar hur våra ex vivo Explantation kultur teknik kan användas för att exakt kvantifiera enter NCC migrationspotentialen i närvaro av GDNF. Sådana exakta kvantifiering underlättas i hög grad genom att använda 200 nm-tjocka vibratome tarmsektioner i stället för stora bitar av ungefärlig storlek, som tidigare beskrivits ^11,12,15. I själva verket kan vi genom att arbeta med ett rimligt antal celler i en mycket reproducerbar inställning. Att notera, den likformiga fördelningen av fluorescerande enterisk NCC inom den kaudala rsta regionen av tunntarmen från vilket explantatet skivor skärs möjliggör även analys av multipla sektioner från en enda tarmen (Figur 1A). Med tanke på att både enter NCC och axoner kan lämna vävnaden i sådana analyser ^11, indragning av explantaten i slutet av odlingsperioden låter oss fokusera enbart på flyttande NCC.

De flesta kritiska steg angavs i protokollet text, men som welfare av tarm explantatet är av största vikt att få frisk migrera NCC, bör särskild försiktighet iakttas. Undvik att utsätta embryonala vävnader för plötsliga temperaturförändringar, i synnerhet när tarmen är inbäddad i agaros (steg 3,3). Se till att tarmen är vid rumstemperatur och agaros så cool som möjligt (men ändå smälta) för att undvika att "laga" vävnaden. Tarm Explantation ska trivas på odlingsmediet fyllda kollagen gel, ofta ökar i storlek och rinner ut i agarosen slice. Om explantatet verkar ohälsosamt eller ännu värre, tenderar att förgås under inkubation, prova att byta ut PBS med odlingsmedia vid rumstemperatur (t.ex. HEPES-buffrad M2 eller DMEM kompletterad med 10% FBS) för att hjälpa till att upprätthålla den under dissekering.

En viktig begränsning för vår inställning är att det bygger på att det finns en mus linje ger en fluorescerande etikett att migrera NCC. I avsaknad av en sådan resurs, en antikropp mot migrating NCC (t.ex. anti-Ret eller anti-Sox10) kan användas för att märka celler som invaderat kollagengel. Med tanke på att tarmen mikromiljön är betydligt mer komplex än en enkel kollagen gel, resultat som erhållits med detta in vitro-analys kanske inte helt återspeglar beteendet hos enter NCC in vivo. Ytterligare försök med live-cell imaging rekommenderas att bedöma detta beteende. Det är också värt att notera att i tillägg till sin roll som kemoattraktant, är GDNF känt för att främja spridningen av migraenter NCC ^4. Vårt mått på enter NCC migrationspotentialen i närvaro av GDNF är alltså förmodligen en blandning av äkta cellmigration och celltillväxt, besläktad med de vivo-mekanismer som leder till NCC kolonisering av tarmen. Om man vill göra tydlig skillnad mellan dessa två processer, kan tillägg av en cellcykelblockerare (t.ex. AZD 5438 ¹⁸⁾ i odlingsmediet begränsar analysen till cell migration.

Denna teknik kan utvidgas till att testa olika andra extracellulära ligander såväl som inhibitorer av specifika signalvägar, och alla kombinationer av dessa. Andra vävnader kan också potentiellt dissekeras och sektioneras, vilket gör studiet av NCC migration i många embryonala strukturer. I kombination med nya och / eller okarakteriserade muterade musstammar med eventuella defekter i NCC utveckling, kan vår teknik kunna användas för att snabbt screena för brister i migrations reaktioner på specifika signaleringshändelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM powder	Wisent	219-010-XK
NaHCO3	Bioshop	SOB999	Biotechnology grade
Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron)	EMD Millipore	SCGP00525
Penicilin-Streptomycin solution, 100x	Wisent	450-201-EL
Fetal bovine serum	Wisent	095-150	High quality grade
Collagen I	BD biosciences	354236
NaOH	Bioshop	SHY700	Diluted from 10 N stock then sterile-filtered
GDNF	Cedarlane	CLCYT305
Falcon 24-well Plate	BD biosciences	353047
Dissecting scissors	Fisher Scientific	089515
Glass Petri dish	VWR	89000-306
PBS	Sigma	P5493	Cell culture grade
Dissecting microscope	Leica	M125
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20
Agarose	Bioshop	AGA001	Biotechnology grade
Surgical blade	Feather	21
All Purpose Instant Krazy Glue Pen	Krazy Glue	KG824
HM 650V Vibrating-Blade Microtome	Thermo Scientific	920110
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
DAPI	Sigma-Aldrich	D9564
Table of specific reagents and equipment.