Pre-kliniske Evaluering av tyrosinkinasehemmere for behandling av akutt leukemi
Summary
Receptor tyrosinkinaser er ectopically uttrykt i mange kreftformer og har blitt identifisert som terapeutiske mål i akutt leukemi. Denne manuskriptet beskriver en effektiv strategi for preklinisk evaluering av tyrosin kinase inhibitorer for behandling av akutt leukemi.
Abstract
Reseptor-tyrosin-kinaser har vært implisert i utvikling og progresjon av mange kreftformer, inkludert både leukemi og faste tumorer, og er attraktive druggable terapeutiske mål. Her beskriver vi en effektiv fire-trinns strategi for preklinisk evaluering av tyrosinkinase-inhibitorer (TKIs) i behandlingen av akutt leukemi. I utgangspunktet er western blot analyse brukes til å bekrefte målet hemming i dyrkede leukemiceller. Funksjonell aktivitet blir deretter evaluert ved hjelp clonogenic essay i methylcellulose eller myke agar kulturer. Eksperimentelle forbindelser som viser aktivitet i cellekultur analysene er evaluert in vivo ved hjelp av NOD-SCID-gamma (NSG) mus transplantert orthotopically med menneskelig leukemi cellelinjer. Innledende in vivo farmakodynamiske studier evaluere mål hemming i leukemiske blaster isolert fra benmargen. Denne fremgangsmåten brukes til å bestemme den dose og doseringsplan som kreves for effektiv target Sperreion. Senere studier evaluere effekten av TKIs in vivo ved anvendelse av luciferase som uttrykker leukemiceller, og derved åpner for ikke-invasiv bioluminescent overvåking av leukemi belastning og vurdering av terapeutisk respons ved bruk av en in vivo Bioluminescens avbildningssystem. Denne strategien har vært effektiv for evaluering av TKIs in vitro og in vivo og kan brukes for identifisering av molekylært målrettede agenter med terapeutisk potensial eller for direkte sammenligning og prioritering av flere forbindelser.
Introduction
Akutt lymfatisk leukemi (ALL) er den vanligste kreftformen hos barn 1,2. Den totale overlevelsen for pediatrisk B-avstamning ALL (B-ALL) er ca 85%, men bestemte biologiske undergrupper, inkludert T-avstamning ALL (T-ALL), har fortsatt dårligere prognose selv med dagens terapeutiske protokoller. Videre behandling av residiverende ALL fortsatt en utfordring tre. Selv om flertallet av voksne pasienter med akutt leukemi oppnå en remisjon med up-front kjemoterapi, mange pasienter fortsatt lider tilbakefall fire. Omløps kjemoterapeutiske regimer for behandling av akutt leukemi er kjent for å forårsake toksisitet assosiert på kort og lang sikt bivirkninger. Derfor er mindre toksiske terapier som spesifikt er rettet mot kreftceller med minimal effekt på normalt vev stort behov. I de senere årene har det vært lagt vekt på utvikling av romanen, molekylært målrettede agenter med spesifisitet for kreftceller, ofte utnytte iterativ kjemiå generere flere aktive forbindelser som må deretter sammenlignes og prioriterte fem. Denne manuskriptet beskriver en effektiv strategi for preklinisk evaluering av TKIs for behandling av akutt leukemi, som kan anvendes for evaluering av en enkelt forbindelse eller for direkte sammenligning av flere forbindelser for å lette utvikling av legemidler.
Fremgangsmåten presentert her består av fire trinn. Først den biokjemiske (1) og anti-leukemi (2) aktiviteter av forbindelsen (e) er undersøkt i cellekultur, og hemming av målet blir bekreftet i dyremodeller (3), og til slutt terapeutiske effekt av TKI (s) bestemmes i ortotopiske leukemi xenograft modeller (4). For disse studiene, er det viktig å velge relevante cellelinjer, som er representanter for de mest vanlige biologiske subtyper. Cellelinjer bør velges, som begge, uttrykke mål av interesse og mangler mål av interesse, for å undersøke om biologiske effekter er MEDiated ved inhibering av målet. Dette er spesielt relevant for utvikling av små molekyl-hemmere, som har off-target effekter som kan være viktig for anti-tumor aktivitet. Det er også nødvendig å velge en cellelinje som er avhengig av målsettingen for funksjonelle effekter som proliferasjon og overlevelse. Foreløpige validerings target studier (utenfor rammen av denne artikkelen) ved hjelp av RNA-interferens eller andre særskilte midler for å hemme målet kan brukes til å identifisere mål-avhengige cellelinjer. Det er også ønskelig å velge cellelinjer som kan danne murine xenografter, slik at cellekulturresultater kan være mer direkte settes til in vivo eksperimenter.
For evaluering av biokjemisk aktivitet mediert av TKIs i leukemi-celler, kan en reduksjon i receptor phosphorylation bli brukt som en indikator på target-hemming. Western blot analyse eller ELISA-analyser kan anvendes, avhengig av tilgjengelighet og spesifisitet av antistoffer.Hvis antistoffer med tilstrekkelig spesifisitet for målet, er tilgjengelige, ELISA-analyser er å foretrekke fordi de er mer kvantitativ og effektiv. I de tilfeller hvor antistoffer med tilstrekkelig spesifisitet for ELISA ikke er tilgjengelige, kan det være nødvendig med western blot analyse. I dette tilfellet kan immunoutfelling av en stor mengde av lysat være nyttig for deteksjon av mål som befinner seg i lav mengde. Denne tilnærmingen er spesielt relevant for måling av fosfo-proteiner, som kan ha en kort halveringstid, slik at for hurtige endringer i signalisering som respons på miljømessige stimuli. Noen fosforylerte proteiner er ekstremt labile, mest sannsynlig på grunn av kompleksdannelse med fosfataser. For robust og stabil deteksjon av disse fosforylerte proteiner, kan det også være mulig å behandle cellene med pervanadate, en irreversibel protein-tyrosin-fosfatase-inhibitor 6, for å stabilisere fosfo-protein før fremstillingen av hele cellelysater.
Åavgjøre om biokjemisk aktivitet resulterer i anti-tumor effekter, kan målet avhengige biologiske prosesser overvåkes i cellebaserte eksperimenter. For leukemi cellelinjer, kan anti-leukemi aktivitet mediert av TKIs vurderes ved hjelp koloni dannelse analyser utført i methylcellulose eller myk agar 7. Myk agar kan være foretrukket, da dette er et fast medium som er mer mottagelig for manipulering om gjentatt behandling med en TKI er nødvendig. Mens mange akutte myloid leukemi (AML)-cellelinjer vil danne kolonier i myk-agar, vil de fleste alle cellelinjer bare danne kolonier i metylcellulose, som er et halvfast medium. Selv om det er mulig å oppdatere medium og / eller TKIs i methylcellulose kulturer, kan bare små mengder anvendes, og med begrenset frekvens. Tilsvarende er det vanskeligere å sette flekker kolonier uten å forstyrre dem i metylcellulose. Foreløpige studier bør definere evnen av passende cellelinjer for å danne kolonier i metylcellulose og / eller myk agar og tHan optimal tetthet av celler i kultur slik at koloniene er ikke-overlappende og i tilstrekkelig antall til å oppnå statistisk relevante data (vanligvis 50 til 200 kolonier per 35 mm plate).
Mens in vitro prøver er robuste og kostnadseffektive, og har færre etiske implikasjoner enn hele dyreforsøk, fremme av terapeutiske forbindelser krever bevis på effekt og sikkerhet i dyremodeller. For in vivo studier, kan menneskelige akutt leukemi cellelinjer bli orthotopically transplantert inn NOD.Cg-Prkdc SCID jeg l2rg tm1Wjl / SzJ (NSG) mus og TKIs kan enkelt administreres ved injeksjon eller oral sonde. Noen cellelinjer krever eksponering av NSG mus til en lav cellelinje-avhengig stråledose for at xenografts å etablere, og i dette tilfellet mus ikke kan tolerere oral gavage uten en 5-10 dagers restitusjonsperiode etter bestråling. Dette manuskriptet beskriver generasjon B-ALL og T-ALLE xenografts hjelpspesifikke cellelinjer (697) og Jurkat som eksempler, men xenografts kan settes i NSG mus ved hjelp av en rekke forskjellige cellelinjer. I det tilfelle at andre cellelinjer er mer anvendelig, kravet for bestråling, optimalt antall celler til transplantasjon, og tidspunktet for sykdommen inntreden og utvikling må bestemmes eksperimentelt. Ideelt sett vil disse modellene har full pene (alle dyr transplantert utvikler leukemi), konsekvent kinetikk (leukemi utvikler seg på samme måte i alle dyr), og en rimelig behandling vindu (ideelt sett 20-30 dager mellom oppstart av behandling og fjerning fra studien på grunn av sykdom) . Antallet celler transplantert kan økes for å forbedre pene og kinetisk konsistens eller redusert for å forbedre behandlingsvinduet om nødvendig.
For å finne ut om TKIs megle target hemming in vivo, er det samlet inn prøver fra mus med leukemi xenografts etter behandling med TKI eller kjøretøy bare. Ideelt sett dosen end doseringsplan for disse eksperimentene er guidet av farmakokinetiske studier, som ofte kan være utført av kommersielle laboratorier og er utenfor omfanget av denne artikkelen. Hvis farmakokinetiske data er tilgjengelige, kan konsentrasjonen av forbindelse som er nødvendig for effektiv target inhibering i cellekultur, og den maksimale serumkonsentrasjon etter en enkelt dose av TKI brukes til å definere en startdose for dyrestudier. Farmakokinetiske studier kan også informere tidspunktet for prøvetaking etter behandling for farmakodynamiske studier og administrasjonsveien. Inhibering av målet kan bli vurdert i alle berørte organ, men vev som er mest lett samles og behandles er å foretrekke. De akutte leukemicellelinjer etablert i lever, benmarg, milt, perifert blod, og det sentrale nervesystemet, selv om de spesifikke organer påvirkes og omfanget av engraftment i disse organer varierer mellom modellene. Protokollen presenteres her vurderer fosfato-protein hemming i benmarg ved hjelp av western blot analyse, men solide organer kan være lettere å konsekvent høste og krever minimalt eller ingen behandling før frysing, slik at mindre mulighet for nedbrytning av fosfor proteiner under prøvetakingen og behandling. Immunhistokjemi kan også brukes til å evaluere solide tumorer eller organer som påvirkes av leukemi.
Endelig er den terapeutiske effekt av den TKI (e) bestemmes i ortotopiske leukemi xenograft-modeller. For disse studiene, kan tidspunktet for behandlingsstart varieres, slik at sykdommen er mer eller mindre fastslått. Behandling kan starte umiddelbart etter transplantasjon for innledende studier og deretter bli forsinket i senere studier til betydelig sykdomsbyrde blir oppdaget til nærmere tilnærmet en diagnostisk behandlingsmodell. Ideelt sett er disse dyremodeller har også kapasitet for ikke-invasiv måling av sykdomsbelastning. Vi har optimalisert metoder for innføring av Firefly luciferase-genet inn i leukemicellelinjer ved hjelp av viruslignende partikler, slik at for ikke-invasiv, langsgående analyse av sykdomsutbruddet og progresjon og vurdering av sykdomsbelastning i benmarg-og organer. Kritisk for denne metode er bruken av monoklonale luciferase-merket cellelinjer for å hindre at variasjon i utviklingen av luciferase-uttrykkende leukemi forbundet med bruk av polyklonale cellelinjer, og er ikke relatert til behandling med et TKI 8..
Til sammen kan disse trinnene brukes til evaluering av en enkelt TKI eller for direkte sammenligning og rangering av flere TKIs. Mens de protokoller som presenteres her fokus på utvikling av TKIs kan disse metodene tilpasses andre mål og betraktninger for analysen utvikling er beskrevet. Således kan denne strategien er mer bredt anvendelig til pre-klinisk evaluering av molekylært målrettede midler for behandlingen av akutt leukemi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne manuskriptet beskriver en effektiv strategi for evaluering av nye tyrosin kinase inhibitorer for behandling av akutt leukemi. Ved hjelp av denne metode, er biokjemiske og antileukemi aktiviteter beregnes først i celle-baserte analyser in vitro og in xenograft-modeller in vivo. Immunoblotanalyse ble med hell anvendt for å demonstrere inhibering av target-tyrosinkinase hos leukemiceller etter behandling med TKIs og å direkte sammenligne styrken av flere forbindelser i celler. I den protokoll som…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
In vivo avbildning ble utført ved hjelp av IVIS Shared Resource ved University of Colorado Cancer Center (støttet av stipend P30-CA046934). Flowcytometri ble utført ved flowcytometri Shared Resource, University of Colorado Cancer Center (støttet av stipend P30CA046934). Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health (RO1CA137078 til DKG). ABLS er Fellow Pediatric Scientist Development Program, støttet med tilskudd fra American Academy of Pediatrics, American Pediatric Society, og Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (K12-HD000850).
Materials
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. Cancer Statistics. 2010. CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).
- Kaatsch, P. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).
- Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there?. Blood. 120, 1165-1174 (2012).
- Forman, S., Rowe, J. M. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 121, 1077-1082 (2013).
- Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias. Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).
- Mikalsen, S., Kaalhus, O. Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems. J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).
- Zips, D., Thames, H., Baumann, M. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation. In Vivo. 19, 1-7 (2005).
- Christoph, S., et al. Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission. J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).
- Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions. Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).
- Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas. Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).
- Rudin, M., Weissleder, R. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).
- Barrett, D., et al. Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood. 118, 112-117 (2011).
- Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
