Summary
受容体チロシンキナーゼは、多くの癌において異所性に発現され、そして急性白血病における治療標的として同定されている。この原稿は、急性白血病の治療のためのチロシンキナーゼ阻害剤の前臨床評価のための効率的な戦略を記載している。
Abstract
受容体チロシンキナーゼは、白血病および固形腫瘍の両方を含む、多くの癌の発症および進行に関与し、かつ魅力的な治療標的であるドラッガブルされている。ここでは、急性白血病の治療におけるチロシンキナーゼ阻害剤（TKI類）の前臨床評価のための効率的な4段階の戦略を記載している。最初に、ウェスタンブロット分析は、培養白血病細胞における標的阻害を確認するために用いられる。機能活性は、その後、メチルセルロースまたは軟寒天中で培養クローン原性アッセイを用いて評価される。細胞培養アッセイにおいて活性を実証する実験的な化合物は、ヒト白血病細胞株を用いて同所移植したNOD-SCID-γ（NSG）マウスを用いてインビボで評価される。初期のインビボ薬力学的研究は、骨髄から単離された白血病性芽球の標的阻害を評価する。このアプローチは、有効な標的阻害するために必要な投与の用量およびスケジュールを決定するために使用されるイオン。その後の研究は、それによってin vivoでの生物発光イメージングシステムを用いて、白血病の負担や治療応答の評価の非侵襲的生物発光のモニタリングを可能にする、白血病細胞のルシフェラーゼを発現を用いて、in vivoでのTKIの有効性を評価する。この戦略は、 インビトロおよびインビボでのTKIの評価のために有効であったと治療可能性を有する、分子標的薬の同定のため、または複数の化合物の直接比較及び優先順位付けのために適用することができる。
Introduction
急性リンパ芽球性白血病（ALL）は小児の1,2の中で最も一般的な悪性腫瘍である。小児B系統のALL（B-ALL）の全体的な生存率は約85％であるが、T-細胞系列ALL（T-ALL）を含む、特定の生物学的サブタイプが、、でも、現在の治療プロトコルで、まだ予後不良を持っている。再発ALLの更なる処理が課題3のまま。急性白血病の成人患者の大半は先行化学療法と寛解を達成するが、多くの患者はまだ再発4に苦しむ。急性白血病の治療に現在の化学療法レジメンは、毒性に関連する短期および長期の副作用を引き起こすことが知られている。したがって、具体的には、正常組織への影響を最小限に抑えながら、癌細胞を標的とするより毒性の低い治療法が大いに必要とされている。近年では、強調がしばしば反復的化学反応を用いて、がん細胞の新規な特異性を有する、分子標的薬の開発に配置されているを比較して5を優先している必要があり、複数の活性化合物を生成する。この原稿は、薬剤開発を容易にするために、単一の化合物の評価のために、または複数の化合物の直接比較のために使用することができる急性白血病の治療のためのTKIの前臨床評価のための効率的な戦略を記載している。
ここで紹介する方法は、4つのステップで構成されています。最初の生化学（1）および抗白血病（2）の化合物の活性は、細胞培養で評価され、次いで標的の阻害は、動物モデル（3）で確認し、TKI（複数可）の最終的に治療効力れる白血病同所性異種移植片モデル（4）で決定される。これらの研究のために、それは最も一般的な生物学的サブタイプの代表であり、関連する細胞株を選択することが重要である。細胞株は、目的の標的を発現し、目的の標的を欠いている、生物学的効果をメッドされているかどうかを調べるためにその両方の、選択されるべきであるターゲットの阻害によってiated。これは、抗腫瘍活性のために重要であるかもしれないオフターゲット効果を有する小分子阻害剤の開発のために特に適切である。このような増殖または生存などの機能的効果のための標的に依存する細胞株を選択することも必要である。標的を阻害するためにRNA干渉または他の特異的手段を用いて（この資料の範囲外）の予備標的検証研究は、標的依存性細胞株を同定するために使用することができる。これは、細胞培養の結果がより直接的にin vivo実験に変換することができるように、マウス異種移植片を形成することができる細胞株を選択することも望ましい。
白血病細胞におけるTKI類によって媒介される生化学的活性の評価のために、受容体リン酸化の減少は、標的阻害の指標として使用することができる。ウェスタンブロット分析またはELISAアッセイは、抗体の利用可能性および特異性に応じて、使用することができる。標的に対して十分な特異性を有する抗体が利用可能である場合、それらは、より定量的かつ効率的であるように、ELISAアッセイが好ましい。 ELISAのために十分な特異性を有する抗体が利用できない場合において、ウェスタンブロット分析が必要であり得る。この場合、溶解物の大量の免疫沈降は、低量である標的の検出に有用であり得る。このアプローチは、環境刺激に応答してシグナル伝達の迅速な変化を可能にするために短い半減期を有していてもよいホスホ - タンパク質の測定に特に関連する。いくつかのリン酸化されたタンパク質は、ホスファターゼとの複合体形成の結果として、非常に不安定な可能性が最も高い。これらのリン酸化タンパク質の堅牢かつ一貫性のある検出のために、それはまた、従来の全細胞溶解物の調製リンタンパク質を安定化させるために、過バナジン酸、不可逆的なタンパク質-チロシンホスファターゼ阻害剤6で細胞を処理することが可能であってもよい。
へ生化学的活性が抗腫瘍効果をもたらすかどうかを決定する、ターゲットに依存する生物学的プロセスは、細胞ベースの実験でモニターすることができる。白血病細胞株の場合は、TKIのが介在する抗白血病活性は、メチルセルロースまたは軟寒天7で行われるコロニー形成アッセイを用いて評価することができる。これはTKIによる反復処置が必要な場合に操作により適している固体媒体のように軟寒天に好ましい場合がある。多くの急性myloid性白血病（AML）細胞株は軟寒天中でコロニーを形成するが、最もALL細胞株は、半固形培地である、メチルセルロース中でコロニーを形成する。それはメチルセルロース培養培地および/またはのTKIを更新することは可能ですが、わずかなボリュームが使用され、限られた周波数を持つことができます。同様に、メチルセルロース、それらを破壊することなく、コロニーを染色することはより困難である。予備的な研究は、メチルセルロースおよび/または軟寒天およびtにコロニーを形成するための適切な細胞株の能力を定義する必要が彼コロニーは非重複であり、十分な数の統計的に関連するデータ（35mmのプレートあたり、通常50〜200コロニー）を得るように、培養中の細胞の最適密度。
インビトロアッセイは、堅牢で費用効果があり、全体の動物実験倫理より少ない影響を有するが、治療化合物の進歩は、動物モデルにおける有効性および安全性の証明を必要とする。 インビボ研究のために、ヒト急性白血病細胞株は、同所Iはtm1Wjl / SzJ（NSG）マウスとのTKIが容易に注射または経口胃管栄養法によって投与することができるl2rg NOD.Cg-PRKDCのスキッドに移植することができる。いくつかの細胞株は、異種移植片を確立するためには、放射線の低い細胞株に依存する用量にNSGマウスの露出を必要とし、この場合には、マウスを5〜10日間の回復期間後の照射なし強制経口投与に耐えられないことがあります。この原稿は、使用して、B-ALLおよびT-ALL異種移植片の生成を説明しますしかし、異種移植片の実施例のような特定の細胞株（697およびJurkat）は、細胞株の多種多様を用いてNSGマウスで確立されてもよい。他の細胞株は、より適用可能であることをイベントでは、照射のための要件は、移植、および疾患の発症および進行のタイミングに対する細胞の最適数は、実験的に決定されるべきである。理想的には、これらのモデルは、（疾患による研究から治療と除去の開始との間に理想的に、20〜30日）で、完全な浸透度（移植されたすべての動物が、白血病を開発しています）、一貫性の動態（白血病はすべての動物においても同様に進行する）、かつ合理的な治療ウィンドウを持つことになります。移植された細胞の数は、浸透度と運動一貫性を改善するために増加又は必要に応じて処置窓を改善するために減少させることができる。
TKIは、生体内で目的の阻害を媒介するかどうかを判断するには、サンプルは、TKIまたは媒体のみで処理した後に白血病異種移植片を有するマウスから採取されています。理想的には、用量ANこれらの実験のための管理のDスケジュールは、多くの場合、市販の実験室で行われ、この記事の範囲外であることができる薬物動態試験、案内される。薬物動態データが利用可能である場合、TKIの単回投与後の細胞培養における有効な標的阻害および最大血清濃度に必要な化合物の濃度は、動物研究のための開始用量を定義するために使用することができる。薬物動態研究はまた、薬力学的研究および投与経路のためのサンプル収集後処理のタイミングを知らせることができる。標的の阻害は、任意の影響を受ける臓器で評価することができるが、最も容易に収集され、処理される組織が好ましい。特定の臓器が影響を受けるが、ほとんどの急性白血病細胞株は、肝臓、骨髄、脾臓、末梢血、および中枢神経系において確立し、これらの器官における生着の程度は、モデルの間で変化する。ここで紹介するプロトコルは、ホスホンを評価o-ジタンパク質ウェスタンブロット分析を用いて、骨髄中の阻害が、固形臓器は、一貫して収穫が容易でかつ試料収集及び処理中のリン酸化タンパク質の分解のためのより少ない機会を可能にする、凍結前に最小限または全く処理を必要とすることができる。免疫組織化学はまた、白血病の影響を受け、固形腫瘍または器官を評価するために使用することができる。
最後に、TKI（単数または複数）の治療効果は、白血病同所性異種移植片モデルにおいて決定される。これらの研究のために、治療開始のタイミングは、疾患が多かれ少なかれ確立されるように変えることができる。治療は、初期の研究のために移植した直後に開始することが、その後の重要な病気の重荷がより密接な診断治療モデルを近似するために検出されるまで、その後の研究で遅れる可能。理想的には、これらの動物モデルはまた、疾患負担の非侵襲的測定のための能力を有する。私たちは、ホタルルシファーの導入のための方法を最適化していますアーゼ遺伝子疾患の発症および進行と骨髄および固形臓器における疾患負荷の評価の非侵襲的、縦断的解析を可能にする、ウイルス様粒子を用いた白血病細胞系に変換する。このアプローチには重大な、ポリクローナル細胞株の使用に関連したルシフェラーゼ発現の白血病の発症のばらつきを防止するモノクローナルルシフェラーゼタグ付き細胞株の使用であり、TKI 8での治療とは無関係である。
まとめると、これらの手順は、単一のTKIの評価のために、または複数のTKIの直接比較し、ランク付けのために使用することができる。ここに提示プロトコルはTKI類の開発に集中しながら、これらの方法は、他のターゲットに適合させることができ、アッセイ開発のための考慮事項が記載されている。したがって、この戦略は、より広く、急性白血病の治療のための、分子標的薬の前臨床評価にも適用可能である。
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Protocol
動物に関わるすべての実験は、コロラド州機関動物実験委員会の大学によって承認された規制基準に従った。実証プロトコルは、コロラド州の機関動物実験委員会の大学によって承認された。
1。リン酸化タンパク質のウェスタンブロット
- 溶解液の調製
- 関心対象の受容体チロシンキナーゼを発現する培養細胞株。細胞を回収し、1〜2×10 6細胞/ 48ウェル組織培養皿中で400μlの増殖培地中のサンプルプレート。 2〜3時間、5％CO 2中37℃でインキュベートする。
- 増殖培地で5倍TKI溶液100μlを加え、60分間インキュベートする。
- 50mMのHEPES（pH7.5）を、150mMのNaCl、10mMのEDTA、10％（v / v）グリセロール、1％（v / v）のトリトンX-100、およびプロテアーゼ阻害剤を溶解バッファーを調製する。文化は前の収穫にペルバナデートで処理しない場合は、（1 mMのナトリウムorthovaホスファターゼ阻害剤を追加溶解緩衝液にnadateおよび0.1mMモリブデン酸ナトリウム）。
- 使用直前にペルバナデート（PV）ホスファターゼ阻害剤溶液を調製する。氷上で暗管（30％ストック溶液の1:100希釈）中冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で過酸化水素（CAUTION）の0.3％溶液を調製する。 5分間、0.2Mオルトバナジウム酸ナトリウム（OV、注意）ストック溶液の一定量を沸かす。室温（RT）で20 mMのOV溶液を作るためにPBSで1:10に希釈する。 0.3％過酸化水素および20mM OV 1:1で混合し、20分間RTで暗所でインキュベートする。
- 完全培地（60μlのPV + 940μlの培地）に、PVを希釈します。ウェルの希釈PV /100μlのを追加します。 3分間、5％CO 2中37℃で培養した後、氷上にプレートを置き。
- 5分間2,500 rpmで冷たいマイクロチューブ内の細胞を採取する。上清を吸引し、溶解緩衝液120μlの中に細胞を再懸濁。氷上で15分間インキュベートする。 3分間6,000 rpmで寒微量溶解液を明確にする。転送SUPE新鮮な寒さのチューブにrnatant。 -80℃で保存
- 免疫沈降
- 1分間1,000 rpmで微量プロテインGセファロースビーズをスピンダウンする。上清を除去し、ビーズを1mlの冷PBSで2回洗浄します。 50％のスラリーを作製し等量のPBSを追加します。各サンプルに一次抗体および20μlの50％プロテインGビーズを追加します。ローテーター上で4℃でO / N - 2時間インキュベート。
- 9,000 rpmで寒微量のビーズをダウンパルス。上清を除去し、ビーズを150μlの冷溶解緩衝液で2回洗浄。 1分間1,000 rpmで冷たい微量スピン。 2 - メルカプトエタノール（注意）と20μlの2X SDSサンプル緩衝液中で上清と再懸濁ペレットを削除します。 -80℃で、すぐにまたはストア使う
- SDS-PAGEのトリス - グリシンゲル上で5分間、実行のための沸騰サンプル。ニトロセルロース膜にタンパク質を移し、ウエスタンブロットによってリン酸化タンパク質を検出する。
- 水でブロットをすすぎ、その後、2％SDSで62.5 mMのトリス（pH 6.8）、0をインキュベートする。50℃で30分間、1Mβ-メルカプトエタノール（注意）水で2回すすぎ、その後剥離液削除するTBS-Tの5-6の変化で60〜90分間洗浄する。
- ウェスタンブロットによる総タンパク質を検出します。
2。メチルセルロースアッセイ
- 無菌大口径の平滑末端の針を用いて50ミリリットルコニカルチューブにメチルセルロース、人間の基本培地のアリコート4ミリリットル。 （注：メチルセルロース使用前に室温のO / Nにおけるにて解凍-20℃で等分して保存することができます。）
- 10秒間、メチルセルロースおよびボルテックス混合物4 mlに増殖培地中で10倍TKIや車両の500を添加する。
- 収穫細胞を数える。最終細胞濃度よりも10倍も高い濃度で増殖培地中の細胞懸濁液を調製する。メチルセルロースの混合物に500μlの細胞懸濁液を追加します。 10秒間ボルテックスし、気泡を除去するために10分間放置します。
- 5ミリリットルの注射器及び滅菌LARGを使用して、メチルセルロース混合物の4ミリリットルを策定eは、平滑末端針を産んだ。泡を策定しないようにします。 3 35mm組織培養プレートの中心にメチルセルロース混合物1mlを分注する。底部は完全にメチルセルロースで覆われるまで、料理を旋回。
- 各プレートについてメチルセルロース、湿潤環境を保証するために滅菌水で満たされた二つの追加35mm組織培養プレートで10センチメートル滅菌組織培養プレートを調製する。水中での場所の培養は、10〜14日間で5％CO 2、37℃のインキュベータージャケット。
- 1〜2週間後にコロニーをカウントする。コロニーは、20以上のセルと重ならないにする必要があります。コロニーは、グリッドに顕微鏡ステージを備えた倒立顕微鏡を用いてまたは自動コロニーカウンターを用いて計数することができる。 TKIによる治療に応答したコロニーの大きさや形態の変化も評価する必要があります。 （4,5 - ジメチル-2 - チアゾリル）-2,5 - ジフェニル-2H-テトラゾリウムブロマイドゾル - （3の60〜100μLを添加することにより、コロニーカウンター、コロニー染色による検出を改善するためにution（MTT、H 2 O中5 mg / mlの、-20℃で保存して、光から保護し、注意）各プレートの表面に賢明ドロップし、5％CO 2中37℃で8時間インキュベートする。
3。軟寒天アッセイ
- 底層、トップ層のための0.7％ノーブル寒天と2X増殖培地1％ノーブル寒天を準備します。 42℃の水浴中で2×増殖培地を平衡化する。ヒート1％およびマイクロ波中で貴金属寒天0.7％（約1 min/100 ml）および42°Cの水浴中で平衡化。 1％の寒天と2X培地と50ミリリットルのコニカルで別々に0.7％寒天と2X培地の等量を混ぜる。各レイヤのソフトアガー混合/ 6ウェルプレートの計画10ミリリットル。
- ラベル6ウェル組織培養プレート。 1.5ミリリットル、1％軟寒天の混合物で、各ウェルを埋める。めっき中の泡を避けてください。 30分間の滅菌フード内蓋をオフにして、乾燥プレート。
- 細胞を数える。最終細胞concentratiよりも500倍も高い濃度で増殖培地中の細胞懸濁液を調製上。 0.7％寒天混合物に細胞懸濁液を添加し、よく混合し、1％寒天層の上に寒天細胞混合物1.5mlを分注する。上部層30分間固化しましょう。
- TKIや車両制御を含む1X増殖培地を準備します。トップ寒天層の上に、TKIの所望の濃度の培地の2ミリリットルを追加します。
- 5％、37℃で10日間、CO 2のための文化をインキュベートする。3日ごとにオーバーレイするメディアを取り外して交換してください。
- コロニーは肉眼で、吸引重ねる媒体に表示され、200μlのニトロテトラゾブルー溶液（1 mg / mlのH 2 O中のNBT、4℃で保存するには、光、警告から守る）を追加すると。 24〜48時間インキュベーターに戻す。前のカウントに少なくとも2時間、4℃に移動します。染色されたプレートを一ヶ月間、4℃で保存することができる。顕微鏡または自動コロニーカウンターを用いてコロニーを数える。
4。 生体内でリンタンパク阻害の評価
- Cを収集5分間1,500 rpmでテーブルトップ遠心機で遠心分離することにより対数期に成長しているのエル。滅菌PBSで細胞を1回洗浄し、適当な濃度でPBSに再懸濁し（典型的に1〜5×10 7細胞/ ml）。 28 Gのインスリン注射器を用いて尾静脈への静脈注射による6月12日週のNSGマウスに100μlの容量での移植細胞。静脈を拡張するために暖かい水の入ったビーカーに尾を加熱して、注入前にクロルヘキシジン綿棒で尾をきれいに、制止に動物を配置します。注射後、出血が止まるまで滅菌ガーゼを用いて注射部位に圧力を加える。移植は少なくとも3匹/群。 1 mg / mlのゲンタマイシン硫酸塩を含む水にマウスを維持する。
- 十四日移植後、標的阻害の解析のためのTKIのみ車両や収穫サンプルで動物を扱う。動物を秤量し、TKI、車両の適切な投与量（体重のmg / kg）を用いて治療する。 5ミリリットル/ Kの容量で治療を管理する経口胃管栄養法による腹腔内（ip）注射又は10ミリリットル/ kg体重によるg体重。腹腔内注射のために、手動でマウスを拘束し、29 Gの針を用いて腹部の右下の象限に注入する。強制経口投与の場合は、手動でマウスを拘束し、直立動物を開催しています。舌の上と口の奥に口の中で強制経口チューブを置きます。食道を通って胃にチューブを通すためのわずかな圧力を適用します。治療を管理するには、注射器のプランジャーを押し下げる。プランジャーは簡単に押し下げていない場合は強制経口投与針を除去し、再配置される必要があります。使用直前に、TKI製剤を調製。
- 過バナジン酸処理が所望される場合、（ステップ1.1.4）上記のように収穫前PV溶液を20分を調製し、1μMMgCl 2および100 U / mlのDNアーゼ（120μlのPV + 880μlの培地）で培地中に希釈する。注：PVは、希釈後少なくとも1時間は安定である。
- APでのCO 2ナルコーシスにより動物を犠牲にpropriate時間（s）治療後。骨が完全に露出されるように、脚全体の毛皮、皮膚および筋肉を除去することにより大腿骨を解剖。ただ股関節の下にして、再度、膝関節の上はさみを解剖してクリッピングすることによって大腿骨を取り除く。ペトリ皿と1ミリリットルの冷PBSまたはシリンジと27Gの針を用いて希釈されたPVソリューションと面一に骨髄へ転送します。 PVで処理する場合は、10分間、暗所でRTでインキュベートする。
- 溶解液を準備し、（ステップ1.1.6-1.2.5）上に示したように、リン酸化タンパク質と総タンパク質レベルを分析。
- デンシトメトリーを用いて、各サンプルについての相対的ホスホ - タンパク質および総タンパク質レベルを定量する。車で処置した動物の平均phospho-protein/total-protein値にphospho-protein/total-protein相対を計算します。
5。すべての異種移植モデルにおけるのTKIの抗白血病活性の評価
- 必要であれば、RS-2000照射1日のPRIOで放射線の200センチグレイにマウスを公開移植するには、r。 （ステップ4.1）上記のように白血病細胞株で移植マウス。移植グループあたり少なくとも6匹のマウス。耳パンチによりマウスを識別します。あるいは、黒のマーカーは、それらの尾にハッシュマークを有するマウスを同定するために使用されてもよい。試験中のケージメイト攻撃の可能性を減らすためにケージに濃縮を追加します。
- （ステップ4.2）は、上記専用としてTKIまたは媒体でマウスを扱う。身体検査、体重測定によって毎日のマウスの健康状態を監視します。白血病の予想される症状（活動レベル、体重減少、後肢麻痺、および眼の感染症を低減する）。体重減少の10％以上-15％は通常2日以内にマウスの死と関連し、典型的には、標準的な動物実験委員会の要求に応じて、死亡のサロゲートエンドポイントです。
- 毎週最大2倍のin vivo生物発光イメージングシステムを介して、白血病の移植や開発を監視します。殺菌に200XのD-ルシフェリン原液（30 mg / mlの）を調製ル水。 D-ルシフェリンが完全に溶解するまで反転により穏やかに混合する。すぐに使用するか、またはアリコートし、-20℃で凍結するin vivoでの生物発光イメージングシステムを用いて画像化する前に、室温で、D-ルシフェリンのアリコートを解凍し、0.2μmのフィルターで滅菌し15 mg / mlの、フィルターの最終濃度になるようにPBSで1:2に希釈する。
- 酸素1.5％吸入イソフルランで画像化する前に、マウスを麻酔。筋弛緩、運動の喪失、つま先のピンチ刺激に対する応答の喪失を特徴と十分な麻酔を、監視します。
- すぐに画像化する前に、腹腔内注射（体重の15 mg / mlのルシフェリン/ gを10μL）で150 mg / kg体重のD-ルシフェリンを管理します。
- シーケンシャル30、60および90秒のエクスポージャーおよび120秒の露出で、最終的な画像の画像の2シリーズをキャプチャするためのin vivo生物発光イメージングシステムを使用してください。画像形成後、ケージにマウスを返し、麻酔からの回復のために監視します。に応じて、生物発光の強度、露光時間を変化させることができる。最適な露光時間は、所与のモデルに対して所定の個々の時点の信号強度は、試験全体を横切る匹敵するような一貫性が保たれるべきである。
- リビングイメージ3.2取得と解析ソフトウェアを用いて各マウスの生物発光強度を決定する。各マウスを上に同じ大きさの関心領域（ROI）を描画することで光子が/秒で測定された全光束の値を決定します。
- 15％を超える体重減少が発生した場合に、麻痺を呈する、瀕死状態、または試験終了時場合、CO 2の暴露および頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げる。マウスおよびレコードの観測を解剖（脾臓、肝臓、またはリンパ節の拡大、例えば 、淡骨髄）。 27 G針を用いて大腿骨および冷PBSと同一平面骨髄を分析。
- 5分間2,500 rpmで微量の細胞を回収します。 2％のFBSを含有するPBS中に細胞を再懸濁し、室温で5分間インキュベートする。20 mg / mlのDAPI（4,6 -ジアミジノ-2 -フェニルインドール二塩酸塩、1:1,000）およびFITC-結合α-hCD45（1:100）またはマウスIgG 1アイソタイプコントロール抗体（1:100）で細胞を採取し、染色。フローサイトメトリーを使用して、白血病の生着を評価します。実行可能な人口上のゲート（DAPI陰性）およびCD45 +細胞（％骨髄芽球）の割合を決定。
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Representative Results
ここに提示アッセイはTKI類によって媒介される生化学的および機能的効果を評価し、 インビトロおよびインビボでの標的阻害の程度に基づいて、新規な化合物をランク付けするために使用することができ、コロニー形成の低減、およびNSGマウスにおける白血病誘発における遅延ルシフェラーゼを移植白血病細胞をタグ付けされた。
イムノブロット分析はTKI類での処置後の白血病細胞における標的タンパク質のリン酸化形態活性の阻害を決定するために利用された。のTKIによる治療は、リン酸化タンパク質の量の用量依存的減少をもたらした。 図1は 、TKI Cは最も強力である急性白血病細胞株3つの異なるTKI類による標的のリン酸化の阻害を示すTKI Bはあまり強力であり、TKI影響を与えない。従って、このアッセイは、細胞ベースのモデル系における生化学的活性の効力に基づく化合物のランク付けを可能にする。に示した例では図1は 、免疫沈降およびホスファターゼインヒビター過バナジン酸の使用による抗原の濃縮は、解釈可能な結果を達成するために必要であった。その理由は、このチロシンキナーゼのタンパク質リン酸化が極度に不安定であること、あるかもしれない。
急性白血病細胞の発癌特性に対するTKI類の効果を研究するために、コロニー形成アッセイを使用した。私たちは、メチルセルロースベース（ALL）培地中で、ソフト寒天（AML）でコロニーを形成するためのターゲット依存性白血病細胞の能力を調べた。 図2Aに示す例では、コロニー数の統計的に有意な減少がTKIで処理した後ALL細胞株において観察された。同様の結果が、軟寒天中でのTKIによる治療後のAML細胞株において観察された。 図2Bに、TKIによる治療を受けて減少したコロニー数傾向がありますし、減少は用量依存的に見えますが、違いは、STはありません反復実験間の変動の結果としてatistically重要な。 図2Aを図2Bの相対的に大きな標準誤差に注意してください。半固形培地およびウェルまたはプレートに半固形培地の平等な分配への細胞の十分な混合は、クローン原性アッセイで複製間の一貫性のために重要である。めっき前に、生細胞の正確な計数実験間の一貫性を確保することも重要である。 図2Cは 、コロニーの偏在でプレートを示してソフトアガー中の泡、不完全プレート（右パネル）で軟寒天の広がりと比較（左パネル）に十分なメッキプレート。メチルセルロースは、インキュベーション期間中に乾燥しないことを確実にするために、各皿に滅菌水のプレートを含むことも重要である。メチルセルロース培地の脱水は、その密度が変化し、それによって潜在的に、コロニーを形成する細胞の能力を低下させる有用な結果の発生を防止する。
TKIは、インビボで標的タンパク質を阻害することができるかどうかを決定するために、ウェスタンブロット分析は、急性白血病細胞株を移植したNSGマウスから単離した骨髄芽球においてリン酸化タンパク質と全タンパク質レベルを調べるために用いた。 図3に示す例では、薬力学的分析は、ビヒクルのみで処置したマウスに比べTKIで処置したマウスから単離された白血病性芽球においてリンタンパク質レベルの減少を明らかにした。これらの研究は、これらの化合物が骨髄に到達し、効果的に標的を阻害することが確認され、 インビボでのTKIによる治療後の白血病細胞において自己リン酸化の阻害を実証する。 TKI Dは、このアッセイにおいて、TKIのEよりも活性であった。例は、標的リンタンパク質を安定化し、検出を可能にするのに必要な過バナジン利用を示す。
NSG MIの急性白血病の同所マウス異種移植モデルCEのは、ルシフェラーゼ発現ALL細胞株は、インビボで発癌性にTKIによる治療の効果を評価するために使用されたと注入した。 図4に示すように、TKIで処置したマウスは、ビヒクルのみで処置したマウスに減少し、白血病の負担を相対的に示す、生物発光の有意に低いレベルを有していた。処置の10日後、全てのマウスは、ビヒクルおよびTKIで処置した動物で処置した動物の間で有意な差はなかった生物発光の低レベルを有していた。 TKIの高用量で処置したマウスは、はるかに低い信号強度を有していたとは対照的に、19日までに、処置後、ビヒクル処置マウスは、（86.12±19.17フォトン/秒）の有意に高い生物発光強度を有していた（29.64±9.04フォトン/秒） 。
図1。 TKIは、 インビトロで標的タンパク質のリン酸化を阻害する。細胞培養物を1時間TKI A、TKI B、又はC TKIの指示濃度で処理した。過バナジン酸は、標的タンパク質のリン酸化形態を安定化するために3分間細胞培養物に添加した。標的タンパク質は、細胞溶解物から免疫沈降し、リン酸化タンパク質と総タンパク質を、ウエスタンブロットによって検出した。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。 TKIは ALL細胞は、メチルセルロース（A）中に播種し、AML細胞がsに播種した。メチルセルロースおよび軟寒天における急性白血病細胞株におけるコロニー形成を減少させるTKIまたはDMSO（ビヒクルコントロール）の存在下でしばしば寒天（B）。コロニーは、培養中の2週間後に計数した。平均値および標準誤差は三連のプレートに由来した。コロニーの最適分布（左パネル）またはコロニーの不均等な分布と、部分的に剥離し、ソフト寒天（右パネル）と（C）の代表ソフト寒天プレートが表示されます。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。 TKIによる治療は、 インビボでリン酸化タンパク質レベルを低下させる。NSGマウスはALL細胞株を移植しただけ白血病の発症後TKI D、E TKI、またはビヒクルの単回投与で処置した。骨メートル矢印細胞は、大腿骨から採取し、従来の全細胞溶解物の調製過バナジン酸で処理した。ウェスタンブロットによる標的タンパク質の免疫沈降、およびホスホおよび総タンパク質の検出を行った。 Bシグナル強度をデンシトメトリーにより定量し、車両処理動物とリン酸化された標的タンパク質の相対的な割合を算出した。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4。 TKIによる治療は、ルシフェラーゼを発現するヒトALL細胞株を移植したマウスにおける疾患の進行を遅延させる。NSGマウスの尾への注射によって、ルシフェラーゼ形質導入ALL細胞のモノクローナル集団を移植した静脈。 D-ルシフェリンを腹腔内に注射し、そして生物発光画像は、（ビニング：8、FOV 19.6はf / 1を停止し、露出時間120秒）で2回、毎週採取した。擬似カラー画像は、白血病細胞を移植したマウスにおける経時的な増加生物発光強度及びTKIで処置した動物における生物発光強度の用量依存的減少を実証示す。のB定量は、それぞれの研究グループの生物発光強度と標準エラーを意味します。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
この原稿は、急性白血病の治療における新規チロシンキナーゼ阻害剤の評価のための効果的な戦略について説明します。このアプローチを用いて、生化学的及び抗白血病活性は、 インビトロでの細胞ベースアッセイにおいて最初に評価し、次いで、インビボで異種移植片モデルにおいてれる。イムノブロット分析は、正常のTKIによる治療後の白血病細胞における標的チロシンキナーゼの阻害を実証するために直接細胞内の複数の化合物の効力を比較するために利用された。ここで紹介するプロトコルでは、過バナジン酸はリンタンパク質を安定化するために使用し、標的タンパク質を免疫沈降により濃縮した。これらの測定は、ウェスタンブロットによる検出を可能にするには不十分であった場合には、リンタンパク質のレベルも、または過バナジン酸の有無にかかわらず、リガンドの添加によって増加させることができた。同様に、リガンドは、薬力学的研究のための骨髄をフラッシュするために使用される溶液に添加することができる。リーゲントを精製することができ、または、いくつかのケースでは、ウシ胎児血清の成分として提供することができる。それが可能な場合は、直接標的タンパク質の活性を評価することが好ましいが、これらの方法は、自己リン酸化チロシンキナーゼの検出を可能にしないことにしても、下流の標的はまた、標的阻害の評価のために使用することができる。多くの細胞タンパク質に影響を与える非選択的ホスファターゼ阻害剤である過バナジン酸を用いた実験の結果を解釈する際に注目すべきは、注意が必要です。このため、過バナジン酸は、下流のシグナル伝達成分における変化の検出のために使用すべきではない。
動物モデルでの試験前に、白血病細胞におけるTKI類によって媒介される抗白血病活性を確認することが望ましい。これらの研究のために我々は、メチルセルロースまたは軟寒天培地中のクローン原性アッセイに依存しています。他のアッセイはまた、培養において抗腫瘍効果を評価するために使用することができるが、コロニー形成アッセイは、多くの場合、広報され液体培養で増殖および/ または生存性を評価する、より伝統的なアッセイとin vivoでの有効性の相対的なedictive。しかしながら、これらのアッセイはTKI類によって媒介される抗白血病活性のメカニズムを評価するために、コロニー形成アッセイと共に使用されてもよく、また、目的の細胞株がコロニーを形成しないことが発生した場合に有用であり得る。具体的には、切断された/活性化カスパーゼのレベルを決定するためにフローサイトメトリーアッセイを用いてTKI類を用いた治療に応答してアポトーシスの誘導を評価するために有用であり得る、細胞表面へのアネキシンVの結合を増大し、又はYOPRO-1-ヨウ化物の差動取り込み。同様に、抗白血病活性に寄与する可能性増殖または分化の誘導を減少させた。このように、増殖曲線の増殖および細胞形態および分化段階を決定するために検査することができる細胞表面マーカーの発現の変化を評価するためのTKIの存在下および非存在下で生成することができる。クローン原性の使用アッセイは、医薬品開発の分野で確立されたとのTKIの評価のための費用効果的なツールとなっています。しかしながら、（成長因子および他のサプリメント、血清組成の変動、およびTKI溶液のpHの差の付加を含む）、培養条件の体系的変化は、コロニーの成長及び化学的感受性9,10の両方に影響を及ぼし得ることが知られている。従って、培養条件の一貫性は、このアッセイで再現性のために重要である。細胞またはTKIの偏在も実験的治療（ 図2C）の有効性のmischaracterizationにつながることができます。薬物曝露後のコロニー計数やめっき用に複数の時点の付加評価において抗増殖効果を媒介しかし治癒的ポテンシャル7を有していない薬物を区別するのを助けることができる。
ここで説明するin vivo試験は、クリニカへの道上の重要なステップを表しているTKIのLアプリケーション。標的阻害を実証する薬力学的研究は、有効性を評価するために、その後の研究のための適切な用量および投与の頻度を定義するために重要である。ほとんどの場合、標的タンパク質の完全かつ連続的な抑制を達成するために、これはより一日一回以上の治療を必要とすることが好ましい。さらに、異種移植モデルにおける白血病誘発および生存率の上昇の阻害は、骨髄中の完全かつ連続的な生化学的阻害に必要とされるよりもTKIの高い用量を必要とし得る。白血病は複数のサイトで確立し、TKI類への曝露が脳を含む、異なる解剖学的位置に不均一であってもよいので、これは発生することがあり、またはそれは（アクティブな標的タンパク質の限定された残りの量を検出するための障害の原因となり、アッセイの感度の限界を反映している可能性がすなわち不完全な標的阻害）。それにもかかわらず、彼らの最大投与される伝統的な細胞傷害性療法とは異なり、耐量、より腫瘍選択的に分子標的薬は、標的タンパク質の生化学的阻害のために十分であるが、有意な毒性と関連していない低用量で同等に有効であってもよい。したがって、このクラスの薬剤のために、異種移植片モデルにおける白血病の進行に対するTKIの効果を評価するための最初の研究は、しばしば、標的の完全かつ連続的な抑制を得るために必要な最小限の用量を利用する。白血病の進行または生存に影響は観察されない場合は毒性が観察されるまで、投与量を増加させることができる。これらのモデルは、それによって、その後の現像臨床プロトコルを知らせる標準的な白血病治療と組み合わせて投与TKIの効果を調査するために使用することができる。
ルシフェラーゼ発現細胞を用いて、急性白血病の異種移植モデルの確立は、より伝統的な異種移植片モデル上の大きな進歩を表しており、大幅に加速する可能性を有する薬剤の発見および開発11のプロセス。生物発光イメージングすることにより、試験のために必要な動物の数を減少させ、白血病の負担を非侵襲的に長手方向の決定を可能にし、また、疾患の解剖学的位置に関する情報を提供することができる。また、TKI類の潜在的な臨床ユーティリティを拡張する目的で、生物発光イメージングを再現初代ヒトルシフェラーゼタグ付き患者サンプル12の移植後に達成することができる。しかし、生物発光画像の解釈は、発光セルの位置の不確実性に挑戦することができ、したがって、 生体内生物発光イメージングに同一の条件の下で13同じ動物をフォローする半定量的なツールとしてのみ使用されるべきである。
複数の化合物はここに記載のアッセイにおいて有意かつ匹敵する活性を有することが幸運な場合には、追加の基準をさらにランキンのために使用され得ること化合物Gは、相対的な化合物の合成の容易さ、溶解性、経口バイオアベイラビリティの程度、薬物動態学的特性、および毒性研究が含まれています。まとめると、これらのデータは、臨床試験への進行のための最適な化合物の同定を可能にし、臨床試験を可能にするために食品医薬品局（FDA）による新薬（IND）申請の提出を支援するために必要であるべきである。クリニックへのこれらの新規薬剤の進歩のために必要な、これらの重要な前臨床データを生成した後、健康の癌治療評価プログラム（CTEP）の国立研究所の利用が考慮されるべきである。このプログラムでは臨床試験はトランスレーショナルリサーチを中心に、新たな抗がん剤を評価するために後援している。ケア保護への特許出願の提出と、構造体の説明および新規化合物の合成を含む前臨床データの公開プレゼンテーションを調整するために取られるべきである知的財産権をトン。物質の組成物および使用方法を保護する特許出願は、出願されるまで、一般に、データは公的に提示されるべきではない。
結論として、我々は、急性白血病の治療のための治療剤としての新規のTKIの可能性を調査し、評価する効率的な戦略を示した。白血病細胞における標的阻害は、培養及びヒト白血病異種移植片を有するマウスの骨髄から単離された両方の、イムノブロットによって評価することができる。標的阻害の機能的重要性は、生物発光イメージングとクローン原性アッセイおよび同所性マウス異種移植モデルを用いて評価することができる。一緒にこれらのアッセイは、診療所へのこれらの新規の翻訳エージェントの進歩のために必要な重要な前臨床データを提供する。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
in vivoイメージングコロラドがんセンターの大学のIVIS共有リソース（助成金P30-CA046934でサポートされている）を用いて行った。フローサイトメトリーは、コロラド大学がんセンター（助成P30CA046934でサポートされている）、フローサイトメトリー共有リソースで実施した。この作品は、国立衛生研究所（DKGへRO1CA137078）によって部分的にサポートされていました。 ABLSは米国小児科学会、アメリカ小児科学会、母子保健と人間開発のユニスケネディシュライバー国立研究所（K12-HD000850）からの補助金によって支え小児科学者育成プログラムのフェローである。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
References
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