Summary
Рецептор тирозинкиназы эктопически выражается в многих видов рака и были определены в качестве терапевтических мишеней в острый лейкоз. Эта рукопись описывает эффективной стратегии доклинической оценки ингибиторами тирозинкиназы для лечения острого лейкоза.
Abstract
Рецепторные тирозинкиназы были вовлечены в развитие и прогрессирование многих видов рака, в том числе как лейкемии и твердых опухолей, и являются привлекательными druggable терапевтические мишени. Здесь мы опишем эффективную стратегию из четырех шагов для доклинической оценки ингибиторов тирозинкиназы (ИТК) в лечении острых лейкозов. Первоначально вестерн-блот анализ используется для подтверждения целевого торможение в культивируемых клеток лейкемии. Функциональная активность затем оценивали с помощью клоногенные анализов в метилцеллюлозы или мягких агара культур. Экспериментальные соединения, которые демонстрируют активность в клеточных анализов культуры оцениваются в естественных условиях с использованием NOD-SCID-гамма (НСГ) мышей пересаженных ортотопически с линиями клеток лейкемии человека. Первоначальные в естественных условиях фармакодинамических исследования оценки целевой ингибирование в лейкозных бластов, выделенных из костного мозга. Этот подход используется для определения дозы и схемы введения, необходимое для эффективного целевой Блокировкаионная. Последующие исследования оценить эффективность ИТК в естественных условиях с использованием люциферазу выражающее лейкозных клеток, что позволяет для неинвазивного биолюминесцентной мониторинга бремени лейкемии и оценки терапевтического ответа, используя в естественных условиях системы визуализации биолюминесценции. Эта стратегия была эффективной для оценки ИТК в пробирке и в естественных условиях и может быть применен для идентификации молекулярно-целевых агентов с терапевтическим потенциалом или для прямого сравнения и определения приоритетности нескольких соединений.
Introduction
Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) является наиболее частым злокачественным новообразованием у детей 1,2. Общая выживаемость для педиатрического B-клонов все (В-ОЛЛ) составляет около 85%, но конкретные биологические подтипы, в том числе Т-линии ВСЕ (Т-ОЛЛ), есть еще более плохой прогноз даже при нынешних терапевтических протоколов. Дальнейшее лечение рецидивов ОЛЛ остается проблемой 3. Хотя большинство взрослых пациентов с острым лейкозом достижения ремиссии при авансовые химиотерапии, многие пациенты все еще страдают рецидив 4. Текущие химиотерапевтические схемы в лечении острого лейкоза как известно, вызывают токсичности связанных краткосрочные и долгосрочные побочные эффекты. Таким образом, менее токсичные методы лечения, которые специально направлены на раковые клетки с минимальным влиянием на нормальные ткани крайне необходимы. В последние годы акцент был сделан на развитии романа, молекулярно-целевых агентов с специфичности для раковых клеток, часто с использованием итеративного химиюдля создания нескольких активных соединений, которые затем должны быть сопоставлены и приоритетных 5. Эта рукопись описывает эффективной стратегии доклинической оценки ИТК для лечения острого лейкоза, который может быть использован для оценки одного соединения или для непосредственного сравнения нескольких соединений с целью облегчения разработки лекарств.
Метод, представленный здесь состоит из четырех шагов. Во-первых биохимический (1) и анти-лейкоз (2) деятельность соединения (ий) оцениваются в клеточной культуре, то ингибирование мишени подтвержден на животных моделях (3), и, наконец, терапевтическая эффективность в ИТК (ы) определяется в ортотопической модели ксенотрансплантата лейкоз (4). Для этих исследований, важно выбрать соответствующие клеточные линии, которые являются представителями наиболее распространенных биологических подтипов. Клеточные линии должны быть выбраны, которые оба, обозначения целей интерес и не имеют цель интерес для расследования ли мед биологические эффектыiated путем ингибирования мишени. Это особенно важно для развития низкомолекулярные ингибиторы, которые имеют мимо ворот эффекты, которые могут быть важны для противоопухолевой активностью. Кроме того, необходимо выбрать клеточную линию, которая зависит от цели функциональных эффектов, таких как пролиферации или выживания. Предварительные исследования по валидации, цель (вне рамки данной статьи) с использованием РНК-интерференции или другие специальные средства для подавления цель может быть использован для выявления целевых зависит от клеточных линий. Желательно также, чтобы выбрать клеточные линии, которые могут образовывать мышиных ксенотрансплантатов, например, что результаты клеточной культуры можно более непосредственно переводятся в естественных условиях экспериментов в.
Для оценки биохимической активности, опосредованной ИТК в лейкозных клеток, снижение фосфорилирования рецептора может быть использована в качестве индикатора целевой торможения. Вестерн-блот анализ или ELISA анализы могут быть использованы, в зависимости от доступности и специфичности антител.Если антитела с достаточной специфичностью к мишени имеются, анализы ELISA, являются предпочтительными, поскольку они более количественный и эффективным. В случаях, когда антитела с достаточной специфичностью для ELISA отсутствуют, вестерн-блот анализ может быть необходимым. В этом случае иммунопреципитации из большого количества лизата может быть полезно для обнаружения целей, которые находятся в низком избытке. Такой подход особенно актуален для измерения фосфо-белков, которые могут иметь короткий период полураспада для обеспечения быстрых изменений в передаче сигналов в ответ на стимулы окружающей среды. Некоторые фосфорилированные белки чрезвычайно лабильный, скорее всего, в результате комплексообразования с фосфатаз. Для надежной и последовательной обнаружения этих фосфорилированными белков, он также может быть возможным для лечения клеток с pervanadate, необратимого белок-тирозин фосфатазы ингибитора 6, для стабилизации фосфо-белок до получения целых клеточных лизатов.
Копределить результаты ли биохимическая активность эффектов противоопухолевых, целевые зависит от биологических процессов можно наблюдать в экспериментах на основе клеток. Для лейкоз клеточных линий, анти-лейкоз деятельность опосредована ИТК можно оценить, используя образование колоний анализов, выполняемых в метилцеллюлозы или мягком агаре 7. Мягкий агар может быть предпочтительным, поскольку это является твердой среды, что является более склонны к манипуляции, если повторное лечение с ИТК необходимо. Хотя многие острые myloid лейкоз (AML) клеточные линии будут образовывать колонии в мягком агаре, большинство все клеточные линии будут только образовывать колонии в метилцеллюлоза, который представляет собой полутвердый носитель. Хотя возможно, чтобы обновить среду и / или в ИТК метилцеллюлозы культур, только небольшие объемы могут быть использованы и с ограниченной частотой. Кроме того, он является более трудным для окрашивания колоний, не нарушая их в метилцеллюлозы. Предварительные исследования должны определить способность соответствующих клеточных линий образовывать колонии в метилцеллюлозы и / или мягком агаре и тон оптимальная плотность клеток в культуре, так что колонии не перекрываются и в достаточном количестве для получения статистически соответствующие данные (обычно 50-200 колоний на 35 мм пластины).
В то время как анализы в пробирке являются надежными и экономически эффективными и имеют меньше этические последствия, чем целых экспериментах на животных, продвижения терапевтических соединений требуется доказательство эффективности и безопасности на животных моделях. Для естественных условиях исследования в, острый лейкоз человеческие клеточные линии могут быть ортотопически пересадить в NOD.Cg-Prkdc SCID я l2rg tm1Wjl / SZJ (ГЯП) мышей и ИТК могут быть легко введены путем инъекции или желудочный зонд. Некоторые клеточные линии могут потребовать экспозиции мышей NSG к низкой линии в зависимости от дозы радиации клеток для того, чтобы установить ксенотрансплантатов, и в этом случае мышей не могут переносить желудочный зонд без восстановительного периода 5-10 дней после облучения. Эта рукопись описывает поколение B-ОЛЛ и T-ВСЕХ ксенотрансплантаты помощьюконкретные клеточные линии (697) и Jurkat в качестве примеров, но ксенотрансплантатов могут быть установлены в NSG мышей с использованием широкий спектр клеточных линий. В том случае, другие клеточные линии более применимо, требование для облучения, оптимальное количество клеток к трансплантации, и времени начала заболевания и прогрессирования должны быть определены экспериментально. В идеале, эти модели будут иметь полную пенетрантность (каждое животное пересадить заболевает лейкемией), последовательные кинетики (лейкемия прогрессирует же у всех животных), и разумную окно лечения (в идеале 20-30 дней между началом лечения и снятия с изучения в связи с болезнью) . Число клеток, трансплантированных может быть увеличено, чтобы улучшить пенетрантность и кинетическую консистенцию или уменьшена для улучшения обработка окна, если это необходимо.
Чтобы определить, TKIs посредником целевой ингибирование в естественных условиях, образцы собирают из мышей с лейкемией ксенотрансплантатов после обработки ИТК или только транспортного средства. В идеале, дозад расписание администрации для этих экспериментов руководствуются фармакокинетических исследованиях, которые часто могут быть выполнены коммерческими лабораториями и выходят за рамки этой статьи. Если фармакокинетические данные доступны, концентрация соединения, необходимую для эффективного целевого торможения в культуре клеток и максимальной концентрации в сыворотке после однократной дозы ИТК может быть использован, чтобы определить начальную дозу для исследований на животных. Фармакокинетические исследования могут также информировать времени сбора проб после лечения для фармакодинамических исследований и пути введения. Торможение цели можно оценить в любом пораженного органа, но ткани, которые наиболее легко собираются и обрабатываются, являются предпочтительными. Самые острые лейкозы клеточные линии установить в печени, костном мозге, селезенке, периферической крови и центральной нервной системы, хотя конкретные поражаемые органы и степень приживления в этих органах колеблется между моделями. Протокол, представленные здесь оценивает Phosphингибирование о-белок в костном мозге с помощью Вестерн-блот анализ, но твердые органы могут быть легче последовательно собирают и требуют минимального или без обработки перед замораживанием, что позволяет меньше возможностей для деградации фосфо-белков во время сбора и обработки образца. Иммуногистохимическое также может быть использован для оценки солидных опухолей или органы, пострадавших от лейкемии.
Наконец, терапевтическая эффективность в ИТК (ы) определяется в ортотопических моделей лейкемии ксенотрансплантатных. Для этих исследований, сроки начала лечения может варьироваться, так что заболевание более или менее установлено. Лечение может начаться немедленно после трансплантации для первоначальных исследований, а затем быть отложено в последующих исследованиях, пока бремя значимом заболевании не обнаружено более тесно приблизить диагностическую модель лечения. В идеале, эти животные модели также имеют потенциал для неинвазивного измерения бремени болезней. Мы оптимизировали методы введения светлячка ЛюцифераГен азы в клеточных линиях лейкемии использованием вирусоподобные частицы, что позволяет для неинвазивного, продольной анализа начала заболевания и прогрессирования и оценки бремени болезней в костном мозге и твердых органов. Важнейшее значение для такого подхода является использование моноклональных люциферазы с метками клеточных линий, чтобы предотвратить изменчивости в развитии люциферазой выражая лейкемии, связанной с использованием поликлональных клеточных линий и не имеет отношения к лечению с ИТК 8.
Взятые вместе, эти шаги могут быть использованы для оценки одного ИТК или для прямого сравнения и ранжирования нескольких ИТК. В то время как протоколы, представленные здесь, сосредоточены на разработке ИТК, эти методы могут быть адаптированы к другим объектам и соображения, касающиеся развития анализа описаны. Таким образом, эта стратегия может быть более широкое применение в доклинических оценки молекулярно-целевых средств для лечения острого лейкоза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты с участием животных следовали нормативных стандартов, утвержденных в Университете Колорадо комитета уходу и использованию животных институциональной. Продемонстрировали Протокол был одобрен Университета Колорадо комитета уходу и использованию животных институциональной.
1. Phospho-белок Вестерн-блот
- Подготовка лизатов
- Культура клеточные линии, экспрессирующие рецептор тирозинкиназы, представляющих интерес. Урожай клеток и пластины 3-5 х 10 6 клеток / образец в 400 мкл среды для выращивания в культуре ткани блюдо 48-а. Инкубировать при 37 ° С в 5% CO 2 в течение 2-3 часов.
- Добавить 100 мкл раствора 5x ИТК в ростовой среде и инкубировать в течение 60 мин.
- Подготовка лизирующего буфера 50 мМ HEPES (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10% (об / об) глицерина, 1% (объем / объем) Тритон Х-100, и ингибиторы протеазы. Если культуры не будут относиться с pervanadate до сбора урожая, добавить ингибиторы фосфатазы (orthova 1 мМ натрияnadate и 0,1 мМ молибдата натрия) в буфере для лизиса.
- Подготовка pervanadate (PV) ингибитор фосфатазы решение непосредственно перед использованием. Приготовьте 0,3%-ный раствор перекиси водорода (Предостережение) в холодном забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) в темном трубки на льду (1:100 разбавление 30% раствора а). Отварить аликвоты 0,2 М ортованадат натрия (О.В., ВНИМАНИЕ) исходного раствора в течение 5 мин. Развести 1:10 в PBS, чтобы сделать 20 мМ раствора О.В. при комнатной температуре (RT). Смешайте 0,3% пероксида водорода и 20 мМ OV 1:01 и инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Развести PV в полной среде (60 мкл П.В. + 940 мкл среды). Добавить 100 мкл разбавленных PV / лунку. Инкубировать при 37 ° С в 5% СО 2 в течение 3 мин, а затем поместить пластину на льду.
- Сбора клеток в холодной микроцентрифужные пробирки при 2500 оборотах в минуту в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 120 мкл буфера для лизиса. Инкубируют на льду в течение 15 мин. Уточнение лизата в холодном микроцентрифуге при 6000 оборотах в минуту в течение 3 минут. Трансфер Супеrnatant к свежей холодной трубки. Хранить при температуре -80 ° С.
- Иммунопреципитация
- Спином вниз Белок г сефарозы в микроцентрифуге при 1000 оборотов в минуту в течение 1 мин. Удалить супернатант и мыть шарики 2x 1 мл холодной PBS. Добавить равный объем PBS, чтобы сделать 50% суспензии. Добавить первичного антитела и 20 мкл 50% белка G шарики к каждому образцу. Выдержите в течение 2 часов - O / N при 4 ° С на ротатора.
- Пульс вниз бисером в холодном микроцентрифуге при 9000 оборотах в минуту. Удалить супернатант и мыть шарики 2x 150 мкл холодного буфера для лизиса. Спин в холодной микроцентрифуге при 1000 оборотов в минуту в течение 1 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 20 мкл образца 2X SDS буфера с 2-меркаптоэтанолом (ВНИМАНИЕ). Используйте немедленно или хранить при температуре -80 ° С.
- Образцы кипятят в течение 5 мин и работать на SDS-PAGE трис-глицин геля. Передача белков на нитроцеллюлозную мембрану и обнаружить фосфо-белок помощью вестерн-блоттинга.
- Промыть блот водой, а затем инкубируют в 2% SDS, 62,5 мМ Трис (рН 6,8), 0.1 М β-меркаптоэтанола (ВНИМАНИЕ) в течение 30 мин при 50 ° С Промыть 2x водой, а затем моют в течение 60-90 мин в 5-6 изменений TBS-T, чтобы удалить зачистки раствора.
- Обнаружение всего-белок помощью вестерн-блоттинга.
2. Метилцеллюлоза Анализ
- Алиготе 4 мл метилцеллюлозы человеком базовой среды в 50 мл конические пробирки с использованием стерильного большого диаметра тупым концом иглы. (Примечание:. Метилцеллюлозы может быть аликвоты и хранили при -20 ° С. оттепели при комнатной температуре O / N перед использованием)
- Добавить 500 мкл 10х ИТК или транспортного средства в среде роста в 4 мл метилцеллюлозы и вихревой смеси в течение 10 сек.
- Урожай и кол клетки. Приготовьте суспензию клеток в ростовой среде в концентрации, которая является 10x выше, чем концентрация конечного элемента. Добавить подвеска 500 мкл клеток в метилцеллюлозы смеси. Vortex в течение 10 сек и оставьте на 10 мин для удаления пузырьков.
- Составьте 4 мл метилцеллюлозы смеси с помощью шприца 5 мл и стерильной крупэ родила тупым концом иглы. Избегайте составления пузыри. Разлить 1 мл смеси метилцеллюлозы в центре трех 35-мм тканевых культуральных планшетах. Вихревой посуду, пока нижний не будет полностью покрыта метилцеллюлозы.
- Для каждого метилцеллюлозы пластины, подготовить 10 см стерильного планшета для культуры ткани с двумя дополнительными 35 мм тканевых культур пластин, заполненных стерильной воды для обеспечения влажной среде. Место культуры в воде рубашкой инкубатор при 37 ° С в 5% CO 2 в течение 10-14 дней.
- Всего колонии через 1-2 недели. Колонии должны быть более чем 20 клеток и не перекрываются. Колонии можно пересчитать использованием инвертированного микроскопа, снабженного столике микроскопа с сеткой или с использованием автоматического счетчика колоний. Изменение размера колоний или морфологии в ответ на обращение с ИТК также должна быть оценена. Для улучшения обнаружения счетчик колоний, пятно колоний путем добавления 60-100 мкл (3 - (4,5-диметил-2-тиазолил) -2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромид зольution (МТТ, 5 мг / мл в H 2 O, магазин при -20 ° С, защищать от света, ВНИМАНИЕ) по каплям по поверхности каждой пластины и инкубации в течение 8 часов при температуре 37 ° С в 5% СО 2.
3. Мягкий Агар Анализ
- Подготовьте 1% благородную агар для нижнего слоя, 0,7% благородного агар для верхнего слоя и 2x роста среды. Равновесие 2x питательную среду в водяной бане при 42 °. Нагрейте 1% и 0,7% благородный агар в микроволновой печи (примерно 1 min/100 мл) и уравновешивают в водяной бане при 42 ° C. Смешать равные части 1% агара и 2x среды и отдельно 0,7% агара и 2x среды в 50 мл conicals. План 10 мл мягком агаре смеси / шесть-луночный планшет для каждого слоя.
- Этикетка 6-а чашки для тканевых культур. Заполните каждую лунку с 1,5 мл 1% мягкой агар смеси. Избегайте пузырей во время посева. Сухие пластины с крышками выходные в стерильных капот в течение 30 мин.
- Граф клеток. Приготовьте суспензию клеток в ростовой среде в концентрации, которая выше, чем 500x конечном Концентрац клетокна. Добавить клеточной суспензии в 0,7% агара смеси, хорошо перемешать и распределить 1,5 мл агара смеси клеток на верхней части 1% слое агара. Пусть верхний слой затвердевать в течение 30 мин.
- Приготовьте 1х питательную среду, содержащую Tki или управления транспортным средством. Добавить 2 мл среды с требуемой концентрации ИТК в верхней части топ слой агара.
- Выдержите культур в течение 10 дней при 37 ° С в 5% CO 2. Снимите и замените, покрывающий среды каждые 3 дня.
- Когда видны невооруженным глазом, аспирации наложение среднего колонии и добавить 200 мкл нитро-тетразолия синий раствор (1 мг / мл NBT в H 2 O, магазин при 4 ° С, защищать от света, ВНИМАНИЕ). Вернуться на инкубаторе в течение 24-48 часов. Переход к 4 ° С в течение по меньшей мере 2 ч до подсчета. Окрашенные плиты можно хранить при температуре 4 ° С в течение одного месяца. Всего колонии с помощью микроскопа или автоматизированный счетчик колоний.
4. Оценка Phospho-белка торможения в естественных условиях
- Сбор грлоктей растет в логарифмической фазе путем центрифугирования в настольную центрифугу на 1500 оборотов в минуту в течение 5 мин. Промывают клетки один раз стерильной PBS и ресуспендируют в PBS при соответствующей концентрации (обычно 1-5 х 10 7 клеток / мл). Трансплантации клеток в объеме 100 мкл в 6-12 недельных мышей NSG путем внутривенной инъекции в хвостовую вену с использованием инсулиновый шприц 28 г. Поместите животное в фиксатор, нагрейте хвост в стакане теплой воды, чтобы расширить вены и очистите хвост с хлоргексидином тампоном перед инъекцией. После инъекции надавливайте на месте инъекции, не используя стерильную марлю, пока остановки кровотечения. Пересадка не менее 3 животных / группа. Поддержание мышей на воде, содержащей 1 мг / мл гентамицина сульфат.
- Четырнадцать дней после трансплантации, лечения животных с ИТК или транспортного средства только и образцов урожая для анализа целевой торможения. Взвешивание животных и лечить с соответствующей дозы (мг / кг массы тела) из ИТК или транспортного средства. Администрирование лечение в объеме 5 мл / Kг веса тела путем внутрибрюшинного (IP) инъекции или 10 мл / кг массы тела перорально через зонд. Для инъекцией, сдерживать мышь вручную и ввести в правом нижнем квадранте живота, используя 29 г иглы. Для желудочный зонд, сдерживать мышь вручную и удерживайте животное в вертикальном положении. Поместите через зонд трубку в рот по языку и в задней части рта. Применить небольшое давление, чтобы пройти трубку через пищевод в желудок. Нажмите на поршень шприца для введения лечение. Если поршень не угнетает легко через желудочный зонд иглы должны быть удалены и перемещены. Подготовка Tki формулировки непосредственно перед использованием.
- Если pervanadate лечение желательно, готовят раствор PV 20 мин до сбора урожая, как описано выше (этап 1.1.4) и разбавленной в среде с 1 мкМ MgCl 2 и 100 ед / мл ДНКазы (120 мкл PV + 880 мкл среды). Примечание: PV стабилен в течение по крайней мере 1 ч после разбавления.
- Жертвоприношение животных по CO 2 наркоза в арраз (а) propriate после лечения. Проанализируйте бедра, удалив мех, кожу и мышцы от всей ноге, так что кости совершенно беззащитны. Удалите бедра, закрепляя с рассекает ножницы чуть ниже тазобедренного сустава и снова выше коленного сустава. Переезд в чашке Петри и флеш костного мозга с 1 мл холодного PBS или разбавленного раствора PV с помощью шприца и 27 г иглы. Если обработкой PV, инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 10 мин.
- Подготовка лизатов и анализировать фосфо-белка и всего-белковые уровни, как указано выше (шаги 1.1.6-1.2.5).
- Количественного относительную фосфо-белка и уровней общего числа содержанием белка для каждого образца с помощью денситометрии. Рассчитать phospho-protein/total-protein по отношению к среднему значению phospho-protein/total-protein для обработанных носителем животных.
5. Оценка по борьбе с лейкемией деятельности ИТК во всех Xenograft моделей
- При необходимости подвергать мышей до 200 сГр излучения в RS-2000 облучателя в один прекрасный день Приог к трансплантации. Пересадка мышей с лейкемией клеточных линий, как описано выше (шаг 4.1). Пересадка по крайней мере 6 мышей на группу. Определить мышей на слух удар. Кроме того, черный маркер может быть использован для идентификации мышей с метками на хвосты. Добавить обогащение в клетках, чтобы уменьшить вероятность клетка ответной агрессии в ходе исследования.
- Treat мышей с ИТК или транспортного средства только как описано выше (этап 4.2). Мониторинг состояния здоровья мышей ежедневно через осмотра и определения массы. Ожидаемые симптомы лейкемии (снижение уровня активности, потеря веса, паралич задних конечностей и глазных инфекций). Потеря веса более 10% -15%, как правило, ассоциируется со смертью мыши в течение двух дней и, как правило, суррогатная конечная точка смерти в соответствии со стандартными требованиями IACUC.
- Монитор приживление и развитие лейкемии через в естественных условиях системы формирования изображений биолюминесценции до 2 раз в неделю. Подготовьте D-люциферин маточного раствора 200x (30 мг / мл) в Steriле воды. Осторожно перемешать с помощью инверсии до D-люциферин полностью не растворится. Используйте немедленно или аликвоты и заморозить при -20 ° С До визуализации с использованием в естественных изображений биолюминесценции систему, оттаивать аликвоты D-люциферин при комнатной температуре и разбавленный 1:02 в PBS до конечной концентрации 15 мг / мл и фильтр стерилизуют через фильтр 0,2 мкм.
- Обезболить мышей до визуализации с 1,5% вдыхаемого изофлураном в кислороде. Монитор достаточную анестезию, характеризующийся мышечной релаксации, потеря движения и потеря ответ на схождение пинч стимуляции.
- Непосредственно перед визуализации, управлять 150 мг / кг массы тела D-люциферин И. П. инъекции (10 мкл 15 мг / мл люциферин / г массы тела).
- Используйте в естественных условиях системы визуализации биолюминесценции захватить 2 серии изображений с последовательных 30, 60 и 90 сек воздействия и получения окончательного изображения с сек воздействия 120. После обработки изображений, вернуться мышей в клетки и монитор для выхода из наркоза. В зависимости отИнтенсивность биолюминесценции, время экспозиции может изменяться. Оптимальные время экспозиции должны быть заранее определены для данной модели и все соответствует, так что интенсивность сигналов для отдельных временных точках сопоставимы по всей исследования.
- Определите интенсивность биолюминесценции для каждой мыши с помощью живой образ 3.2 сбор и анализ программного обеспечения. Определите значения общего потока, измеренные в фотонов / второй рисуя регионах, представляющих интерес (ROI) одинакового размера над каждой мыши.
- Жертвовать мышей CO 2 экспозиции и цервикальной дислокации если умирающие, демонстрируя паралич, в случае более чем 15% потерю веса, или в конце исследования. Проанализируйте мышей и записывать наблюдения (например, расширение селезенки, печени или лимфатических узлов; бледно костный мозг). Проанализируйте бедра и флеш костный мозг с холодной PBS с использованием 27 г иглы.
- Сбор клеток в микроцентрифуге при 2500 оборотах в минуту в течение 5 мин. Ресуспендируют клеток в PBS, содержащем 2% FBS и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре.Сбор клеток и пятно с 20 мг / мл DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид, 1:1000) и FITC-конъюгированного α-hCD45 (1:100) или мышь IgG управления 1 изотипа антитела (1:100) . Оцените приживление лейкоз с помощью проточной цитометрии. Ворота на жизнеспособной популяции (DAPI отрицательный) и определить процент CD45 + клеток (бластов% костного мозга).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализы, представленные здесь оценивать биохимические и функциональные эффекты опосредованы ИТК и может быть использована для оценки новых соединений на основе степени целевой торможения в пробирке и в естественных условиях, уменьшение образования колоний, и задержка в возникновение и развитие лейкоза у мышей трансплантировали NSG-люциферазы отмеченных лейкозных клеток.
Иммуноблот-анализ был использован для определения ингибирования активного фосфорилированной форме белка-мишени в лейкозных клеток после обработки ИТК. Лечение с ИТК привело к уменьшению зависимости от дозы в размере фосфорилированного белка. Рисунок 1 показывает ингибирование целевой фосфорилирования по трем различным ИТК в острой линии лейкозных клеток с ИТК С является наиболее мощным, ИТК B быть менее мощным, и ИТК не имеющий никакого эффекта. Таким образом, этот анализ позволяет ранжирование соединений на основе потенции биохимической активности в клеточной системе на основе модели. В примерах, показанных вНа рисунке 1, обогащение антигена иммунопреципитации и использованием фосфатазы ингибитора pervanadate были необходимы для достижения интерпретируемые результаты. Причина, что могло бы быть, что белок фосфорилирования этого тирозинкиназы является крайняя лабильны.
Чтобы изучить влияние ИТК на онкогенных свойствах острых лейкозных клеток, были использованы образование колоний анализы. Мы исследовали способность лейкозных клеток-мишеней в зависимости от образовывать колонии в метилцеллюлозы основе (ALL) среде и в мягком агаре (ПОД). В примере, показанном на фиг.2А, к статистически значимому снижению числа колоний наблюдали в линии клеток все после обработки с помощью ИТК. Аналогичные результаты были получены в клеточных линиях ОМЛ после обработки ИТК в мягком агаре. В рисунке 2B, есть тенденция к снижению числа колоний в ответ на обращение с ИТК и уменьшение появляется зависит от дозы, но разница не улatistically значительным в результате изменчивости между повторами. Обратите внимание на большие стандартные ошибки в рис. 2В относительно рисунка 2А. Широкие смешивание клеток в полутвердой среде и равное распределение полутвердой среды в лунках или пластин имеет решающее значение для согласованности между повторами в клоногенных анализов. Точная подсчета жизнеспособных клеток до обшивки Также важно обеспечить соответствие между экспериментами. Фиг.2С показана пластина с неравномерным распределением колоний, пузырьки в мягком агаре и неполный распространение мягком агаре в пластине (справа) и тарелка с адекватной покрытием для сравнения (слева). Чтобы гарантировать, что метилцеллюлоза не высыхает в течение инкубационного периода важно также включать пластины стерильной воды в каждую чашку. Обезвоживание из метилцеллюлозы среды изменяет свою плотность и тем самым снижает способность клеток образовывать колонии, потенциальнопредотвращения образования полезных результатов.
Чтобы определить, может ли TKIs ингибируют целевой белок в естественных условиях, вестерн-блот анализ был использован для изучения уровни фосфо-белок и общий белок-взрывов костного мозга, выделенных из мышей с трансплантированной NSG острого лейкоза линии клеток. В примере, показанном на фиг.3, фармакодинамических анализ показал снижение уровня фосфо-белка в лейкозных бластов, выделенных из мышей, обработанных ИТК относительно мышей, получавших только транспортного средства. Эти исследования показывают ингибирование фосфорилирования автоматического в лейкозных клеток после лечения ИТК в естественных условиях, что подтверждает, что эти соединения достичь костный мозг и эффективно ингибировать цель. ИТК D был менее активен, чем ИТК Е в данном анализе. Пример, показанный, требуемого использования pervanadate для стабилизации целевого белка фосфо-и позволить для обнаружения.
Ортотопическая мыши ксенотрансплантата модели острого лейкоза в NSG мисе вводили использовался люциферазы экспрессирующих ALL клеточную линию, чтобы оценить эффект лечения с ИТК на онкогенного потенциала в естественных условиях. Как показано на фиг.4, мыши, обработанные ИТК оказали значительное низкий уровень биолюминесценции, что указывает на уменьшение бремени по отношению к лейкемии мышей, получавших только транспортного средства. Через 10 дней лечения, все мыши имели низкий уровень биолюминесценции, которая не была значительно отличается между животными, обработанными носителем и животных, обработанных ИТК. В отличие от этого, на 19 дней после лечения, обработанных носителем мыши имели значительно большую интенсивность биолюминесценции (86.12 ± 19.17 фотон / сек), в то время как мыши, получавшие высокие дозы ИТК было гораздо меньшую интенсивность сигнала (29.64 ± 9.04 фотон / сек) .
Рисунок 1. ИТК ингибируют фосфорилирование белка-мишени в пробирке. Клеточные культуры обрабатывали указанными концентрациями ИТК A, B, ИТК или ИТК С в течение 1 часа. Pervanadate был добавлен в клеточных культурах в течение 3 мин, чтобы стабилизировать фосфорилированной форме белка-мишени. Целевой белок иммунопреципитировали из клеточных лизатов и фосфо-белка и общего белка были обнаружены помощью вестерн-блоттинга. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. ИТК уменьшает образование колонии в острый лейкоз клеточных линий в метилцеллюлозы и мягком агаре. ВСЕ клетки высевают в метилцеллюлозы (А) и ПОД клеток высевали в счасто агар (B) в присутствии ИТК или ДМСО (контроль транспортного средства). Колонии были подсчитаны через 2 недели в культуре. Средние значения и стандартные ошибки были получены из трех параллельных пластин. (С) Представительства мягкие агар пластины с оптимального распределения колоний (слева) или неравномерного распределения колоний и частично отдельный мягком агаре (правая панель) показаны. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. Лечение с ИТК снижает уровень фосфо-белка в естественных условиях. A NSG мышей были пересажены с клеточной линии ALL и обрабатывают одной дозы ИТК D, ИТК Е, или транспортного средства только после развития лейкемии. Кость мСтрелка клетки собирали из бедренных костей и обрабатывают pervanadate до получения целых клеточных лизатов. Иммунопреципитация белка-мишени, и обнаружения фосфо-и общего-белков по вестерн-блоттинга были выполнены. Интенсивность B Сигнал количественно с помощью денситометрии и фракции фосфорилированного белка-мишени по отношению к обработанных носителем животных была рассчитана. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 4. Лечение с ИТК задерживает развитие болезни у мышей с трансплантированной люциферазы, экспрессирующих человеческих Все клеточные линии. NSG мышей были пересажены с моноклональным населения люциферазы трансдуцированных все клетки с помощью инъекции в хвостовуювен. D-люциферин вводили внутрибрюшинно и биолюминесценции изображения были взяты два раза в неделю (Bining: 8, поле зрения 19,6, е / остановки 1, время экспозиции 120 сек). А изображения Псевдоцвет показаны свидетельствует о возросшей интенсивности биолюминесценции с течением времени у мышей с трансплантированной лейкозных клеток и уменьшение зависимости от дозы интенсивности биолюминесценции в животных, получавших с ИТК. В Количественное определение средней интенсивности биолюминесценции и стандартной ошибки для каждой исследовательской комиссии. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта рукопись описывает эффективную стратегию оценки новых ингибиторов тирозинкиназы при лечении острого лейкоза. Используя этот подход, биохимические и анти-лейкемии деятельности оцениваются сначала в клеточных анализов в пробирке, а затем в моделях ксенотрансплантатов в естественных условиях. Иммуноблот-анализ был успешно использован, чтобы продемонстрировать ингибирование тирозинкиназы цель в лейкозных клеток после обработки ИТК и непосредственно сравнить потенцию нескольких соединений в клетках. В протоколе, представленные здесь, pervanadate был использован для стабилизации фосфо-белок и белок-мишень концентрировали путем иммунопреципитации. Если эти измерения были недостаточны, чтобы обеспечить обнаружение вестерн-блот, уровни фосфо-белка также может быть увеличена добавлением лиганда, с или без pervanadate. Аналогичным образом, лиганд может быть добавлен к раствору, используемому для очистки костного мозга для фармакодинамических исследованиях. ЛиGand может быть очищен или, в некоторых случаях, могут быть предоставлены в качестве компонента фетальной бычьей сыворотки. В том случае, эти методы не позволяют для обнаружения автоматического фосфорилируется тирозинкиназы, ниже по течению цели также может быть использован для оценки целевой торможения, хотя предпочтительно, чтобы оценить активность белка-мишени непосредственно, когда это возможно. Следует отметить, что следует проявлять осторожность при интерпретации результатов экспериментов с использованием pervanadate, который является неселективный фосфатазы ингибитор, который влияет на многие клеточные белки. По этой причине pervanadate не должны использоваться для обнаружения изменений в последующих компонентов сигнализации.
До изучать на животных моделях, желательно, чтобы подтвердить анти-лейкемии активность, опосредованную ИТК в лейкозных клетках. Для этих исследований мы полагаемся на клоногенных анализов в метилцеллюлозы или мягкой агаровой среде. В то время как другие анализы могут быть также использованы для оценки противоопухолевые эффекты в культуре, анализы образование колоний часто более прedictive из Эффективность in vivo по отношению к более традиционным анализов, которые оценивают пролиферацию и / или выживание в жидкой культуры. Тем не менее, эти анализы могут быть использованы вместе с образование колоний исследованиях для оценки механизмов защиты от лейкемии активностью, опосредованной ИТК, а также может быть полезным в том случае, клеточная линия представляет интерес не образует колонии. В частности, это может быть полезно, чтобы оценить индукцию апоптоза в ответ на лечение ИТК с помощью проточной цитометрии анализов, чтобы определить уровни расщепленных / активированных каспаз, повышенное связывание аннексина V на поверхности клетки, или дифференциальный поглощение YoPro-1-йодистого . Аналогичным образом, снижение пролиферации или индукции дифференцировки может также способствовать анти-лейкемии активности. Таким образом, кривые роста могут быть получены в присутствии и в отсутствие ИТК для оценки пролиферации и клеточной морфологии и изменения в экспрессии маркеров клеточной поверхности могут быть рассмотрены с целью определить стадии дифференцировки. Использование клоногенныханализы хорошо известна в области разработки лекарственных средств и является экономически эффективным инструментом для оценки ИТК. Тем не менее, известно, что систематические изменения в условиях культивирования (в том числе добавлением факторов роста и других добавок, вариации состава сыворотки и различий в рН раствора ИТК) может влиять как рост колонии и химиочувствительность 9,10. Таким образом, последовательность в условиях культивирования имеет решающее значение для воспроизводимости в этом анализе. Неравномерное распределение клеток или ИТК также может привести к надуманным об эффективности экспериментальных методов лечения (рис. 2в). В дополнение оценки более чем одной точке времени для подсчета колоний или обшивки после воздействия лекарственного средства может помочь различать препаратов, которые опосредуют антипролиферативные эффекты, но не имеют лечебный потенциал 7.
В естественных условиях исследования в описанные здесь, представляют собой важный шаг на пути к Клиникел применение ИТК. Фармакодинамические исследования с целью подтверждения целевого ингибирование важны для определения соответствующей дозы и частоты введения для последующих исследований для оценки эффективности. В большинстве случаев желательно, чтобы достичь полного и непрерывного ингибирование белка-мишени, и это может потребоваться лечение более чем один раз в день. Кроме того, ингибирование возникновение и развитие лейкоза и увеличение выживания в моделях ксенотрансплантатных может потребоваться более высокая доза ИТК, чем требуется для полного и непрерывного биохимического торможения в костном мозге. Это может произойти из-за лейкемии устанавливает в нескольких местах и воздействие ИТК может быть гетерогенным в различных анатомических мест, включая мозга, или он может отражать ограничения в чувствительности анализа, в результате отказа, чтобы обнаружить ограниченные оставшиеся количества активного белка-мишени ( т.е. неполной целевой торможение). Тем не менее, в отличие от традиционных цитотоксических терапий, которые вводят в их максимумпереносимой дозы, тем больше опухоль-селективный молекулярно-мишенью агенты могут быть одинаково эффективны при более низких дозах, достаточных для биохимического ингибирования белка-мишени, но не связаны со значительными токсичности. Таким образом, для этого класса агентов, первоначальные исследования для оценки влияния на ИТК на прогрессирование лейкоза в моделях ксенотрансплантатных часто используют минимальные дозы, необходимый для получения полной и непрерывной ингибирование мишени. Если никакие эффекты на прогрессирование лейкемии или выживание не наблюдается, доза может быть увеличена, пока не наблюдается токсичность. Эти модели также могут быть использованы для изучения влияния на ИТК вводят в комбинации с стандартной терапии лейкемии, тем самым информируя последующие клинические протоколы развития.
Установление ксенотрансплантатных моделей острого лейкоза с использованием люциферазы-экспрессирующих клеток является значительным шагом вперед по сравнению с традиционными моделями ксенотрансплантатных и имеет потенциал, чтобы значительно ускоритьпроцесс открытия и разработки лекарственных 11. Томография Биолюминесценция позволяет для неинвазивного продольной определения бремени лейкемии, тем самым уменьшая количество животных, необходимых для исследований, а также может предоставить информацию о анатомического расположения заболевания. Кроме того, в целях расширения от возможных клинических утилит ИТК, изображений биолюминесценции можно воспроизводимо достигается после трансплантации первичных люциферазы с метками образцов 12 пациентов человека. Однако интерпретация биолюминесценции изображений может оказаться непростой задачей из-за позиционной неопределенности светоизлучающих клеток и, таким образом, в естественных изображений биолюминесценции следует использовать только как полуколичественную инструмента следовать той же животное в одинаковых условиях 13.
В выгодном случае, несколько соединения имеют значительную и сравнимую активность в анализах, описанных здесь, дополнительные критерии, которые могут быть использованы для дальнейшего Ранкинаг соединений включают относительную легкость синтеза соединений, растворимость, степень биодоступности при пероральном введении, фармакокинетические свойства и токсикологических исследований. Взятые вместе, эти данные должны позволить для идентификации оптимального соединения для прогрессирования клинических исследований и необходимы для поддержки подачи на Исследовано нового препарата (IND) приложения с продуктами и лекарствами (FDA), чтобы позволить клинических исследований. После создания этих важных доклинические данные, необходимые для продвижения этих новых агентов в клинику, использование Национального института Программы Здоровья терапии рака оценки (CTEP) должны быть рассмотрены. В этой программе клинических испытаний спонсируются оценить новые противораковые агенты, с особым акцентом на трансляционных исследований. Следует проявлять осторожность, чтобы координировать публичную презентацию доклинических данных, в том числе описания структур и синтез новых соединений, с подачи патентных заявок в ПРОТЕКт права на интеллектуальную собственность. В общем, данные не должны быть публично представлены, пока патентные заявки, защищающие состав вещества и методы использования не были поданы.
В заключение, мы продемонстрировали эффективную стратегию для расследования и оценки потенциала новых ИТК в качестве терапевтических агентов для лечения острого лейкоза. Целевая ингибирование в лейкозных клетках, как в культуре и изолированы из костного мозга мышей с ксенотрансплантатов лейкемии человека, можно оценить с помощью иммуноблоттинга. Функциональное значение целевой торможения можно оценить с помощью клоногенные анализов и Ортотопическая мышиных моделей ксенотрансплантатов с биолюминесцентной изображений. Вместе эти анализы обеспечивают критические доклинические данные, необходимые для продвижения этих новых трансляционных агентов в клинику.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
В естественных изображений проводили с использованием ИВИС общего ресурса в Университете Колорадо онкологический центр (поддерживается грантом P30-CA046934). Проточной цитометрии проводили в проточной цитометрии общий ресурс, Университета Колорадо онкологический центр (при поддержке гранта P30CA046934). Эта работа была частично поддержана Национальными Институтами Здоровья (RO1CA137078 в ДКГ). ABLS является членом программы Детская Scientist развития, при поддержке грантов от Американской академии педиатрии, Американской педиатрического общества, и Юнис Кеннеди Шрайвер Национального института детского здоровья и человеческого развития (K12-HD000850).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. Cancer Statistics. 2010. CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).
- Kaatsch, P. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).
- Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there? Blood. 120, 1165-1174 (2012).
- Forman, S., Rowe, J. M. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 121, 1077-1082 (2013).
- Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias. Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).
- Mikalsen, S., Kaalhus, O. Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems. J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).
- Zips, D., Thames, H., Baumann, M. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation. In Vivo. 19, 1-7 (2005).
- Christoph, S., et al. Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission. J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).
- Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions. Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).
- Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas. Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).
- Rudin, M., Weissleder, R. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).
- Barrett, D., et al. Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood. 118, 112-117 (2011).
- Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
