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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Extracción de proteínas totales y 2-D Métodos gel de electroforesis para Published: October 15, 2013 doi: 10.3791/50730
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Centre for Understanding and Preventing Infection in Children, University of British Columbia

Summary

Los miembros del género Burkholderia son patógenos de importancia clínica. Se describe un método para la extracción de proteína total bacteriana, usando disrupción mecánica, y electroforesis en gel 2-D para el análisis proteómico posterior.

Abstract

La investigación de los niveles de proteína intracelular de especies bacterianas es de importancia para la comprensión de los mecanismos patogénicos de las enfermedades causadas por estos organismos. Aquí se describe un procedimiento para la extracción de proteína a partir de especies de Burkholderia basado en la lisis mecánica usando perlas de vidrio en presencia de ácido tetraacético etilendiamina y fluoruro de fenilmetilsulfonilo en tampón fosfato salino. Este método se puede utilizar para diferentes especies de Burkholderia, para diferentes condiciones de crecimiento, y es probable adecuado para el uso en los estudios proteómicos de otras bacterias. Tras la extracción de proteínas, una de dos dimensiones (2-D) electroforesis en gel de la técnica proteómica se describe para estudiar los cambios globales en los proteomas de estos organismos. Este método consiste en la separación de proteínas en función de su punto isoeléctrico por enfoque isoeléctrico en la primera dimensión, seguida de separación sobre la base de peso molecularpor electroforesis en gel de acrilamida en la segunda dimensión. La visualización de proteínas separadas se lleva a cabo mediante tinción con plata.

Introduction

El género Burkholderia comprende más de 62 especies, organismos Gram negativas aisladas a partir de una amplia gama de nichos, y se divide en dos grupos principales 1,2. El primer grupo incluye a los organismos phytotrophic humana, animal y, y la mayoría de los estudios se han centrado en las especies patógenas de este grupo debido a su importancia clínica. Los miembros más patógenas son B. y B. pseudomallei mallei (que causa melioidosis y el muermo, respectivamente) y 3,4 patógenos oportunistas (las 17 especies definidas del complejo Burkholderia cepacia, BCC) 5, que causan la enfermedad de la fibrosis quística (FQ) y enfermedad granulomatosa crónica (CGD) 1. El segundo grupo, con más de 30 especies no patógenas, incluye bacterias asociadas a las plantas o al medio ambiente, y se consideran potencialmente beneficioso para el host 2.

Numerosas complicaciones surgen frinfección bacteriana OM con los miembros patógenas del género Burkholderia, como la transmisión del patógeno entre los pacientes, propagación de la enfermedad y el fracaso del tratamiento debido a la resistencia intrínseca o adquirida a los antibióticos que hacen difícil de erradicar en la mayoría de los casos 6-9. Por lo tanto, obtener una comprensión más clara de la base para el establecimiento de la infección bacteriana es vital para el tratamiento de enfermedades causadas por estos organismos. Con el fin de profundizar en el establecimiento de la infección, se requieren extensas investigaciones sobre los componentes bacterianos asociados con la patogénesis. Los estudios centrados en el análisis proteómico de organismos Burkholderia utilizando enfoques proteómicos describen proteínas que han sido implicados en la patogénesis bacteriana, así como cambios en su proteoma perfiles 10-16.

Métodos de extracción de proteínas utilizando ultrasonidos y los ciclos de descongelado por congelación en tampón de lisis que contiene alta concentration de urea, tiourea en combinación con detergente y anfolitos se ha aplicado en Burkholderia estudios proteómicos 10-13. Aunque la urea es bastante eficiente para la desnaturalización de la proteína, se puede establecer un equilibrio en solución acuosa con isocianato de amonio, que puede reaccionar con los grupos de aminoácidos, formando de este modo artefactos (reacción de carbamilación) 17. Por lo tanto, se recomienda incluir anfolitos portadores, que actúan como eliminadores de cianato y evitar temperaturas por encima de 37 ° C 17. Además, para evitar cualquier interferencia química de tampón de lisis con la cuantificación de proteínas, el mismo tampón de lisis se puede utilizar para generar la curva estándar de modo que las muestras y los estándares tienen el mismo fondo 10. Otras metodologías implican el uso de tampones alcalinos y detergentes con períodos de incubación de calor 17,18; sin embargo estas condiciones podría inducir cambios en el proteoma y algunos detergentes no son compatibles con PRoteomics solicitud a menos que se incluyen los pasos subsiguientes de eliminación de detergente 17,18.

Después de la extracción y cuantificación adecuada, expresión global de proteína de cada proteína individual se puede estudiar usando enfoques proteómicos tales como bidimensional (2-D) electroforesis en gel. Esta técnica fue descrita por primera vez por O'Farell 19 y consiste en la separación de proteínas en función de su punto isoeléctrico por enfoque isoeléctrico en la primera dimensión, y a continuación, en función de su peso molecular por electroforesis en gel de acrilamida en la segunda dimensión. Debido a su resolución y sensibilidad, esta técnica es una herramienta poderosa para el análisis y la detección de proteínas a partir de fuentes biológicas complejas 19,20. Esta técnica de separación está actualmente disponible en los enfoques centrados en la proteína con la gran ventaja de la solución de isoformas de proteínas causadas por modificaciones post-transcripcionales o procesamiento proteolítico. Los cambios cuantitativospuede ser detectado mediante la comparación de la intensidad de la mancha correspondiente después de la tinción del gel 20. Sin embargo, esta técnica no es adecuada para la identificación de proteínas muy grandes, proteínas de membrana, proteínas muy básicas y ácidas o hidrófobos, y es una técnica algo laborioso y requiere mucho tiempo 20. Nuevos enfoques-péptido centrado (basadas en gel de no) que son más robustos y objetivo estén disponibles y se pueden utilizar para la comparación cuantitativa por métodos diferenciales de etiquetado de isótopos estables tales como el etiquetado de cisteína por afinidad isótopo codificados etiquetado (ICAT) 21, y grupo amino etiquetado por el etiquetado de isótopos para la cuantificación absoluta y relativa (iTRAQ) 22. El uso de una única técnica de proteómica podría dar información insuficiente, por lo que es necesario el uso de dos enfoques proteómicos complementarias para la mayoría de los cambios totalmente en la evaluación de proteoma. Sin embargo, la electroforesis en gel 2-D es ampliamente utilizado y se puede aplicar de forma rutinaria para Quancuantitativos de expresión de varias proteínas en diferentes organismos.

Aquí se describe una extracción de proteínas de células enteras y procedimientos de electroforesis en gel 2-D para las especies de Burkholderia que fueron adaptados y optimizados de la GE Healthcare 2-D electroforesis Principios y métodos Manual 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). La extracción de proteínas se llevó a cabo usando un batidor de bolas con perlas de vidrio en presencia de PBS que contenía EDTA 5 mM (ácido etilendiaminotetraacético) y 1 mM de PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo). Este procedimiento permite la cuantificación de proteínas con la mínima degradación y es modificable para las aproximaciones proteómicas como se informó anteriormente 15,23,24. Electroforesis en gel 2-D se llevó a cabo utilizando 24 cm de largo inmovilizadas de pH 4-7 gradiente y las proteínas se separaron de acuerdo con su punto isoeléctrico. Luego se separaron las proteínas en función de su molecpeso cular por gel de SDS-poliacrilamida. Además, describimos un método de tinción de plata para la visualización de proteínas in situ, y un método de tinción de plata que es compatible para el análisis de espectrometría de masas. En conjunto, estos procedimientos pueden permitir la identificación de proteínas importantes de especies de Burkholderia que podrían estar involucrados en la patogénesis.

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Protocol

1. Crecimiento Cultura (días 1 2)

  1. Haga crecer un cultivo iniciador: 3 ml de Luria Bertani (LB) caldo en un tubo a presión superior de 15 ml, a 37 ° C durante la noche de los rotadores. Diluir el crecimiento durante la noche a un OD 600 de 0,6. Añadir 1 ml de esta dilución a 100 ml de caldo LB en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Incubar a 37 ° C con agitación a 250 rpm durante 16 h en fase estacionaria (SP), a una mejor aproximada, en un cultivo discontinuo, condiciones de infección y para asegurar que los factores de virulencia bacteriana bajo el control de factores de señal de fase estacionaria, tales como rpoS y quórum detección, se expresan. Alternativamente, las bacterias cultivadas en SP principios o mediados-o-logarítmica fase tardía se pueden utilizar para obtener información sobre la fase de adaptación bacteriana.
  2. Después de 16 h medir la OD 600 y asegurar la cultura ha alcanzado SP por comparación con una curva de crecimiento previamente construido en condiciones idénticas.

2. Extracción de proteínas (Día 3)

  1. Prepare fresco 0,1 M fenilmetanosulfonilo fluoruro (PMSF, 174,19 g / mol) de solución en acetona disolviendo 0,0174 g de PMSF (PMSF "PRECAUCIÓN" es tóxico y corrosivo, use protectores para la cara y guantes) en 1 ml de acetona (acetona «caution» tóxico e inflamable, use protectores para la cara y guantes).
  2. Hacer una solución de PBS / EDTA / PMSF: 0,1 ml de 0,1 M de PMSF, 0,1 ml de EDTA 0,5 M, y 9,8 ml de PBS. Compruebe el diámetro exterior de la cultura hr 16 es aproximadamente donde debería estar en SP.
  3. Tomar 35 ml de la cultura y la transferencia de bacterias a un tubo de centrífuga Oakridge y centrifugar el cultivo a 4500 × g durante 20 min a 4 ° C.
  4. Extraer el sobrenadante a un contenedor de residuos yañadir 35 ml de PBS enfriado y resuspender el precipitado. Centrifugar de nuevo a 4500 × g durante 20 min a 4 ° C.
  5. Eliminar el sobrenadante y resuspender en 1 ml de PBS frío. Traslado al estériles Eppendorf de 2 ml y centrifugar 1 min a lo alto de la microcentrífuga a 14000 × ga 4 ° C. Quitar y desechar el sobrenadante.
  6. Añadir 1 ml de solución de PBS / EDTA / PMSF, resuspender el pellet y transferir a un tubo de 2 ml de tornillo tapa (con junta tórica) que contiene perlas ~ 0,5 ml de vidrio (preesterilizadas). Añadir el sedimento se volvió a suspender al tubo que contenía las perlas de vidrio y cordón de golpearlos a 4 ° C durante 1 min en frío-habitación. Haga esto 3 veces, poniendo la muestra en hielo después de cada golpe.
  7. Se centrifuga a 14.000 xg durante 1 min en la microcentrífuga. Eliminar el sobrenadante y lo puso en un tubo de poliestireno de 5 ml estéril.
  8. Para aumentar el rendimiento de añadir 1 ml de solución de PBS / EDTA / PMSF al mismo tubo contiene perlas de vidrio de nuevo. Fiesta de bolas del tubo a 4 ° C durante 1 min. Haga esto 2x poner la muestra en hielo affiesta ter. Se centrifuga a 14.000 xg durante un minuto en la centrifugadora y eliminar el sobrenadante y añadir al sobrenadante del paso 2.8. Usar una jeringa de 1 ml y un filtro de 0,20 micras el sobrenadante del tubo de poliestireno a un nuevo tubo Eppendorf de 2 ml estéril.
  9. En este punto, las muestras deben ensayarse para la cantidad de proteína, utilizando el kit de extracción de proteínas Pierce MicroBCA y partes alícuotas de 200 g deben congelarse a -80 ° C hasta que sea necesario.

3. Preparación de la muestra (Día 4)

  1. Preparar 25 ml solución de rehidratación (8 M urea, 2% CHAPS, 2% IPG Buffer, 0,002% de azul de bromofenol) y guárdela en 2,5 ml alícuotas a -20 ° C. Añadir 7 mg de ditiotreitol (DTT, 154,2 g / mol) justo antes del uso a una parte alícuota de la solución de rehidratación de stock 2,5 ml.
  2. Proceso descongelado muestras del paso 2,10 utilizando un 2-D Limpiar kit con resuspensión final en 450 l de solución de rehidratación de stock preparadas en el paso 3.1.

4. PrimeroDimensión Isoeléctrico (IEF) (Día 4)

Todos los pasos de esta sección están utilizando el Sistema IEF Ettan IGPhor.

  1. Configure las primeras tiras de IPG dimensión: soportes de tira limpia con la solución de limpieza tira y luego lavar con agua Milli-Q, dejar boca abajo para secar. Asignar a cada muestra un número de soporte de tiras de gel.
  2. Cargue la muestra a partir del paso de rehidratación en la segunda zona más amplia de la - end (). Utilice pinzas limpias para sacar tiras de gel de embalaje. Saque la capa protectora de las tiras de gel. Línea tiras cara rugosa hacia abajo en un movimiento lento deslizamiento para obtener las tiras mojadas en el camino a partir de (-) de extremo a extremo (+).
  3. Coloque papel secante humedecido con agua esterilizada en la parte superior del electrodo y en las tiras de gel para prevenir el agotamiento. Enjuague pinzas en-entre las rondas con agua purificada y etanol. Quite todas las burbujas, superponer finas con aceite mineral para evitar outs secos. Alinee los soportes de tiras de gel en la máquina.
  4. Ejecutar 12 horas a 20 ° C durante rehydración, 1 hora a 200 V, 1 h a 500 V, 1 h a 1000 V, 0,5 horas a 4000 V, 12 h a 8000 V, 24 h a asimiento 300 V y se puede sacar en este momento.
  5. Después de IEF se terminó, se recomienda llevar a cabo la segunda dimensión electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, a menos que la tira IPG se están congeló a -80 ° C en Saran Wrap recubierto con aceite mineral para el análisis futuro. Alternativamente, con el fin de evitar el punto de rayas debido al acceso TDT es posible incluir un segundo paso de equilibrado de la tiras IPG antes de la segunda dimensión con un tampón que contiene yodoacetamida.

5. Segunda dimensión SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida (Día 5)

Todos los pasos de esta sección están utilizando el aparato de electroforesis Ettan DALTsix.

  1. Para montar el aparato de colada de gel, limpiar a fondo todos los componentes y asegúrese de que las ruedas de gel esté nivelado y la unión de goma gris se lubrica con gel de silicona. Ponga el problema negrober tapón triangular en la parte inferior. Luego, colocar alternativamente el separador y las placas de vidrio con la placa más corta de cristal hacia delante. Asegúrese de que los separadores son en la espalda y la parte delantera. Llenar el espacio restante con las cargas (unos 5 hojas) por lo que la parte superior es plana. Coloque el panel delantero con la punta roja en el exterior. Utilice abrazaderas para apretar cada lado y apretar los tornillos inferiores.
  2. Preparación del gel: Añadir 297,3 ml de Duracryl, ("PRECAUCIÓN" Duracryl es el uso de tóxicos caretas y guantes), 147 ml de tampón Tris 1,5 M pH 8,8 y 143,3 ml de agua Milli-Q en un matraz con la punta de vacío que contiene un barra de agitación. Ponga la tapa en la parte superior y se mezcla la solución a una velocidad moderada con el vacío durante 20 min. El vacío se utiliza para desgasificar la solución. Hacer un fresco 10% de solución de persulfato de amonio (APS, 218,8 g / mol): 0,2 g de APS a 2 ml de agua Milli-Q.
  3. Adición de la mezcla de gel a la máquina de colada de gel: Cuando se hace el vacío añadir 6 ml de 10% de dodecil sulfato de sodio (SDS, 228,38 g / mol)para el lado del matraz para evitar poner más burbujas en la solución. Añadir APS, revolver, añadir 0,25 ml de N, N, N ', N'-tetrametiletilendiamina (TEMED, 116,20 g / mol) ("PRECAUCIÓN" TEMED es inflamable uso caretas y guantes) y revuelva.
  4. Verter la mezcla de gel en gel de máquina de colada a través de un embudo insertado en la parte posterior del aparato. Vierta hasta una pulgada por debajo de la placa corta. Añadir 1,5 ml de butanol saturado de agua a la parte superior del gel y envolver la parte superior con una envoltura Saran para evitar la deshidratación. Espere 1 hora para asegurar la polimerización completa.
  5. Comprobación del gel: Cuando el gel se hace (marque el frasco), desmontar la máquina de colada de gel por un sumidero. Compruebe la integridad del gel mientras se lava las placas de vidrio con agua tibia; no permita que entre agua en el plato. Vierta el butanol y enjuague la parte superior de gel dos veces con agua para deshacerse de butanol. Llene la parte superior con agua de nuevo y dejar reposar si los geles no se usan de forma inmediata.
  6. Preparación de las tiras de: Preparar la solución tampón de equilibrado de lacongelador (6 M urea, 75 mM de Tris-HCl pH 8,8, 29,9% de SDS, 0,002% de azul de bromofenol). Esto puede ser preprepared y almacenado en 10 ml de alícuotas a -20 ° C. Disolver 0,1 g de DTT a una 10 ml de solución de tampón de equilibrio. Un tubo puede ser utilizado para dos tiras IPG. Coloca los geles de la cara de la tira hacia abajo en el buffer y deje reposar durante 30 min. Recuerde qué extremo es cuál.
  7. Preparación de la unidad de electroforesis (aparato de separación 2-D): Añadir 4,5 l de 1x tampón de electroforesis (25 mM de Tris base [121.1 g / mol], 192 mM de glicina [288,38 g / mol], y 0,1% w / v de SDS [288,38 g / mol]) al tanque de funcionamiento. Este tampón se puede utilizar durante un máximo de 3 veces. Gire la unidad de electroforesis en. Revise el nivel de agua en la máquina de refrigeración por agua y llenarlo con agua si es baja. Encender la máquina, pulse mode para comprobar la temperatura designada, la cual debe ser de 10 ° C.
  8. Hacer 1 L de tampón 2x ​​correr y 1 l de 1x de tampón de ejecución y almacenar a 4 ° C. Haga solución de agarosa de sellado: peso 0,25 g de agarosE y disolver en 50 ml de tampón 1x corriendo. Pulsos durante 15 segundos cada uno.
  9. Configuración de la unidad de electroforesis: Use pinzas para sacar cada tira y eliminar el exceso de tampón en ambos lados con una toalla de papel limpia. NO toque las tiras. Vierta el agua en la parte superior del gel y la línea de la parte superior del gel con tampón 1x corriente. Utilice pinzas limpias y colocar las tiras en la parte superior de la placa de largo, con la cara de gel hacia usted. Añadir tampón 1x a las tiras para lubricarlo. Tiras de diapositivas más adelante mediante el uso de tiras de plástico. Quite todas las burbujas en medio de la avenida principal y el gel.
  10. Añadir solución de agarosa-sellado a la parte superior de la tira para sellarlo. Repita este procedimiento para el resto de las tiras. Coloque las placas de vidrio que contienen los geles a base de gel y la menor en el depósito de gel. Asegúrese de que el nivel de tampón 1x en la cámara exterior está en la línea de fondo designado antes de poner la cámara superior en.
  11. Coloque el marco para la cámara de amortiguación superior en la parte superior de las placas de vidrio y asegúrese de que es toda la way abajo presionando la parte inferior hacia abajo. Utilice un embudo y añadir el tampón de desarrollo 2x en la cámara superior hasta la línea media. Utilice un embudo y añadir tampón de ejecución 1x a la cámara exterior hasta que alcanza la línea superior. Coloque la tapa en la parte superior y encienda la unidad de electroforesis y la fuente de alimentación.
  12. Ejecutar toda la noche a 52 V, 96 mA, 5 W. Compruebe si la corriente va buscando las burbujas en el alambre de plata en la parte superior. Ejecute el gel hasta que la línea principal es de 1 cm de la parte inferior.
  13. Las proteínas también se pueden analizar utilizando equipos y reactivos de otras compañías tales BIORAD o Hoefer, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

6. Tinción con plata de los geles para la visualización del gel (día 5-6)

  1. Prepare una solución de arreglo 1 (800 ml de etanol, 200 ml de ácido acético, y 1000 ml de agua Milli-Q en la campana de humos en un cubo de plástico). La solución es buena para 6 geles. Gire todas las máquinas y se lleve a cabo toda la parte central de la unidad de electroforesis y pull en el fregadero. También poner el soporte blanco en el fregadero. Tire de la bandeja superior contiene el tampón 2x ​​ejecución.
  2. Desmontar el aparato y retirar los geles de las placas de vidrio en solución de arreglo 1. Los geles pueden ser identificados por cortar esquinas cuando se retiran de las placas de vidrio, el número de esquinas de corte correspondiente a la orden de gel en la máquina de colada.
  3. Coloque el recipiente con la solución de arreglo y los geles en un agitador durante al menos 1 hora de la noche a 4 ° C.
  4. La transferencia de los geles para fijar la solución de 2 (20 ml de 50% glutaraldehído, 600 ml de etanol, 5 g de tetrationato de potasio (302,46 g / mol), 136 g de acetato de sodio (82,03 g / mol), y agua Milli-Q para 2000 ml) y colocan en un agitador durante 1 hora.
  5. Lavar los geles 4x durante 15 minutos cada una en agua Milli-Q.
  6. Tinción de los geles en solución nitrato de plata (4 g de nitrato de plata (169,87 g / mol), 500 l de formaldehído, y agua Milli-Q para 2000 ml) durante 30 min o hasta 48 horas.
  7. Lave gel durante 1min en agua Milli-Q.
  8. Transferencia a solución de revelado (60 g de carbonato de sodio (105,99 g / mol), 300 l de formaldehído, 15 mg de tiosulfato de sodio (158,11 g / mol), y agua Milli-Q para 2000 ml) durante 5-30 min hasta que el gel se tiñe.
  9. Ponga los geles en solución de parada (100 g de Tris-base (121,14 g / mol), 40 ml de ácido acético y agua Milli-Q a 2.000 ml) durante 10 min.
  10. Para el almacenamiento, la transferencia de los geles de glicerol de la solución (40 ml de glicerina o de 400 ml, si se desea un almacenamiento a largo plazo, y 1.600 ml de agua Milli-Q) durante 10 minutos y luego secarlas con un secador de gel.
  11. Los geles se pueden visualizar después de la tinción utilizando sistemas de imagen, como un escáner / densitómetro, fotografiada con transiluminador de luz o de imágenes Gel. El software de análisis de imagen tales como PDQuest análisis 2-D de BioRad a continuación, se puede utilizar para obtener información cuantitativa y cualitativa de las proteínas en una muestra.

7. Gel de plata de tinción para el análisis de espectrometría de masas

  • Fijar los geles en 50% de metanol, y ácido acético al 5% durante 1 hora.
  • Lavar con metanol al 50% durante al menos 10 minutos a toda la noche.
  • Lavar con agua destilada 3 veces durante 10 min.
  • Sensibilizar con tiosulfato de sodio 0,02% (158,11 g / mol) 2x durante 15 min.
  • Lave 3 veces en CHILLED 3x agua destilada durante 10 min.
  • Sumergir en gel de solución de nitrato de plata ENFRIADA 1% (169,87 g / mol) durante al menos 20 min a 1 hora a 4 ° C
  • Lavar 2x durante 1 min con agua destilada. Cambie la bandeja / cubo.
  • Desarrollar en el 0,04% de formaldehído en el 2% de carbonato de sodio anhidro (105,99 g / mol) y desechar cuando se vuelve amarillo bastante rápido; tienen tres lotes y estar dispuestos a cambiar cada 5 min.
  • Lavar en ácido acético al 5% y luego almacenar en ácido acético al 1%.
  • Enjuague 1,5 ml tubos Eppendorf (para sostener llegar mancha recortes) con etanol de grado USP y de aire seco antes de su uso.
  • Pinzas limpias, hojas de afeitar y superficies con metanol al 100%.
  • Rocíe guantes y superficies con etanol.
  • Manchas de Impuestos Especiales en una campana de flujo o un área de aire limpio. Spots pueden ser también extirpados usando un cortador de punto automático.
  • Póngalos en tubos Eppendorf y barco en el hielo o mantenerse en la nevera.

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    Representative Results

    Análisis comparativo de los perfiles de proteínas extraídas de un mismo cultivo bacteriano en dos ocasiones diferentes mostraron patrones similares de bandas indicando extracciones de proteínas con éxito. Proteínas de peso molecular extraídos oscilaron desde 10 hasta 150 kDa. La Figura 1 muestra representativa de Coomassie de gel de tinción de azul de las extracciones de proteínas de células enteras de multivorans Burkholderia (un miembro de la BCC) aislados clínicos cultivadas en LB o de levadura / Manitol (YEM) y caldo cosechada en fase estacionaria.

    Para el análisis 2-D electroforesis en gel, 200 g de proteínas totales de Burkholderia pseudomallei fue utilizado (Figura 2). Dado que este patógeno es reconocido como un agente de guerra biológica de tipo B por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades 25, los procedimientos de preparación de proteínas se realizaron en Bio Nivel de seguridad de laboratorio 3 de contención y de acuerdo con los procedimientos de operación estándar.Las proteínas se resuspendieron en solución de rehidratación y aplicarse a un 24 cm de largo inmovilizadas de pH 4-7 gradiente y las proteínas fueron separadas en función de su punto isoeléctrico (pI). A continuación, las tiras se colocaron en un gel de SDS-poliacrilamida y las proteínas se separaron de acuerdo con su peso molecular (MW). Posteriormente, el gel fue teñido con plata para la visualización in situ de proteínas. Los resultados mostraron la abundancia de más de 500 puntos de proteínas que pueden ser identificados individualmente por espectrometría de masas.

    Figura 1
    Figura 1. Los perfiles de proteínas totales de multivorans Burkholderia aislados. Análisis de SDS-PAGE de proteína extraída en la fase estacionaria a partir de D-2214 y D-2094 aislados que han crecido en LB o de levadura / Manitol (YEM) caldo en dos ocasiones diferentes (1 y 2). 4 g de proteína fueron cargados en cada carril de un gel al 12,5% y se tiñó with azul Coomassie. Carril M, marcador de la proteína.

    Figura 2
    Figura 2. 2-D electroforesis en gel de análisis de Burkholderia pseudomallei 1234B aislar. 2-D gel que muestra la separación de proteínas Representante manchados de plata en el PI 4 de la avenida 7-gama. Extractos de proteínas de células enteras (200 microgramos) en la fase estacionaria se utilizan y se separaron en un gel de SDS-PAGE al 15%.

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    Discussion

    Un método para la preparación de proteínas se ha descrito que puede extraer la mayoría de las proteínas Burkholderia con buena reproducibilidad. Esto se demuestra mediante la obtención de la misma perfil de proteínas a partir de dos preparaciones independientes realizados en diferentes días utilizando el mismo cultivo bacteriano crecido en LB o caldo YEM como se muestra en la Figura 1. La extracción fue eficiente para las bacterias cultivadas en medio líquido, sin embargo no hemos probado este método para las bacterias cultivadas en placas. Este método también fue utilizado para una mayor caracterización de proteínas utilizando herramientas proteómicas, nuestro grupo ha estudiado con éxito cambios proteoma mediante electroforesis en gel 2-D y el etiquetado de isótopos para la cuantificación absoluta y relativa (iTRAQ) técnicas proteómicas 15,23,24. En este último caso, las proteínas se extrajeron en un tampón que contiene 0,5 M de EDTA en PBS para evitar cualquier interferencia de PMSF con los experimentos iTRAQ 15.

    Es importante REMarca que durante el proceso de extracción de la proteína y la electroforesis en gel 2-D, todas las medidas deben llevarse a cabo a 4 ° C o en condiciones de frío con cubos de hielo para minimizar la degradación de proteínas, así como el uso de puntas tapadas y use guantes de nitrilo y cubrir todos la piel para evitar la contaminación de la queratina de cualquier mancha cortado para su posterior identificación mediante espectrometría de masas. Al realizar extracciones de proteínas, también es importante tener en cuenta que el PMSF tiene un corto tiempo de vida media en soluciones acuosas, de acuerdo con el fabricante, por lo tanto, la solución madre 0,1 mM en acetona se debe hacer inmediatamente antes de su uso. Alternativamente, otros inhibidores de la serina o inhibidores de la proteasa que son más solubles y estables, y menos tóxicos se pueden utilizar, aunque no las hemos probado en nuestros experimentos.

    El tampón de lisis usado en este procedimiento no contiene urea, que es importante para la solubilización para extraer ambos (citosólicas) proteínas acuosas y Prot menos solubleeins, incluyendo algunas proteínas de la membrana 17. Pero, durante la preparación de la muestra para isoeléctrico primera dimensión de enfoque (paso 3 de este protocolo), las muestras se resuspendieron en tampón de rehidratación que contiene urea. Otras técnicas de proteómica también implican un trato similar 26. Antes de seguir con la etapa de rehidratación, parece que la eliminación de los materiales que interfieren o impurezas de bajo peso molecular es crucial para la alta resolución, se recomienda utilizar el Kit de 2-D Clean-up en cada muestras de proteínas ya que los resultados mejoraron. Cargar previamente las muestras para isoeléctrico primera dimensión de separación de enfoque, asegúrese de tener las tiras preparadas de papel secante el tamaño adecuado de los titulares de la tira, ya que esto es problemático para reducir el tamaño adecuado de manera aséptica en el acto (para el paso 3.4 del presente protocolo).

    Antes de ejecutar una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida 2-D, es necesario asegurarse de que el porcentaje de gel se ajuste a los tamaños esperados de interés (un 120,5% en gel de porcentaje de proteína puede resolver en el rango de 14-100 kDa). Después de que se completó segunda electroforesis en gel de dimensión, visualización de proteínas se puede lograr mediante la tinción de azul de Coomassie o plata; este último tinción es más sensible con límite de detección es tan bajo como 0,1 ng / proteína / punto 20. Manchas de proteínas visualizados con tinción de plata son adecuados para su posterior análisis por espectrometría de masas. Sin embargo, es importante mencionar que la solución de tinción de plata no debe contener glutaraldehído ya que este agente de reticula con las proteínas, por lo que no es compatible con posterior análisis de espectrometría de masas 20. Alternativamente, para detectar y cuantificar proteínas expresadas diferencialmente, otro enfoque basado en gel, tal como dos dimensiones-Diferencia En electroforesis en gel (2D-DIGE) junto con el software automatizado se puede utilizar. Este enfoque emplea las etiquetas fluorescentes distintas (por ejemplo, Cy 3, 5 y 2) que se utilizan para las muestras de la etiqueta y un PR estándar interno universalesIOR a segunda superación electroforesis en dimensión, en cierta medida, las desventajas de la variación y la reproducibilidad de electroforesis en 2-D 27. Además, los geles se pueden teñir después de la segunda dimensión con SyproRuby, que es una mancha de quelato de rutenio organometálico diseñado para aplicaciones proteómicas. Es capaz de detectar manchas de proteína con una sensibilidad similar a la tinción con plata, pero con mayor sensibilidad que con azul de Coomassie. Después de tinción de geles pueden ser fotografiados con escáner láser o transiluminador 28.

    En conclusión, este video describe un procedimiento de proteína bacteriana de células enteras de extracción y 2-D método de electroforesis en gel que puede permitir que el estudio de los cambios globales en el proteoma de especies de Burkholderia.

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    Disclosures

    Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

    Acknowledgments

    Este trabajo fue apoyado por una beca de la Universidad de British Columbia (BV) y las subvenciones de la Fibrosis Quística Canadá y canadienses Institutos de Investigación en Salud (DPS). Damos las gracias a Jacqueline Chung para la preparación inicial de los protocolos.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagents
    Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626 Toxic, corrosive
    Acetone Fisher A18-1 Flammable
    PBS Buffer Bioscience R028
    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher BP118-500 toxic
    Glass beads (0.1 mm) BioSpec Products 11079101
    Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) VWR 21009-342
    MicroBCA protein extraction kit Pierce 23235
    Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring Fisher 02-681-375
    2-D Clean-Up kit GE Healthcare 80-6484-51
    Urea Invitrogen 15505-050 Irritant
    CHAPS Amersham Biosciences 17-1314-01
    Dithiothreitol (DTT) MPBiomedical, LCC 856126 Irritant
    Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm Amersham Biosciences 176002-46
    Duracryl Proteomic Solutions 80-0148 Very toxic, carcinogen
    Ammonium persulfate Fisher BP179-100 Flammable, toxic, corrosive
    N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) Invitrogen 15524-010 Flammable
    Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Acute toxicity, flammable
    Agarose Invitrogen 15510-027
    Ethanol Fisher HC1100-1GL Flammable, toxic
    Acetic acid Fisher A491-212 Flammable, corrosive
    Glutaraldehyde Fisher G151-1 Very toxic, corrosive, dangerous for the environment
    Potassium tetrathionate Sigma P2926 Irritant
    Sodium acetate EM Science 7510
    Silver nitrate Sigma 209139 Corrosive, dangerous for the environment
    Formaldehyde Sigma 252549 Toxic
    Sodium thiosulfate Sigma S7026
    Tris Base EMD 9230
    Glycine MPBiomedical, LCC 808831
    Glycerol MPBiomedical, LCC 800688
    Methanol Fisher A412-4 Flammable, toxic, health hazard
    Sodium carbonate anhydrous EMD SX0400-3 Toxic
    Mineral oil ACROS 415080010
    Equipment
    JA-20 ultracentrifuge rotor Beckman Coulter 334831
    Mini Beadbeater Biospec Products 3110BX
    Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories GE Healthcare 80-6505-03 www.amershambiosciences.com
    Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system GE Healthcare 80-6485-27 www.amershambiosciences.com

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    References

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    Inmunología Número 80 Bacteria Aerobic las bacterias Gram-negativas Enfermedades del Sistema Inmune Enfermedades Respiratorias, Proteínas granos de cristal electroforesis en gel 2-D
    Extracción de proteínas totales y 2-D Métodos gel de electroforesis para<em&gt; Burkholderia</em&gt; Especies
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    Velapatiño, B., Zlosnik, J. E.… More

    Velapatiño, B., Zlosnik, J. E. A., Hird, T. J., Speert, D. P. Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species. J. Vis. Exp. (80), e50730, doi:10.3791/50730 (2013).

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