Summary
חברים של סוג Burkholderia הם פתוגנים חשיבות קלינית. אנו מתארים שיטה לסך מיצוי חלבון חיידקים, תוך שימוש בהפרעה מכאנית, וג'ל אלקטרופורזה 2-D לניתוח proteomic שלאחר מכן.
Abstract
החקירה של רמות החלבון תאית של מיני חיידקים היא בעלת חשיבות להבנת המנגנונים פתוגניים במחלות הנגרמים על ידי אורגניזמים אלה. כאן אנו מתארים הליך להפקת חלבון ממינים Burkholderia מבוססת על תמוגה מכאנית באמצעות חרוזי זכוכית בנוכחות חומצת ethylenediamine tetraacetic ופלואוריד phenylmethylsulfonyl בופר פוספט. שיטה זו יכולה לשמש למיני Burkholderia שונים, לתנאי גידול שונים, וסביר להניח מתאים לשימוש במחקרי proteomic של חיידקים אחרים. לאחר מיצוי חלבון, טכניקת proteomic דו ממדים (2-D) ג'ל אלקטרופורזה מתוארת ללמוד שינויים הגלובליים בproteomes של אורגניזמים אלה. שיטה זו מורכבת של הפרדת חלבונים לפי הנקודה איזואלקטרית על ידי איזואלקטרית התמקדות בממד הראשון, ואחריו הפרדה על בסיס משקל מולקולריעל ידי ג'ל אלקטרופורזה acrylamide בממד השני. הדמיה של חלבונים מופרדים מתבצעת על ידי צביעת כסף.
Introduction
Burkholderia הסוג מונה יותר מ 62 מינים, אורגניזמים שליליים גרם מבודדים ממגוון רחב של נישות, והוא מחולק לשני אשכולות עיקריים 1,2. האשכול הראשון כולל בני אדם, בעלי חיים ואורגניזמים phytotrophic, ורוב המחקרים התמקדו במינים פתוגניים של קבוצה זו בשל החשיבות הקלינית שלהם. החברים פתוגניים ביותר הם B. pseudomallei ו-B mallei (מה שגורם melioidosis ונחרת בהתאמה) 3,4 ופתוגנים אופורטוניסטיים (17 מינים המוגדרים של מתחם Burkholderia cepacia, BCC) 5, הגורמים למחלות בסיסטיק פיברוזיס (CF) ומחלת granulomatous כרונית (CGD) 1. האשכול השני, עם יותר מ 30 מינים nonpathogenic, כולל חיידקים הקשורים צמחים או בסביבה, והם נחשבים למועילים פוטנציאליים למארח 2.
סיבוכים רבים לצאת frזיהום חיידקי אום עם החברים פתוגניים של סוג Burkholderia, כגון העברת של הפתוגן בין חולים, התפשטות המחלה וכישלון טיפול בשל ההתנגדות הפנימית או נרכשה לאנטיביוטיקה הופכת קשה למגר ברוב המקרים 6-9. לכן, צובר הבנה ברורה יותר של הבסיס להקמתה של זיהום חיידקים הוא חיוני לטיפול במחלות הנגרמות על ידי אורגניזמים אלה. על מנת לקבל תובנות לגבי הקמתה של זיהום, חקירות נרחבות על רכיבי חיידקים הקשורים בפתוגנזה יש צורך. לימודים מתמקדים בניתוח proteomic של אורגניזמים Burkholderia תוך שימוש בגישות proteomic תיארו חלבונים שהיו מעורבים בפתוגנזה של חיידקים, כמו גם שינויים בproteome פרופילי 10-16.
שיטות הפקת חלבון באמצעות sonication ומחזורי הקפאה מופשרת במאגר תמוגה המכיל גבוה קונצרט כלשהוentration של אוריאה, thiourea בשילוב עם חומרי ניקוי וampholytes כבר יושם במחקרי proteomic Burkholderia 10-13. למרות האוריאה היא די יעילה לdenaturation חלבון, זה יכול לבסס שיווי משקל בתמיסה מימית עם איזוציאניד אמוניום, אשר יכול להגיב עם קבוצות חומצת אמינו, ובכך יוצר חפצים (תגובת carbamylation) 17. לכן, מומלץ לכלול ampholytes המוביל, אשר פועל כמו אוכלי נבלות cyanate ולהימנע מטמפרטורות מעל 37 מעלות צלזיוס 17. יתר על כן, כדי למנוע כל הפרעה כימית של מאגר תמוגה עם כימות חלבון, אותו המאגר תמוגה יכול לשמש כדי ליצור עקומת הסטנדרט, כדי שהדגימות והסטנדרטים יש לו הרקע 10. מתודולוגיות אחרות כרוכות בשימוש במאגרים וחומרי ניקוי בסיסיים עם תקופות דגירה חום 17,18, אולם תנאים אלה עלולים לגרום לשינויים בproteome ושחומרי ניקוי מסוימים אינם תואמים ליחסי ציבוריישום oteomics אלא אם כן צעדים להסרת חומר ניקוי שלאחר מכן כלולים 17,18.
לאחר חילוץ וכימות נאותים, ביטוי חלבון הגלובלי של כל חלבון בודד ניתן ללמוד באמצעות גישות proteomic כגון דו ממדים (2-D) ג'ל אלקטרופורזה. טכניקה זו תוארה לראשונה על ידי O'Farell 19 ומורכב בהפרדת חלבונים לפי הנקודה איזואלקטרית על ידי איזואלקטרית התמקדות בממד הראשון, ולאחר מכן בהתאם למשקל המולקולרי שלהם על ידי ג'ל אלקטרופורזה acrylamide בממד השני. בשל הרזולוציה והרגישות שלה, טכניקה זו היא כלי רב עוצמה לניתוח וזיהוי של חלבונים ממקורות ביולוגיים מורכבים 19,20. טכניקת הפרדה זו זמינה כיום בגישות חלבון ממוקד עם היתרון הגדול של פתרון isoforms החלבון נגרם על ידי שינויים לאחר תעתיק או עיבוד פרוטאוליטי. שינויים הכמותייםיכול להיות מזוהה על ידי השוואת עוצמת הנקודה המקבילה לאחר הצביעה של ג'ל 20. עם זאת, טכניקה זו אינה מתאימה לזיהוי של חלבונים גדולים מאוד, חלבונים בממברנה, חלבונים מאוד בסיסיים וחומצי או הידרופובי, והיא טכניקה קצת מייגע וגוזל זמן 20. גישות פפטיד הממוקד חדשות (המבוסס על ג'ל שאינו), כי הם יותר חזקים והמטרה להיות זמינות וניתן להשתמש בם להשוואת כמותית בשיטות תיוג איזוטופ היציב ההפרש כגון תיוג ציסטאין ידי זיקה מקודדת איזוטופ תיוג (ICAT) 21, וקבוצת אמינו תיוג על ידי תיוג איזוטופ כדי לכמת יחסי ומוחלט (iTRAQ) 22. השימוש בטכניקת proteomic אחת עשויה לתת מידע מספיק, ולכן השימוש בשני גישות proteomic משלימות הוא הכרחי עבור רוב השינויים בהערכה באופן מלא בproteome. עם זאת, ג'ל אלקטרופורזה 2-D נעשתה שימוש נרחב ויכולה להיות מיושמת באופן שיגרתי לקוואןtitative ביטוי של מספר חלבונים באורגניזמים שונים.
כאן אנו מתארים מיצוי חלבון כל התא ונהלי ג'ל אלקטרופורזה 2-D למיני Burkholderia שהותאמו ומותאמים מ2-D עקרונות אלקטרופורזה GE Healthcare ושיטות Handbook 80-6429-60AC 2004 (www.amershambiosciences.com). הפקת החלבון בוצעה באמצעות מקצף חרוז בחרוזי זכוכית בנוכחות של PBS המכילה 5 מ"מ EDTA (חומצת tetraacetic ethylenediamine) ו1 מ"מ PMSF (פלואוריד phenylmethylsulfonyl). הליך זה מאפשר כימות של חלבונים עם השפלה מינימלית הוא amendable לגישות proteomic כ15,23,24 שדווחו בעבר. ג'ל אלקטרופורזה 2-D בוצעה באמצעות 24 סנטימטר ארוך משותק pH 4-7 שיפוע וחלבונים הופרדו על פי נקודה איזואלקטרית. אז חלבונים הופרדו על פי Molecמשקל תואר בלבד על ידי ג'ל SDS-polyacrylamide. בנוסף, אנו תיארתי שיטת צביעת כסף להדמיה של חלבוני מקום, ושיטת כתם כסף שהוא תואם לניתוח ספקטרומטריית מסה. יחד נהלים אלה יכולים לאפשר זיהוי של חלבונים חשובים ממינים Burkholderia שיכול להיות מעורב בפתוגנזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. צמיחת תרבות (ימים 1 +2)
- לגדול תרבות המתנע: 3 מיליליטר של מרק לוריא Bertani (LB) בצינור מיליליטר הצמד עליון 15, במסובב 37 מעלות צלזיוס למשך לילה. לדלל צמיחה בן לילה לOD 600 של 0.6. הוסף 1 מיליליטר של דילול זה של מרק LB 100 מיליליטר בבקבוק 250 מיליליטר Erlenmeyer. לדגור על 37 ° C עם הרועד בסל"ד 250 ל16 שעות לתוך שלב נייח (SP), למקורב יותר טוב, בתרבות אצווה, תנאי זיהום וכדי להבטיח גורמים ארסי חיידקים שתחת השליטה של גורמי אות בשלב נייחים כגון rpoS ומניין חישה, באים לידי ביטוי. לחלופין, חיידקים גדלו בSP מוקדם או בשלב האמצע או בסוף הלוגריתמים ניתן להשתמש בם כדי לקבל מידע על שלב הסתגלות החיידקים.
- לאחר 16 שעה למדוד את קוטר חיצוני 600 ולהבטיח הגיעה התרבות SP בהשוואה לעקומת צמיחה שנבנתה בעבר בתנאים זהים.
2. הפקת חלבון (יום 3)
- הכן פלואוריד phenylmethanesulfonyl 0.1 M הטרי פתרון (PMSF, 174.19 g / mol) באצטון על ידי המסת .0174 גרם של PMSF (PMSF "זהירות" הוא רעיל ומאכל, מגיני פנים שימוש וכפפות) ב 1 מיליליטר של אצטון (אצטון "זהירות" הוא רעיל ודליק, יש להשתמש במגנים פנים וכפפות).
- מרכיב את פתרון PBS / EDTA / PMSF: 0.1 מיליליטר של M 0.1 PMSF, 0.1 מיליליטר של 0.5 M EDTA, ו9.8 מיליליטר של PBS. בדוק את OD של תרבות שעות 16 הוא כ איפה שהוא צריך להיות בSP.
- קח 35 מיליליטר של התרבות והעברת חיידקים לצינור Oakridge צנטריפוגה ו צנטריפוגות התרבות ב4,500 × גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C.
- הסר supernatant למכל פסולת ולהוסיף 35 מיליליטר של PBS מקורר וresuspend את הכדור. צנטריפוגה שוב בגרם × 4,500 עבור 20 דקות ב 4 ° C.
- הסר supernatant ו resuspend ב 1 מיליליטר של PBS הקר. העברה לסטרילי 2 מיליליטר Eppendorf ודקות צנטריפוגות 1 על גבוה בmicrocentrifuge בגרמו × 14,000 ב 4 ° C. להסיר ולהשליך supernatant.
- הוסף 1 מיליליטר של פתרון PBS / EDTA / PMSF, resuspend את הכדור ולהעביר 2 מיליליטר בורג צינור כובע (עם O-Ring) המכילים ~ חרוזי זכוכית 0.5 מיליליטר (presterilized). הוסף את גלולה מחדש מושעה לצינור המכיל חרוזי הזכוכית וחרוזים לנגח אותם על 4 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות בקור חדר. האם 3x זה, לשים את המדגם על קרח לאחר כל המסיבה.
- צנטריפוגה ב XG 14,000 דקות 1 בmicrocentrifuge. הסר את supernatant ולשים אותו בצינור קלקר 5 מיליליטר סטרילי.
- כדי להגדיל את התשואה להוסיף 1 מיליליטר של PBS / EDTA / פתרון PMSF לאותו צינור מכיל חרוזי זכוכית שוב. bash חרוז הצינור ב C ° 4 דקות 1. אל 2x זה לשים את המדגם על af הקרחbash ter. צנטריפוגה ב XG 14,000 למשך דקה אחת בצנטריפוגה ולהסיר את supernatant ולהוסיף לsupernatant משלב 2.8. השתמש במזרק 1 מיליליטר ומסנן 0.20 מיקרומטר supernatant מצינור הקלקר לצינור 2 מיליליטר Eppendorf חדש סטרילי.
- בשלב זה הדגימות צריכה להיות assayed לכמות חלבון, שימוש בערכת פירס MicroBCA חלבון החילוץ וaliquots של 200 מיקרוגרם צריך להיות קפוא ב-80 ° C עד צורך.
3. לדוגמא הכנה (יום 4)
- הכן 25 מיליליטר פתרון מניות להחזרת נוזלים (8 מ אוריאה, בחורים 2%, 2% הצפת IPG, bromophenol 0.002% הכחול) ולאחסן ב2.5 aliquots מיליליטר ב -20 ° C. הוסף 7 dithiothreitol מ"ג (DTT, 154.2 g / mol) רק לפני השימוש לaliquot 2.5 מיליליטר של פתרון מניות להחזרת נוזלים.
- תהליך הפשיר דגימות משלב 2.10 באמצעות נקי 2-D את ערכה עם resuspension הסופי ב450 μl של פתרון מניות להחזרת נוזלים מוכנים בשלב 3.1.
4. ראשוןממד isoelectric התמקדות (IEF) (יום 4)
כל השלבים בסעיף זה משתמשים במערכת IEF Ettan IGPhor.
- הגדר את רצועות IPG הראשונות ממד: מחזיקי רצועה נקיים עם תמיסת ניקוי רצועה ולאחר מכן לשטוף עם מים מילי-Q, להשאיר הפוך לייבוש. להקצות לכל מדגם למספר בעל רצועת ג'ל.
- טען המדגם מצעד להחזרת נוזלים באזור רחב יותר מהשני (-) בסופו. שימוש במלקחיים נקיים כדי למשוך את רצועות ג'ל מתוך אריזה. קח את שכבת הגנה מרצועות ג'ל. קו רצועות צד מחוספס כלפי מטה בתנועה איטית, הזזה כדי לקבל את הרצועות רטובות לאורך הדרך מ( -) מקצה לקצה (+).
- שים את נייר סופג לח עם מים מעוקרים על גבי האלקטרודה ומתחת לרצועות ג'ל למניעת שחיקה. יש לשטוף את הפינצטה שבין סיבובים עם מים ואתנול מטוהרים. הסר את כל הבועות, כיסוי דק עם שמן מינרלים כדי למנוע פסקי יבשים. מרפד את מחזיקי רצועת ג'ל במכונה.
- הפעל שעות 12 ב20 מעלות צלזיוס למשך rehydמנה, שעה 1 ב200 V, שעה 1 ב500 V, שעה 1 ב1,000 V, 0.5 שעות ב 4,000 V, 12 שעות ב 8,000 V, המתנה שעות 24 ב300 V וניתן להוציא בשלב זה.
- לאחר IEF הוא סיים, מומלץ לבצע ג'ל אלקטרופורזה SDS-polyacrylamide השנייה ממד, אלא אם כן את רצועת IPG נמצאים קפוא ב-80 מעלות צלזיוס בניילון מצופה בשמן מינרלים לניתוח בעתיד. לחלופין, על מנת להימנע מפסי נקודה בשל גישת DTT ניתן לכלול צעד איזון שני של IPG רצועות לפני הממד השני עם חיץ המכיל iodoacetamide.
5. שני ממד SDS-polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (יום 5)
כל השלבים בסעיף זה משתמשים במנגנון אלקטרופורזה Ettan DALTsix.
- כדי להרכיב את מנגנון גלגלית ג'ל, לנקות ביסודיות את כל הרכיבים ולהבטיח כי גלגלית ג'ל היא ברמה והגומי האפור המחייב הוא משומן עם ג'ל סיליקון. שים לשפשף השחורבער פקק משולש בתחתית. לאחר מכן, לסירוגין למקם את המפריד ואת לוחות הזכוכית עם הצלחת הקצרה של זכוכית מול חזית. ודא המפרידים הם על הגב והחזית. למלא את החלל שנותר עם חומרי המילוי (כ -5 גיליונות) כך שהחלק העליון הוא שטוח. שים את הלוח הקדמי על עם הקצה האדום בצד החיצוני. שימוש מלחציים להדק כל צד והדק את הברגים בתחתית.
- הכנת ג'ל: הוסף 297.3 מיליליטר של Duracryl, ('זהירות' Duracryl הוא מגיני פנים שימוש רעיל וכפפות), 147 מיליליטר של הצפת טריס pH 1.5 M 8.8, ו143.3 מיליליטר של מים מילי-Q לתוך בקבוק עם קצה ואקום המכיל בר ומערבב. שים את המכסה על גבי ולערבב פתרון במהירות מתונה עם הוואקום ל20 דקות. הוואקום משמש לדה גז הפתרון. הפוך טרי 10% מפתרון persulfate אמוניום (APS, 218.8 g / mol): 0.2 גרם של APS ל2 מיליליטר של מים מילי-Q.
- הוספת תערובת ג'ל לגלגלית ג'ל: כאשר הוואקום נעשה להוסיף 6 מיליליטר של 10% נתרן גופרתי dodecyl (SDS, 228.38 g / mol)לצדו השני של הבקבוק כדי להימנע מלהכניס יותר בועות בפתרון. הוספת APS, מערבבים, מוסיף 0.25 מיליליטר N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine (TEMED, 116.20 g / mol) ("זהירות" TEMED הוא מגיני פנים שימוש דליק וכפפות) ומערבבים.
- יוצקים את תערובת ג'ל לגלגלית ג'ל דרך משפך המוכנס בחלק האחורי של המכשיר. יוצקים עד סנטימטר מתחת לצלחת הקצרה. הוסף 1.5 מיליליטר של butanol רווי מים לחלק העליון של ג'ל ולעטוף את הראש בניילון נצמד כדי למנוע התייבשות. לחכות לשעה 1 כדי להבטיח פילמור מלא.
- בבדיקה ג'ל: כאשר ג'ל נעשה (בדוק את הבקבוק), לפרק גלגלית הג'ל על ידי כיור. הגעה לשלמות ג'ל תוך שטיפת צלחות זכוכית עם מים חמים; לא מאפשר למים להיכנס לצלחת. שפוך butanol ולשטוף את החלק העליון של ג'ל פעמיים עם מים כדי להיפטר מבוטאנול. למלא את הראש במים שוב ולתת לשבת אם ג'לים לא נעשה שימוש באופן מיידי.
- מכין את הרצועות: הכן פתרון חיץ איזון ממקפיא (6 M אוריאה, 75 מ"מ טריס-HCl pH 8.8, 29.9% SDS, bromophenol 0.002% הכחולים). זה יכול להיות preprepared ומאוחסן ב10 aliquots מיליליטר ב -20 ° C. ממיסים 0.1 גרם של DTT ל10 מיליליטר של תמיסת חיץ איזון. צינור אחד יכול לשמש לשתי רצועות IPG. מניחים את ג'לי של הפנים כלפי מטה על רצועת החיץ ולתת לשבת במשך 30 דקות. זכור שסופו של דבר הוא ש.
- הכנת יחידת אלקטרופורזה (מנגנון הפרדה 2-D): הוסף 4.5 L של חיץ 1x אלקטרופורזה (25 מ"מ טריס בסיס [121.1 g / mol], 192 מ"מ גליצין [288.38 g / mol], ו0.1% w / v SDS [288.38 g / mol]) לטנק הריצה. מאגר זה יכול לשמש לתקופה של עד 3x. הפעל את יחידת אלקטרופורזה ב. בדוק את רמת מים במכונה קירור מים ולמלא אותו במים אם הוא נמוך. הדלק את המכשיר, מצב עיתונות כדי לבדוק את הטמפרטורה המיועדת, שאמורה להיות 10 ° C.
- הפוך 1 ליטר של חיץ 2x ריצה ו1 ליטר של 1x של הפעלת מאגר ולאחסן אותם ב 4 ° C. הפוך פתרון האיטום-agarose: משקל 0.25 גרם של agarosדואר ולהתמוסס ב50 מיליליטר של חיץ 1x פועל. Pulse ל15 שניות כל אחד.
- הקמת יחידת אלקטרופורזה: פינצטה השתמש כדי להוציא את כל רצועה ולהסיר את החיץ העודף משני הצדדים עם נייר מגבת נקייה. אל תיגעו ברצועות. יוצקים את המים על החלק העליון של ג'ל ומרפד את החלק העליון ג'ל עם חיץ 1x פועל. להשתמש בפינצטה נקייה ומניח את הרצועות על גבי הצלחת הארוכה, עם צד ג 'פונה כלפיכם. הוסף חוצץ 1x לרצועות כדי לשמן אותו. רצועות שקופיות בהמשך באמצעות רצועות פלסטיק. הסר את כל הבועות שבבין הרצועה וג'ל.
- הוספת פתרון האיטום-agarose לחלק העליון של הרצועה כדי לאטום אותו. חזור על פעולה עבור שאר הרצועות. מקם את צלחות זכוכית המכילות ג'ל לעריסת ג'ל ונמוך לתוך טנק ג'ל. להבטיח את רמת חיץ 1x בחדר החיצוני היא בשורה תחתונה המיועדת לפני שהכניס את החדר העליון ב.
- הנח את המסגרת לתא חיץ עליון על גבי לוחות הזכוכית ולהבטיח שהוא כל way למטה על ידי לחיצה למטה בתחתית. השתמש במשפך ולהוסיף למאגר פועל 2x לתוך התא העליון עד לקו האמצע. השתמש במשפך ולהוסיף למאגר הריצה 1x לתא החיצוני עד שהוא מגיע לשורה העליונה. מניחים את המכסה על גבי ולהפעיל את יחידת אלקטרופורזה ואת חבילת הכוח.
- הפעל לילה בשעה 52 V, 96 mA, 5 W. בדוק אם הזרם הולך על ידי מחפש בועות על חוט הכסף קרוב לפסגה. הרץ את הג'ל עד הקו המוביל הוא 1 סנטימטר מהחלק התחתון.
- יכולים גם להיות מנותחים חלבונים תוך שימוש בציוד וחומרים כימיים מחברות אחרות BioRad או Hoefer כאמור, בהתאם להוראות יצרן.
6. צביעת כסף של ג'לי ויזואליזציה ג'ל (יום 5-6)
- הכן פתרון תיקון 1 (800 אתנול מיליליטר, חומצה אצטית 200 מיליליטר, ו -1,000 מיליליטר של מים מילי-Q במנדף לדלי פלסטיק). הפתרון טוב ל6 ג'לים. הפעל את כל המכונות ולקחת את כל החלק האמצעי של יחידת אלקטרופורזה וpuיהיה עליה בכיור. גם לשים את העמדה הלבנה בכיור. משוך החוצה את המגש העליון המכיל את חיץ הריצה 2x.
- לפרק את המנגנון והסר את ג'לי מלוחות הזכוכית לפתרון לתקן 1. ניתן לזהות ג'לים על ידי חיתוך פינות כאשר הם הוסרו מצלחות הזכוכית, מספר הפינות לחתוך המתאים על מנת ג'ל בגלגלית.
- מניחים את המכל עם פתרון התיקון וג'לים על כיסא נדנדה במשך שעה לפחות 1 לילה לב 4 ° C.
- העבר את ג'לי לתקן פתרון 2 (20 מיליליטר של glutaraldehyde 50%, 600 מיליליטר של אתנול, 5 גרם של tetrathionate אשלגן (302.46 g / mol), 136 גרם של נתרן אצטט (82.03 g / mol), ומים מילי-Q כדי 2,000 מיליליטר) ומניחים על כיסא נדנדה במשך שעה 1.
- שטוף את הג'לים 4x ל15 דקות כל אחד במים מילי-Q.
- להכתים את ג'לי בכסף חנקת פתרון (4 גרם של כסף חנקתי (169.87 g / mol), 500 μl של פורמלדהיד, ומים מילי-Q ל -2,000 מיליליטר) ל30 דקות או עד 48 שעה.
- שטוף ג'ל ל1דקות במים מילי-Q.
- העברה לפתרון מפתחים (60 גרם של סודיום קרבונט (105.99 g / mol), 300 μl של פורמלדהיד, 15 מ"ג של נתרן תיוסולפט (158.11 g / mol), ומים מילי-Q ל -2,000 מיליליטר) עבור 5-30 דקות עד ג'ל מוכתם.
- שים את ג'לי בStop פתרון (של טריס-Base (121.14 g / mol), 40 מיליליטר של חומצה אצטית 100 גרם, ומים מילי-Q ל -2,000 מיליליטר) ל10 דקות.
- לאחסון, להעביר את ג'לי לגליצרול פתרון (40 מיליליטר של גליצרול או 400 מיליליטר אם אחסון לטווח ארוך הוא רצוי, ו1,600 מיליליטר מים מילי-Q) ל10 דקות ולאחר מכן לייבש אותם בעזרת מייבש ג'ל.
- ניתן דמיינו ג'לים לאחר הצביעה באמצעות מערכות הדמיה כגון סורק / densitometer, צילם באמצעות transilluminator אור או תרמי ג'ל. תוכנת ניתוח תמונה כגון ניתוח 2-D PDQuest מBioRad לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להשיג מידע כמוני ואיכותי מחלבונים במדגם.
7. ג'ל כסף מכתים לניתוח ספקטרומטריית המסה
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניתוח השוואתי של פרופילי החלבון המופקים מאותה התרבות חיידקים בשתי הזדמנויות שונות הראה פסי דפוסים דומים המצביע על עקירות חלבון מוצלחות. חלבונים במשקל מולקולריים שחולצו נעו 10-150 kDa. איור 1 מציג נציג ג'ל Coomassie כתמי כחולים של עקירות חלבון כל התא מmultivorans Burkholderia (חבר של BCC) קליני מבודדים גדל בLB או שמרים / Manitol מרק (YEM) ו נקטף משלב נייח.
לניתוח ג'ל אלקטרופורזה 2-D, 200 מיקרוגרם של חלבונים הכולל מBurkholderia pseudomallei שימש (איור 2). מאז פתוגן זה מוכר כחומר לחימה ביולוגית B-סוג על ידי המרכז האמריקאי לבקרת מחלות ומניעתן 25, נהלי הכנת חלבון בוצעו במעבדה 3 בלימה ביו בטיחות רמה ובהתאם לנהלי פעולה סטנדרטיים.חלבוני resuspended בפתרון להחזרת נוזלים ולהחיל 24 סנטימטר ארוך המשותק pH 4-7 שיפוע וחלבונים הופרדו על פי הנקודה איזואלקטרית (PI). אז רצועות הונחו על ג'ל SDS-polyacrylamide וחלבונים הופרדו על פי המשקל המולקולרי שלהם (MW). בהמשך לכך, ג'ל היה הכסף מוכתם עבור ההדמיה נקודת החלבון. תוצאות מחקר הראו השפע של יותר מ -500 כתמי חלבון זה יכול להיות מזוהה באופן אישי על ידי ספקטרומטריית מסה.
איור 1. פרופילי חלבון כוללים של multivorans Burkholderia מבודד. SDS-PAGE ניתוח של חלבון המופק בשלב נייח מD-2214 ו-D-2094 מבודדים גדלו בLB או מרק שמרים / Manitol (YEM) בשתי הזדמנויות שונות (1 ו -2). 4 מיקרוגרם של חלבון הועמסו בכל מסלול של ג'ל 12.5% ומוכתמים wiה Coomassie כחול. ליין M, סמן חלבון.
איור 2. ניתוח ג'ל אלקטרופורזה 2-D של Burkholderia pseudomallei 1234B בודד. הפרדת נציג מוכתם כסף 2-D ג'ל מראה חלבון בPI 4 לרצועת 7 טווח. תמציות חלבון כל התא (200 מיקרוגרם) בשלב נייח שימשו ומופרדות על 15% ג'ל SDS-PAGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה להכנת חלבונים שתוארה שיכול לחלץ את רוב חלבוני Burkholderia עם שחזור טוב. זו באה לידי הביטוי על ידי קבלת באותו פרופיל חלבון משני תכשירים עצמאיים שבוצעו בימים שונים תוך שימוש באותה התרבות חיידקים גדלה בLB או מרק YEM כפי שמוצג באיור 1. החילוץ היה יעיל לחיידקים גדלו בתקשורת נוזלית, אך יש לנו לא נבדקו בשיטה זו לחיידקים גדלו על צלחות. שיטה זו שימשה גם לאפיון חלבונים נוסף באמצעות כלים proteomic; הקבוצה שלנו למדה בהצלחה שינויי proteome באמצעות ג'ל אלקטרופורזה 2-D ותיוג איזוטופ כדי לכמת יחסי ומוחלט (iTRAQ) טכניקות proteomic 15,23,24. באפשרות השנייה, חלבונים שהוצאו למאגר המכיל 0.5 M EDTA ב-PBS, כדי למנוע כל הפרעה של PMSF עם ניסויי iTRAQ 15.
חשוב remארון כי בתהליך מיצוי החלבון וג'ל אלקטרופורזה 2-D, צריכים להתבצע בכל הצעדים על 4 מעלות צלזיוס או בתנאים קרים באמצעות דליי קרח כדי למזער את פירוק חלבונים, כמו גם להשתמש בטיפים מחוברים וללבוש כפפות nitrile ולכסות את כל עור על מנת למנוע זיהום קרטין מכל כתמים בנוי לזיהוי לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה. בעת ביצוע עקירות חלבון, חשוב גם לקחת בחשבון שיש לו את PMSF זמן מחצית חיים קצר בתמיסות מימיות, על פי היצרן, ולכן פתרון מניות מ"מ 0.1 באצטון צריך להיעשות מייד לפני השימוש. לחלופין, ניתן להשתמש במעכבים אחרים סרין או מעכבי פרוטאז, כי הם יותר מסיסים ויציבים, ופחות רעילים, למרות שאנחנו לא צריכים לבדוק אותם בניסויים שלנו.
מאגר תמוגה משמש בהליך זה אינו מכיל אוריאה, וזה חשוב עבור solubilization כדי לחלץ את שני חלבונים מימיים (cytosolic) וprot פחות מסיסEins, כולל כמה חלבוני קרום 17. אבל, במהלך הכנת דגימה לאיזואלקטרית ראשון ממד התמקדות (שלב 3 של פרוטוקול זה), דגימות resuspended בחיץ להחזרת נוזלים המכיל אוריאה. טכניקות proteomic אחרות כרוכות גם טיפול דומה 26. לפני ביצוע בצעד להחזרת הנוזלים, נראה כי הסרת חומרים להתערב או זיהומים במשקל מולקולריים נמוכים היא קריטית עבור ברזולוציה גבוהה, אנו ממליצים להשתמש בערכת 2-D-נקי בכל דגימות חלבון כשיפור בתוצאות. בעבר טעינת הדגימות להפרדת התמקדות איזואלקטרית ראשון ממד, לוודא שיש רצועות מוכנות של נייר סופג גודל זכותם של המחזיקים ברצועה, כמו זו היא בעייתית לחתוך את הגודל הנכון באופנה אספטיים על המקום (לצעד 3.4 של זה פרוטוקול).
לפני הפעלת ג'ל אלקטרופורזה SDS-polyacrylamide 2-D, יש צורך להבטיח כי אחוז הג'ל מתאים הגדלים הצפויים של ריבית (12.5% ג'ל אחוז יכול לפתור חלבון בטווח של 14-100 KDA). לאחר ג'ל אלקטרופורזה הממד השני הושלמה, הדמיה של חלבונים יכולה להיות מושגת על ידי מכתים כחול או כסף Coomassie; מכתים האחרון היא רגיש יותר עם גבול גילוי היא נמוכה כמו 0.1 ng / חלבון / מקום 20. כתמי חלבון דמיינו עם צביעת כסף מתאימים לניתוח נוסף על ידי ספקטרומטריית מסה. עם זאת, חשוב להזכיר כי פתרון כתם כסף לא יכיל glutaraldehyde מאז סוכן זה Crosslinks עם חלבונים, ולכן זה לא תואם עם ניתוח ספקטרומטריית מסה נוסף 20. לחלופין, כדי לזהות ולכמת חלבונים הביעו באופן דיפרנציאלי, ניתן להשתמש בגישה מבוססת ג'ל אחר כגון דו ממדים-הבדל בג'ל אלקטרופורזה (2D-DIGE) יחד עם תוכנה אוטומטית. גישה זו מעסיקה תגי ניאון שונים (לדוגמא: 3 2 סיי, 5 ו), המשמשים לדגימות תווית ויחסי ציבור תקן פנימיים אוניברסלייםIOR להתגברות אלקטרופורזה הממד שני, במידה מסוימת, את החסרונות של וריאציה ושחזור של אלקטרופורזה 2-D 27. בנוסף, יכול להיות מוכתם ג'לים אחרי הממד השני עם SyproRuby, שהוא כתם chelate רותניום אורגנומתכתית תוכנן עבור יישומי proteomic. הוא יכול לזהות כתמי חלבון עם רגישות דומה לזה צביעת כסף, אבל עם רגישות רבה יותר מאשר Coomassie הכחול. לאחר יכול להצטלם ג'לים מכתים עם סורק לייזר או transilluminator 28.
לסיכום, בסרטון זה מתאר את הליך כל תא חיידקי חלבון מיצוי ושיטת ג'ל אלקטרופורזה 2-D שיכול לאפשר את המחקר של שינויים הגלובליים בproteome במינים Burkholderia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מלגת לימודים מאוניברסיטת בריטיש קולומביה (לBV) ומענקים מסיסטיק פיברוזיס מכוני קנדה וקנדיים לבריאות מחקר (לDPS). אנו מודים לז'קלין צ'ונג להכנה הראשונית של פרוטוקולים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | Toxic, corrosive |
| Acetone | Fisher | A18-1 | Flammable |
| PBS Buffer | Bioscience | R028 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP118-500 | toxic |
| Glass beads (0.1 mm) | BioSpec Products | 11079101 | |
| Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) | VWR | 21009-342 | |
| MicroBCA protein extraction kit | Pierce | 23235 | |
| Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring | Fisher | 02-681-375 | |
| 2-D Clean-Up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| Urea | Invitrogen | 15505-050 | Irritant |
| CHAPS | Amersham Biosciences | 17-1314-01 | |
| Dithiothreitol (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 | Irritant |
| Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
| Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | Very toxic, carcinogen |
| Ammonium persulfate | Fisher | BP179-100 | Flammable, toxic, corrosive |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | Flammable |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Acute toxicity, flammable |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Ethanol | Fisher | HC1100-1GL | Flammable, toxic |
| Acetic acid | Fisher | A491-212 | Flammable, corrosive |
| Glutaraldehyde | Fisher | G151-1 | Very toxic, corrosive, dangerous for the environment |
| Potassium tetrathionate | Sigma | P2926 | Irritant |
| Sodium acetate | EM Science | 7510 | |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | Corrosive, dangerous for the environment |
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | Toxic |
| Sodium thiosulfate | Sigma | S7026 | |
| Tris Base | EMD | 9230 | |
| Glycine | MPBiomedical, LCC | 808831 | |
| Glycerol | MPBiomedical, LCC | 800688 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Flammable, toxic, health hazard |
| Sodium carbonate anhydrous | EMD | SX0400-3 | Toxic |
| Mineral oil | ACROS | 415080010 | |
| Equipment | |||
| JA-20 ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | 3110BX | |
| Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
| Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |
References
- Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
- Suarez-Moreno, Z. R., et al. Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia. Microb. Ecol. , (2011).
- Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).
- White, N. J. Melioidosis. Lancet. 361, 1715-1722 (2003).
- Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).
- Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis. Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).
- Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment. J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).
- Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).
- Govan, J. R. W., et al. Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis. Lancet. 342, 15-19 (1993).
- Thongboonkerd, V., et al. Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence. J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).
- Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry. Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).
- Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol. Cell Probes. 21, 81-91 (2007).
- Harding, S. V., et al. The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).
- Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy. Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).
- Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis. J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).
- Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map. Proteomics. 6, 207-216 (2006).
- Weiss, W., Gorg, A. Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis. Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).
- von der Haar, T. Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts. PLoS One. 2, e1078 (2007).
- O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).
- Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags. J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Velapatiño, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis. Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).
- Chung, J. W., Speert, D. P. Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host. Microbiology. 153, 206-214 (2007).
- Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).
- Thon, J. N., et al. Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches. Transfusion. 48, 425-435 (2008).
- Wu, T. In New and Emerging Proteomic Techniques. Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).
- Lopez, M. F., et al. A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).
