Summary
Burkholderia cinsin üyeleri klinik önemi patojenlerdir. Bu, mekanik bozulma ve daha sonraki analiz için proteomik 2-D jel elektroforezi kullanılarak, toplam bakteri protein çıkarımı için bir yöntem tarif eder.
Abstract
Bakteri türlerinin hücre içi protein düzeylerinin araştırılması bu organizmaların neden olduğu hastalıkların patojenik mekanizmaların anlaşılması önem taşımaktadır. Burada, fosfat tamponlu tuzlu su içinde, etilendiamin tetraasetik asit ve fenilmetilsülfonil florit varlığında, cam boncuklar kullanılarak mekanik olarak parçalanması göre Burkholderia türünden protein çıkarımı için bir prosedür tarif eder. Bu yöntem, değişik büyüme koşulları için, farklı Burkholderia türler için kullanılabilir, ve bu diğer bakterilerin proteomik çalışmalarda kullanım için olası uygundur. Protein ekstre edilmesinden sonra, bir iki boyutlu (2-D) jel elektroforezi proteomik teknik bu organizmaların proteomlarda genel değişiklikler çalışma açıklanmaktadır. Bu yöntem, molekül ağırlığı bazında ayrılması ve ardından birinci boyutta izoelektrik odaklama ile izoelektrik noktasına göre proteinlerin ayrılması oluşurikinci boyutta akrilamid jel elektroforezi ile. Ayrılmış proteinlerin görselleştirilmesi gümüş boyama ile gerçekleştirilir.
Introduction
Genus Burkholderia fazla 62 türü, niş geniş bir izole edilen Gram negatif organizmaları içerir ve iki ana küme 1,2 ayrılmıştır. İlk küme insan, hayvan ve phytotrophic organizmaları içerir ve en çok çalışmalar nedeniyle klinik önemi bu grubun patojenik türler odaklanmıştır. En patojen üyeleri B'dir pseudomallei ve B. (sırasıyla Meliodosis ve ruam neden olur) mallei 3,4 ve kistik fibrozis (CF) ve kronik granülomatöz hastalık (ÇGD) hastalığa neden fırsatçı patojenler 5 (Burkholderia cepacia'nın kompleksi, BCC 17 tanımlanmış türler), 1. 30'dan fazla patojenik türlerle ikinci küme, bitkiler ya da ortamı ile ilişkili bakteri içerir ve ana 2 için potansiyel olarak yararlı olarak kabul edilmektedir.
Çok sayıda komplikasyonlar ortaya frBu tür durumlarda, çünkü 6-9 çoğunda ortadan kaldırmak için zor hale antibiyotiklere karşı içsel veya kazanılmış direnç hasta, hastalığın yayılmasını ve tedavi başarısızlık arasındaki patojenin iletimi gibi Burkholderia cinsin patojenik üyeleri ile om bakteriyel enfeksiyon. Bu nedenle, bakteriyel enfeksiyon kurulması için esas daha net bir anlayış kazanıyor bu organizmaların neden olduğu hastalıkların tedavisi için çok önemlidir. Enfeksiyon kurulması anlamak amacıyla, patogenez ile ilişkili bakteri bileşenleri üzerinde kapsamlı çalışmalara ihtiyaç vardır. Proteomik yaklaşımlar kullanılarak Burkholderia organizmaların proteomik analizi odaklanan çalışmalar bakteri patojeninde yanı sıra proteomu değişiklikler 10-16 profilleri edilmiş proteinler açıklanmıştır.
Yüksek konsantre ihtiva eden liziz tamponu içinde sonikasyon ve dondurularak çözülmüş döngüleri kullanılarak protein çıkarma yöntemleriüre entration, deterjan ve amfolitler ile kombinasyon halinde tioüre Burkholderia proteomik çalışmalar 10-13 uygulanmıştır. Üre protein denatürasyonu için oldukça etkili olsa da, bu şekilde (Karbamilleme reaksiyonu) 17 eserler oluşturan amino asit grupları ile reaksiyona girebilen amonyum izosiyanat, sulu çözelti içinde bir denge kurabilir. Bu nedenle, siyanat tarayıcılar olarak işlev taşıyıcı amfolitler içerir ve 37 ° C 17 üzerinde sıcaklıklar önlemek için önerilir. Ayrıca, protein miktarının eden liziz tamponu, herhangi bir kimyasal etkileşimi önlemek için, aynı liziz tamponu örnekler ve standartlar, aynı arka plan 10 sahiptir, böylece standart bir eğri oluşturmak için kullanılabilir. Diğer yöntemler ısı kuluçka dönemleri 17,18 ile alkalin tamponlar ve deterjan kullanımını içerir, ancak bu koşulların proteomun değişikliklere neden olabilir ve bazı deterjanlar pr ile uyumlu değildiroteomics uygulama müteakip deterjan kaldırma adımlar 17,18 dahil edilmedikçe.
, Yeterli bir özümleme ve miktar sonra her bir proteinin küresel protein ekspresyonu, iki boyutlu (2-D) jel elektroforezi gibi proteomik yaklaşımlar kullanılarak incelenebilir. Bu teknik, ilk olarak O'Farell 19 tarafından tanımlanan ve ikinci boyutta akrilamid jel elektroforezi ile birinci boyutta izoelektrik odaklama ile izoelektrik noktasına göre proteinlerin ayrılması, ve daha sonra, moleküler ağırlığa göre de oluşuyor. Nedeniyle çözünürlük ve hassasiyet için, bu teknik karmaşık biyolojik kaynaklardan 19,20 proteinlerin analizi ve tespiti için güçlü bir araçtır. Bu ayırma tekniği transkripsiyon sonrası modifikasyon veya proteolitik işlenmesi nedeniyle protein izoformlarını çözme büyük avantajı ile protein-merkezli yaklaşımlar şu anda kullanılabilir. Kantitatif değişikliklerJelin 20 lekelenmesiyle karşılık gelen nokta yoğunluğunu karşılaştırarak tespit edilebilir. Ancak, bu teknik çok büyük proteinler, zar proteinleri, oldukça bazik ve asidik ya da hidrofobik proteinlerin tanımlanması için uygun ve biraz zahmetli ve zaman alıcı bir teknik 20'dir değildir. Daha sağlam ve objektif olan yeni peptid-merkezli yaklaşımlar (non jel bazlı) kullanılabilir hale gelir ve bu (İcat) 21 etiketleme izotop kodlu afinite ile sistein etiketleme, ve amino grubu gibi diferansiyel izotop etiketleme yöntemleri ile Kantitatif karşılaştırma için kullanılabilir göreli ve mutlak kantitatif (iTRAQ) 22 için izotop etiketleme tarafından etiketleme. Tek proteomik tekniğin kullanılması yeterli bilgi verebilir ve bu nedenle, iki tamamlayıcı proteomik yaklaşımların kullanımı proteom en tam değerlendirmek değişiklikler için gereklidir. Bununla birlikte, 2-D jel elektroforezi yaygın olarak kullanılan ve rutin Quan için uygulanabilirfarklı organizmalar çeşitli proteinlerin ifadesini titative.
Burada adapte ve optimize GE Healthcare 2-D Elektroforez Esaslarına ve yöntemleri Handbook 80-6429-60AC 2004 (edildi Burkholderia türler için bir bütün hücre protein çıkarma ve 2-D jel elektroforezi prosedürlerini tarif www.amershambiosciences.com ). Protein ekstre etme, 5 mM EDTA (etilendiamin tetraasetik asit) ve 1 mM PMSF (fenilmetilsülfonil florür) içeren PBS varlığında, cam boncuklar ile bir boncuk çırpıcı kullanılarak gerçekleştirildi. Bu işlem en az bozulma ile proteinlerin ölçümü sağlar ve daha önce bildirilen 15,23,24 gibi proteomik yaklaşımlar için iyileştirilebilir. 2-D jel elektroforezi 24 cm uzun hareketsiz pH 4-7 gradyan ve proteinleri kullanılarak gerçekleştirildi izoelektrik noktasına göre ayrıldı. Sonra proteinler Molec göre ayrıldıSDS-poliakrilamid jel ile küler ağırlığı. Ayrıca, nokta proteinlerin görselleştirme ve kütle spektrometre analizi için uygun olan bir gümüş leke yöntemi için bir gümüş boyama yöntemi açıklanmıştır. Birlikte bu işlemler patojeneze dahil olabilir Burkholderia türlerinin önemli proteinlerin tanımlanmasını izin verebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Kültür Büyüme (Gün 1 +2)
- Gecede 37 ° C rotator de, bir çırpıda en iyi 15 ml tüp Luria Bertani (LB) suyu 3 ml: Bir starter kültür büyütün. Bir 0.6 OD 600 gece boyunca bir büyüme seyreltin. Bir 250 ml Erlenmeyer şişesi içinde LB et suyu 100 ml, bu ayarlama seyreltme ile 1 ml ilave edilir. , Daha iyi yaklaşık için durağan faz (SP) içine 16 saat boyunca 250 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edilir toplu kültürü, enfeksiyon ve bu koşullar RPO ve çoğunluk olarak durağan faz, sinyal faktörlerinin kontrolü altında bu bakteriyel hastalık oluşturma faktörlerini sağlamak için algılama, ifade edilmektedir. Seçenek olarak ise, erken SP ya da orta-ya da geç logaritmik fazı yetiştirilen bakteri bakteri adaptasyon faz üzerinde bilgi elde etmek için kullanılabilir.
- 16 saat OD 600 ölçmek ve temin sonra kültür aynı koşullar altında, daha önce yapılmış bir büyüme eğrisi ile karşılaştırma ile SP ulaşmıştır.
2. Protein Ekstraksiyon (Gün 3)
- Taze 0.1 M fenilmetansülfonil florür FMSF ('DİKKAT' PMSF, kullanımı yüz kalkanları ve eldiven toksik ve korozif) 'dir (' DİKKAT 'aseton aseton 1 ml içinde 0.0174 g eriterek aseton (PMSF, 174,19 g / mol) çözeltisi hazırlayın zehirli ve yanıcı) yüz maskeleri ve eldiven kullanın.
- 0.1 ml 0.1 M PMSF, 0.5 M EDTA, 0.1 ml ve 9.8 ml PBS: bir PBS / EDTA / PMSF çözelti hazırlayın. O SP olması gereken yerde 16 saat kültür OD yaklaşık edin.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 4500 x g 'de, bir santrifüj tüpüne Oakridge ve santrifüj kültür için bakteri kültürü ve transferi 35 ml alın
- Bir çöp konteynerine süpernatant kaldırmak vesoğutmalı PBS 35 ml ekleyin ve pelet tekrar süspansiyon. Santrifüj tekrar 20 dakika boyunca 4500 x g'de, 4 ° C'de
- Soğuk PBS içinde 1 ml süpernatan ve tekrar süspansiyon çıkarın. 2 ml Eppendorf ve 4 ° C'de 14,000 x g'de mikrosantrifüj içinde yüksek üzerinde santrifüj 1 dk, steril Aktarma Çıkarın ve supernatant atın.
- PBS / EDTA / PMSF solüsyonu 1 ml ilave edilir, 2 ml pelet ve transfer ~ 0.5 ml bir cam boncuk (presterilized) ihtiva eden (o-halka) ile vida başlıklı bir tüp tekrar süspansiyon. Cam boncuklar ve boncuk soğuk bir odada 1 dakika boyunca 4 ° C 'de bash içeren tüpe yeniden süspansiyon haline pelet ekleyin. Her bash sonra buz üzerinde örnek koyarak, bu 3x yapmak.
- Mikrosantrifüj içinde 1 dakika için 14,000 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı ve steril bir 5 ml polistiren tüp koydu.
- Verim aynı tüpe PBS / EDTA / PMSF solüsyonu 1 ml eklemek arttırmak için tekrar cam boncuklar içerir. Boncuk Bash 1 dakika boyunca 4 ° C'de tüp. Bu 2x buz af örneği koyarak mıter bash. Santrifüj bir dakika 14.000 xg de santrifüj ve süpernatant kaldırmak ve adım 2.8 süpernatanıyla ekleyin. Yeni bir steril 2 ml Eppendorf tüpüne polistiren tüp bir 1 ml şırınga ve bir 0.20 mikron filtre süpernatan kullanın.
- Bu noktada örneklerin Pierce MicroBAC protein ekstre etme kiti ve 200 ug alikotları kullanılarak protein miktarı için tahlil edilmesi gerektiği de dondurulmuş olmalıdır -80 ° C kadar gerekmektedir.
3. Numune Hazırlama (4. gün)
- 25 ml rehidrasyon bir stok çözelti hazırlayın (8 M üre,% 2 CHAPS,% 2 IPG tamponu,% 0.002 bromofenol mavisi) -20 ° C'de ve 2.5 ml alikotları saklayın Rehidrasyon stok solüsyonu 2.5 ml kısım için kullanımdan hemen önce 7 mg ditiotreitol (DTT, 154.2 g / mol) ilave edin.
- Süreç adım 3.1 'de hazırlanan rehidrasyon stok çözeltisi 450 ul nihai resüspansyondan ile kiti, 2-D Clean up kullanarak adım 2.10 örnekler çözülmüş.
4. IlkOdaklama boyut Izoelektrik (İEF) (Gün 4)
Bu bölümdeki tüm adımlar Ettan IGPhor İEF Sistemini kullanıyor.
- IPG Birinci boyut şeritleri kurmak: şerit temizleme solüsyonu ile temiz şerit tutucuları ve sonra kurumaya baş aşağı bırakın, Milli-Q su ile yıkayın. Bir jel şerit tutucu sayısına her örnek atamak.
- (-) Ucu ikinci geniş bir alanda rehidrasyon aşamasından gelen numune yükleyin. Ambalaj dışında jel şeritler çekin temiz forseps kullanın. Jel şeritler koruyucu tabakasını dışarı atın. (+) Uçtan uca (-) Hat gelen yol boyunca ıslak şeritler almak için yavaş hareket kayar aşağı kaba yan şeritler.
- Tükenmişlik önlemek için elektrot üstüne ve jel şeritler altında sterilize suyla nemli kurutma kağıdı koyun. Arıtılmış su ve etanol ile mermi arasında in-cımbız durulayın. Tüm kabarcıklarını çıkarmak kuru çıkışları engellemek için madeni yağ ile ince bindirme. Makinede jel şerit tutucuları hattı.
- Rehyd için 20 ° C'de 12 saat çalıştırınrasyon, 200 V, 1 saat, 500 V, 1 saat, 1000 V 1 saat, 4000 V 0.5 saat, 8000 V, 12 saat, 300 V ve 24 saat tutun bu anda dışarı alınabilir.
- IEF tamamlandıktan sonra IPG şerit gelecek analizi için, mineral yağ ile kaplanmış Saran Wrap içine -80 ° C'de donduruldu edilmektedir sürece, bu, ikinci boyutlu SDS-poliakrilamid jel elektroforezi gerçekleştirmek tavsiye edilir. Alternatif olarak, DTT nedeniyle erişim noktası iz kalmasından kaçınmak amacıyla bu IPG iodoasetamid ihtiva eden bir tampon maddesi ile önceden ikinci boyuta şeritler bir ikinci dengeleme aşamasını içerir mümkündür.
5. İkinci boyut SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (gün 5)
Bu bölümde tüm adımlar Ettan DALTsix elektroforez aygıtı kullanılarak edilir.
- Jel teker aparatı monte etmek için, iyice tüm parçaları temizlemek ve emin olun jel tekeri düzeyi ve bağlayıcı gri kauçuk silikon jel ile yağlanır. Siyah ovmak koydualt üçgen tıpa ber. Daha sonra, alternatif olarak cam ön bakan kısa plaka ile ayırıcı ve cam levha yerleştirin. Ayırıcılar arka ve ön olduğundan emin olun. Dolgu maddeleri (yaklaşık 5 yaprak) kalan alanı doldurmak için, üst düzdür. Dışarıdan kırmızı ucu ile ön paneli koydu. Kullanım her tarafı sıkın ve alt vidalarını sıkmak için sıkıştırır.
- Jel hazırlanması: Duracryl ve 297,3 ml ekleyin, Tris Buffer 147 ml 1.5 M pH 8.8, ve vakum ucu içeren bir balona Milli-Q su 143.3 ml ('DİKKAT' Duracryl toksik kullanımı yüz kalkanları ve eldiven olan) bir karıştırma çubuğu. Üst kapak koyun ve 20 dakika süreyle vakum ile orta hızda çözelti karıştırın. Vakum çözelti de gazı için kullanılır. Milli-Q su içinde 2 ml APS 0.2 g amonyum persülfat çözeltisi (APS, 218.8 g / mol) taze bir% 10 olun.
- Jel döküm için jel karışımı ekleme: vakum yapıldığında% 10 sodyum dodesil sülfat 6 ml (SDS, 228,38 g / mol) ekleyinşişenin yan tarafına çözelti içinde daha fazla kabarcıklar koyarak önlemek için. , APS ilave edin, '-tetrametiletilendiamin (TEMED, 116.20 g / mol) 0.25 ml N, N, N ekleyebilir (' DİKKAT 'TEMED yanıcı kullanımı yüz kalkanları ve eldiven) ve karıştırın.
- Düzeneğin arka sokulan bir huniden jel döküm içine jel karışımı dökün. Kısa plakasının altında bir inç kadar dökün. Jel üstüne suyla doyurulmuş butanol 1,5 ml ilave edilir ve su kaybını önlemek için saran sargı ile üst sarın. Tam edilebilir bir polimerizasyonun sağlanması için 1 saat boyunca bekleyin.
- Jel Denetleme: jel (şişeyi kontrol edin) yapıldığında, bir lavabo ile jel tekeri sökmeye. Ilık su ile cam plakalar durulama sırasında jel bütünlüğünü kontrol, su plakasını girmek için izin vermez. Butanolü dökün ve butanol kurtulmak için iki kez su ile jel üst durulayın. Tekrar su ile doldurun ve üst jeller hemen kullanılmadığı takdirde bekletin.
- Çıtalarının hazırlanması: dengeleme tampon maddesi çözeltisi hazırlayınDerin dondurucu (6 M Üre, 75 mM Tris-HCl pH 8.8, 29.9% SDS,% 0.002 bromofenol mavisi). Bu, -20 ° C'de önceden hazırlanmış ve 10 mi alikotlar içinde muhafaza olabilir, Denge tampon çözeltisi, 10 ml DTT 0.1 g. Bir tüp iki IPG şeritleri için de kullanılabilir. Tampon üzerine aşağı şerit yüz jelleri koyun ve 30 dakika bekletin. Hangisi sonu hatırlıyorum.
- Elektroforez ünitesi (2-D ayırma aygıtı) hazırlanması: 1x elektroforez tamponu (25 mM Tris baz [121,1 g / mol], 192 mM Glisin [288,38 g / mol], ve% 0.1 ağırlık / hacim SDS [288,38 4.5 L ekleyin g / mol]) çalışma tankına. Bu tampon 3x kadar kullanılabilir. Elektroforez birimini açın. Su soğutma makinesi su seviyesini kontrol edin ve düşük ise su ile doldurun. 10 ° C olmalıdır belirlenen sıcaklığını kontrol etmek için basın modu, makineyi açın
- 2x çalışan tampon maddesi 1 L ve tampon çalışan 1x 1 L yapın ve 4 ° C'de saklayın Ağırlık agaros 0.25 g: agaroz-sızdırmazlık çözümü olune ve 1x çalışan tamponu, 50 ml içinde çözülür. 15 saniye her Pulse.
- Elektroforez birimi kurma: cımbız kullanın her şerit çıkarmak ve temiz bir kağıt havlu ile her iki tarafta aşırı tampon kaldırmak için. Şeritler DOKUNMAYIN. Jelin üstünde su dökün ve 1x çalışan tamponu ile jel üst satır. Temiz cımbız kullanın ve jel tarafı size bakacak, uzun plaka üstüne şeritler yerleştirin. Yağlayın şeritler 1x tampon eklemek. Slayt şeritler daha aşağı plastik şeritler kullanarak. Şerit ve jel arasındaki tüm kabarcıklar çıkarın.
- Mühür şeridinin üstüne agaroz sızdırmazlık solüsyonu ekleyin. Şeritlerin geri kalanı için tekrarlayın. Jel tanka cam jel yuvasına içeren jeller tabak ve düşük yerleştirin. Dış odasında 1x tampon seviyesinin üzerinde üst bölmeyi koymadan önce belirlenen alt satırında olduğundan emin olun.
- Cam levhaların üzerine üst tampon bölmesi için çerçeve yerleştirin ve tüm wa sağlamakalt bastırarak y aşağı. Bir huni kullanın ve orta çizgisine kadar üst odasına 2x çalışan tampon ekleyin. Bir huni kullanın ve üst satıra ulaşana kadar dış odasına 1x çalışan tampon ekleyin. Üstüne kapak yerleştirin ve Elektroforez ünitesi ve güç paketi açın.
- , 52 V gecede 96 mA, 5 W. mevcut en yakın gümüş tel üzerinde kabarcıklar bakarak gidiyor olmadığını kontrol çalıştırın. Önde gelen çizgi alttan 1 cm kadar jel çalıştırın.
- Proteinler aynı zamanda üretici talimatlarına göre, ekipman ve diğer şirketler gibi BIORAD veya Hoefer belirteçler kullanılarak analiz edilebilir.
6. Jel Görselleştirme Jellerin gümüş rengini (Gün 5-6)
- (Plastik bir kova içine 800 ml etanol, 200 ml asetik asit ve bir duman başlığı kullanılmıştır Milli-Q su içinde 1000 ml) bir düzeltme çözüm 1. hazırlayın. Çözüm 6 jeller için iyidir. Kapalı tüm makineleri çevirin ve Elektroforez ünitesi ve pu bütün orta bölümüne göz atınlavaboya edeceğiz. Ayrıca lavabo beyaz standı koymak. 2x çalışan tampon içeren üst tepsisini dışarı doğru çekin.
- Cihazı sökmeye ve düzeltme çözüm 1 içine cam plakalardan jelleri kaldırın. Jeller, bunlar cam plakalardan kaldırıldığında köşeleri keserek tespit edilebilir, köşelerin sayısı döküm olarak jel siparişine karşılık gelen kesin.
- En az 1 saat için gece boyunca 4 ° C'de bir çalkalayıcı üzerinde düzeltme çözeltisi ve jeller ile kap yerleştirin
- (% 50 glutaraldehid, 600 ml etanol, 5 potasyum tetratiyonat g (302,46 g / mol), 136 bir sodyum asetat (82,03 g / mol) g ve Milli-Q su ile 20 ml çözelti 2 düzeltmek için jeller transfer 2.000 ml) ve 1 saat için bir rocker yer.
- Jeller Milli-Q su içinde, 15 dakika her biri için 4x yıkayın.
- 30 dakika veya en fazla 48 saat boyunca gümüş nitrat çözeltisi (2.000 ml, gümüş nitrat (169,87 g / Mol) ve formaldehit 500 ul ve Milli-Q su içinde 4 g) 'de jeller Leke.
- 1 için jel yıkayınmin Milli-Q su içinde.
- 5-30 dakika boyunca (2.000 ml, sodyum karbonat, 60 g (105,99 g / Mol) ve formaldehit 300 ul, sodyum tiyosülfat (158,11 g / mol), 15 mg, ve Milli-Q su) geliştirici Çözüm transfer dek jel lekeli.
- 10 dakika boyunca (2.000 ml Tris-Base (121,14 g / mol), asetik asit, 40 ml, 100 g ve Milli-Q su) Stop Solution jeller koyun.
- (Uzun süreli depolama isteniyorsa gliserol 40 ml veya 400 ml ve Milli-Q su içinde 1600 ml) depolama için, gliserol çözeltisine jeller transferi, 10 dakika boyunca ve daha sonra bir jel kurutucu kullanılarak kurutun.
- Jetler, ışık transilluminator'de veya Jel görüntüleyicisi kullanılarak fotoğraflandı bir tarayıcı / dansitometresinde, gibi görüntüleme sistemleri kullanılarak boyandıktan sonra görülebilir. Bu tür BioRad'dan PDQuest 2-D analizi gibi Image Analysis yazılımı daha sonra bir numune içinde proteinlerden niceliksel ve niteliksel bilgileri elde etmek için kullanılabilir.
7. Kütle Spektrometre Analiz için jel Gümüş Boyama
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İki farklı vesilelerle aynı bakteri kültürü çıkarılan protein profilleri karşılaştırmalı analizi, başarılı protein ekstraksiyonlanm gösteren benzer modeller bantlama gösterdi. Ekstre molekül ağırlıklı proteinlerin 10-150 kDa arasında değişmektedir. Burkholderia multivorans gelen tüm-hücre proteini ekstraksiyon Şekil 1 temsili Coomassie blue lekeleme jel (BCC bir üyesi) ya da Şekil LB Maya / Manitol (YEM) suyu ve yetiştirilen klinik izolatlar durağan faz hasat.
2-D jel elektroforezi analizi için, Burkholderia pseudomallei toplam proteinlerin 200 ug (Şekil 2) kullanılmıştır. Bu patojen Hastalık Kontrol ve Önleme 25 için ABD Merkezleri tarafından bir B-tipi biyolojik savaş ajanı olarak kabul edildiğinden, protein hazırlama prosedürleri Bio Güvenlik Seviyesi 3 çevreleme laboratuarda yürütülen ve buna göre standart operasyon prosedürlerine edildi.Proteinler rehidrasyon çözelti içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve izoelektrik noktası (pl) göre ayrıldı uzun pH derecesi 4-7 ve proteinleri hareketsiz kılınmış bir 24 cm uygulanmıştır. Sonra şeritler, SDS-poliakrilamid jeli ve proteinler üzerine yerleştirildi molekül ağırlığı (MW) göre ayrıldı. Daha sonra, jel protein nokta görselleştirme için gümüş lekeli oldu. Sonuçlar tek kütle spektrometresi ile tespit edilebilir 500'den protein lekelerinin bolluk göstermektedir.
Şekil 1. Burkholderia multivorans toplam protein profilleri izole eder. D-2214 ve D-2094 LB ya da iki farklı durumlarda Maya / Manitol (YEM), çorba içinde yetişen izolatı arasındaki durağan faz ile ekstre proteininin SDS-PAGE analizi (1 ve 2). Protein 4 ug wi% 12.5 jel, her şeride yüklendi ve lekeliCoomassie mavi inci. Lane M, protein işaretleyicisi.
Şekil 2. Burkholderia pseudomallei 1234B 2-D jel elektroforezi analizleri izole. 7 aralık şerit pPli 4 Temsilcisi gümüş lekeli 2-D jel gösteren protein ayırma. Durağan faz de bütün-hücre protein ekstreleri (200 ug) bir% 15 SDS-PAGE jeli üzerinde kullanılmış ve ayrıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proteinlerin hazırlanması için bir yöntem ve iyi bir tekrarlanabilirlikle Burkholderia proteinlerin çoğunluğu elde olduğunu tarif edilmiştir. Bu, Şekil 1 'de gösterildiği gibi, LB veya YEM, çorba içinde yetişen aynı bakteri kültürü kullanarak farklı günlerde yapılan iki bağımsız preparatlar aynı protein profili elde edilmesi ile gösterilir. Ancak biz plakaları üzerinde büyüyen bakteriler için bu yöntemi test değil, ekstraksiyon, sıvı ortam içinde büyümüş bakteriler için etkili oldu. Bu yöntem aynı zamanda proteomik araçları kullanarak daha fazla protein karakterizasyonu için kullanılan; grubumuz başarıyla (iTRAQ) proteomik teknikleri 15,23,24 göreli ve mutlak kantitatif için 2-D jel elektroforezi ve izotop etiketleme kullanarak proteomdaki değişiklikleri okudu. İkincisi, proteinler iTRAQ deneyler 15 ile PMSF herhangi bir girişimi engellemek için, PBS içinde 0.5 M EDTA ihtiva eden bir tampon maddesi içine ekstre edildi.
Bu rem önemlidirProtein ekstre etme işlemi ve 2-D jel elektroforezi sırasında tüm adımlar 4 ° C'de ya da protein bozulmasını en aza indirmek için, hem de takılı ipuçları kullanımı ve nitril eldivenler giymeli ve tüm kapsayacak şekilde buz kullanılarak kepçeler soğuk koşullarda gerçekleştirilmelidir ki ark Herhangi noktalar keratin kirlenmesini önlemek için deri kütle spektrometresi tarafından sonradan belirlenmesi için biçilmiş kaftan. Protein ekstraksiyonu yaparken, bu nedenle PMSF aseton içinde 0.1 mM stok çözeltisi kullanımdan hemen önce yapılmalıdır, üreticiye göre, sulu çözeltiler içinde kısa bir yarı-ömür süresine sahip olduğunu dikkate almak da önemlidir. Bizim deney bunları test değil, ancak alternatif olarak, daha çözünür ve kararlı ve daha az toksik olan başka bir serin proteaz inhibitörü veya inhibitörleri kullanılabilir.
Bu prosedürde kullanılan liziz tamponu, sulu (sitosolik) proteinleri ve daha az çözünür prot iki çıkarmak için çözündürme için önemli olan, üre ihtiva etmezBazı membran proteinleri dahil olmak üzere, aralarında, 17,. Ancak, (bu protokolün adım 3) odaklama birinci boyuta izoelektrik için numune hazırlanması sırasında, örnekler, üre ihtiva rehidrasyon tamponu içerisinde yeniden süspanse edilir. Diğer proteomik teknikler de benzer bir muamele 26. içerir. Rehidrasyon adım takip önce, müdahale malzeme veya düşük molekül ağırlıklı kirliliklerin kaldırılması yüksek çözünürlük için çok önemli olduğunu görünüyor, biz sonuçları gelişmiş olarak her bir protein numunelerinde 2-D Clean-up Kit kullanmanızı öneririz. Bu noktada aseptik şekilde doğru boyutunu kesmek için sorunlu olduğu gibi, daha önce birinci boyut, izoelektrik odaklama ayırma örnekleri yüklemeden, (, kurutma kağıdı şerit sahiplerinin sağ boyutu hazırlanan şeritler var emin olun bu adımı 3.4 için protokolü).
2-B SDS-poliakrilamid jel elektroforezi çalıştırmadan önce, bu jel, bir yüzde 12 (ilgi beklenen boyutları uygun olduğundan emin olmak için gereklidir.5 Yüzdesi% jel) 14-100 kDa aralığında protein çözebilir. İkinci boyut jel elektroforez işlemi tamamlandıktan sonra, proteinlerin görselleştirme Coomassie mavi veya gümüş boyama ile elde edilebilir, ikinci boyama saptama sınırının daha duyarlıdır 0.1 ng / protein / nokta 20 kadar düşüktür. Gümüş lekeleme ile görselleştirilmiştir Protein noktalar kütle spektrometresi ile daha fazla analiz için uygundur. Ancak, bu ajan proteinleri ile çapraz bağlar beri gümüş leke çözüm glutaraldehyde içermemesi gerektiğini belirtmek önemlidir, bu nedenle daha fazla kütle spektrometresi analizi 20 ile uyumlu değildir. Seçenek olarak ise, farklı şekilde eksprese edilen proteinleri tespit etmek ve ölçmek için, bu tür yazılım ile birlikte otomatik Jel Elektroforezi (2B-DIGE) İki Boyutlu-Fark gibi başka bir jel bazlı yaklaşım kullanılabilir. Bu yaklaşım, farklı floresan etiketleri etiket örnekleri ve evrensel bir iç standart pr için kullanılır (örneğin Cy 3, 5 ve 2) istihdamior ikinci boyut elektroforez aşılması için, bir dereceye kadar, 2-D elektroforez 27 varyasyon ve uyarlığın dezavantajları. Ayrıca, jeller proteomik uygulamaları için tasarlanmış bir organometalik rutenyum selat leke SyproRuby ile ikinci boyut sonra lekeli olabilir. O gümüş boyama benzer duyarlılığı ile protein lekeleri tespit, ancak Kumazi mavisi daha fazla hassasiyet ile yapabilirsiniz. Boyama jeller lazer tarayıcı veya transilluminator 28 ile fotoğraflandı sonra.
Sonuç olarak, bu video bir bütün hücreli bakteriyel protein ekstre etme işlemi ve Burkholderia türlerde proteom küresel değişikliklerin çalışmaya izin, 2-D jel elektroforezi yöntemi tarif etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma (BV) British Columbia Üniversitesi'nden öğrencilik ve (DPS) Sağlık Araştırma Kistik Fibrozis Kanada ve Kanada Enstitüleri hibe tarafından desteklenmiştir. Biz protokollerin ilk hazırlık için Jacqueline Chung teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | Toxic, corrosive |
| Acetone | Fisher | A18-1 | Flammable |
| PBS Buffer | Bioscience | R028 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP118-500 | toxic |
| Glass beads (0.1 mm) | BioSpec Products | 11079101 | |
| Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) | VWR | 21009-342 | |
| MicroBCA protein extraction kit | Pierce | 23235 | |
| Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring | Fisher | 02-681-375 | |
| 2-D Clean-Up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| Urea | Invitrogen | 15505-050 | Irritant |
| CHAPS | Amersham Biosciences | 17-1314-01 | |
| Dithiothreitol (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 | Irritant |
| Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
| Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | Very toxic, carcinogen |
| Ammonium persulfate | Fisher | BP179-100 | Flammable, toxic, corrosive |
| N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | Flammable |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Acute toxicity, flammable |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| Ethanol | Fisher | HC1100-1GL | Flammable, toxic |
| Acetic acid | Fisher | A491-212 | Flammable, corrosive |
| Glutaraldehyde | Fisher | G151-1 | Very toxic, corrosive, dangerous for the environment |
| Potassium tetrathionate | Sigma | P2926 | Irritant |
| Sodium acetate | EM Science | 7510 | |
| Silver nitrate | Sigma | 209139 | Corrosive, dangerous for the environment |
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | Toxic |
| Sodium thiosulfate | Sigma | S7026 | |
| Tris Base | EMD | 9230 | |
| Glycine | MPBiomedical, LCC | 808831 | |
| Glycerol | MPBiomedical, LCC | 800688 | |
| Methanol | Fisher | A412-4 | Flammable, toxic, health hazard |
| Sodium carbonate anhydrous | EMD | SX0400-3 | Toxic |
| Mineral oil | ACROS | 415080010 | |
| Equipment | |||
| JA-20 ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | 3110BX | |
| Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
| Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |
References
- Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
- Suarez-Moreno, Z. R., et al. Common Features of Environmental and Potentially Beneficial Plant-Associated Burkholderia. Microb. Ecol. , (2011).
- Wiersinga, W. J., van der Poll, T., White, N. J., Day, N. P., Peacock, S. J. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei. Nat. Rev. Microbiol. 4, 272-282 (2006).
- White, N. J. Melioidosis. Lancet. 361, 1715-1722 (2003).
- Mahenthiralingam, E., Urban, T. A., Goldberg, J. B. The multifarious, multireplicon Burkholderia cepacia complex. Nat. Rev. Microbiol. 3, 144-156 (2005).
- Speert, D. P., Henry, D., Vandamme, P., Corey, M., Mahenthiralingam, E. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis. Canada. Emerg. Infect. Dis. 8, 181-187 (2002).
- Dance, D. A., Wuthiekanun, V., Chaowagul, W., White, N. J. The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment. J. Antimicrob. Chemother. 24, 295-309 (1989).
- Thibault, F. M., Hernandez, E., Vidal, D. R., Girardet, M., Cavallo, J. D. Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother. 54, 1134-1138 (2004).
- Govan, J. R. W., et al. Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis. Lancet. 342, 15-19 (1993).
- Thongboonkerd, V., et al. Altered proteome in Burkholderia pseudomallei rpoE operon knockout mutant: insights into mechanisms of rpoE operon in stress tolerance, survival, and virulence. J. Proteome. Res. 6, 1334-1341 (2007).
- Park, K. H., Lipuma, J. J., Lubman, D. M. Comparative proteomic analysis of B. cenocepacia using two-dimensional liquid separations coupled with mass spectrometry. Anal Chim. Acta. 592, 91-100 (2007).
- Wongtrakoongate, P., Mongkoldhumrongkul, N., Chaijan, S., Kamchonwongpaisan, S., Tungpradabkul, S. Comparative proteomic profiles and the potential markers between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Mol. Cell Probes. 21, 81-91 (2007).
- Harding, S. V., et al. The identification of surface proteins of Burkholderia pseudomallei. Vaccine. 25, 2664-2672 (2007).
- Madeira, A., Santos, P. M., Coutinho, C. P., Pinto-de-Oliveira, A., Sa-Correia, I. Quantitative proteomics (2-D DIGE) reveals molecular strategies employed by Burkholderia cenocepacia to adapt to the airways of cystic fibrosis patients under antimicrobial therapy. Proteomics. 11, 1313-1328 (2011).
- Zlosnik, J. E. A., Speert, D. P. The Role of Mucoidy in Virulence of Bacteria from the Burkholderia cepacia Complex: A Systematic Proteomic and Transcriptomic Analysis. J. Infect. Dis. 202, 770-781 (2010).
- Riedel, K., Carranza, P., Gehrig, P., Potthast, F., Eberl, L. Towards the proteome of Burkholderia cenocepacia H111: setting up a 2-DE reference map. Proteomics. 6, 207-216 (2006).
- Weiss, W., Gorg, A. Sample solublization buffers for two-dimensional electrophoresis. Methods Mol. Biol. 424, 35-42 (2008).
- von der Haar, T. Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts. PLoS One. 2, e1078 (2007).
- O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).
- Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags. J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).
- Velapatiño, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis. Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).
- Chung, J. W., Speert, D. P. Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host. Microbiology. 153, 206-214 (2007).
- Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. Public health assessment of potential biological terrorism agents. Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).
- Thon, J. N., et al. Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches. Transfusion. 48, 425-435 (2008).
- Wu, T. In New and Emerging Proteomic Techniques. Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).
- Lopez, M. F., et al. A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).
