Summary
Histologiska och biokemiska förändringar efter aneurysm endograft utslagning är fortfarande oklart. Vi beskriver en ny modell av endograft implantation på en mus aneurysm. Genom tromb analys med och utan ihållande cirkulerande blodet gränssnitt och nya endovaskulära biomaterial utvärdering, kommer denna modell bidrar till bättre förståelse endovaskulär pathobiology aneurysm utanförskap.
Abstract
Endovaskulär aneurysm utanförskap är en validerad metod för att förhindra aneurysm brister. Långsiktiga resultat markerar teknik begränsningar och nya aspekter av bukaortaaneurysm (AAA) patofysiologi. Det finns ingen bukaortaaneurysm endograft uteslutning modell billig och reproducerbar, vilket skulle möjliggöra djupa undersökningar av AAA före och efter behandling. Vi beskriver härmed hur att framkalla, och sedan för att utesluta med en täckt koronar stentgraft ett bukaortaaneurysm hos en råtta. Den välkända elastas inducerad AAA modell rapporterades första gången 1990 1 i en råtta, sedan beskrivs i möss 2. Elastin nedbrytning leder till utvidgning av aorta med inflammatorisk infiltration av bukväggen och intra luminal tromb, matchning med humant AAA. Endovaskulär utanförskap med små täckt stentgraft utförs därefter, exklusive eventuella interaktioner mellan cirkulerande blod och blodproppar aneurysm. Lämplig utslagning och stentgraft öppenhet ärbekräftas innan eutanasi med en angiografi trodde den vänstra halspulsådern. Partiell kontroll av elastas diffusion gör aneurysm form olika för varje djur. Det är svårt att skapa en aneurysm, vilket kommer att möjliggöra en lämplig längd av aorta nedanför aneurysmet för en enkel stentgraft introduktion, och med adekvat proximal och distal hals för att förhindra endoleaks. Massor av misslyckande kan leda till stentgraft inledning som ibland leder till aorta tår med smärta och problem att sy den, och endotelskada med post op aorta trombos. Att ge acetylsalicylsyra till råttor innan stentgraft implantation minskar felfrekvensen utan större blödning. Fastspänning tid aktiverar neutrofiler, endotel och trombocyter, och kan störa den biologiska analysen.
Introduction
Endovaskulära kompetens har utvecklats sedan den första endovaskulär aorta aneurysm reparation (EVAR) av Parodi 1991 3, nästan hälften av alla buken aneurysm behandlas nu av EVAR 4. Till skillnad från operation, lämnar EVAR tromben, exklusive den från systemiska blodomloppet. Aneurysm kännetecknas av ett hemoglobinvärde rik flera lager tromb, ett tunt material, och en fibrospåverkade och inflammerad adventitia. Den avgörande roll för proteolys 5 i aneurysm progression har visats trettio år sedan 6, 7: aneurysmsäcken tromb är associerad med en tunn aortaväggen, lys av elastin, låg täthet av glatta muskelceller i media, och en hög nivå av immuno -inflammatorisk adventitial reaktion 8,9. Dessa förändringar tyder på att proteolytisk enzymatisk aktivitet inträffar inom tromben, snarare än direkt i aortaväggen.
Dessutom är den luminala skiktet i tromben rik på agglutinerade röda blod ceLLS släpper hemoglobin. De är främst involverade i fibrinbildning, blodplättsaktivering och inducerar trombin bildas. Slutligen inducerar tromb även t-PA och plasminogen retention, som är involverade i fibrinolys och rekrytera leukocyter, huvudsakligen neutrofiler. Det är 12 gånger viktigare i tromben än i blodet 10. Deras närvaro är associerad med en hög frekvens av matrismetalloproteinas typ 8 (MMP-8), MMP-9 och elastas: de frisätter granulära serinproteaser och pro oxidativa medel som leder till nedbrytning av den fibrillära matris, och i slutändan aortaväggen bristning 9,11 -13.
Valfri aneurysm interventioner syftar till att förhindra brott. EVAR lämnar både aneurysm vägg och tromb intakt. Således är aneurysm perfusion genom aortic säkerheter (lumbar artärer, underlägsen mesenterica ...), som heter endoläckage, och är en specifik komplikation vid endovaskulär behandling 14,15, ibland leder till bristning eveN med lågtryck endoleaks. Dessutom, i vissa patienter, finns det ingen ökning av aneurysm diameter 16. Interaktion mellan cirkulerande blod och aneurysmal vägg upprätthåller nämnda intra luminal tromb biologisk aktivitet. Därför, typ V endoleaks, definierad som expansion av aneurysmsäcken utan identifierad endoläckage kan förklaras genom enzymatisk aktivitet inuti aneurysm tromben.
Varken radiologiska imaging (18FDG-PET-undersökning, blodplättsaktivering scintigrafi, järn oxyde kontrast MRI17) eller perifert blod provtagning (MMP-9, trombocytrelaterad mikropartiklar, plasmin / anti-plasmin komplex) som används för att undersöka det endovaskulära inverkan på aortaaneurysm hos människor direkt utvärdera biokemiska vägar.
I vår kunskap, finns det inte någon reproducerbara och billig experimentella aneurysm utslagning djurmodeller. Detta gör före och efter aneurysm utslagning biologiska och histologiska förändringar som ska utforskas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Metoder
Protokollet har godkänts av den Bichat-Debré etik kommitté (N ° 2012-15/698-0074).
Den elastas perfusion modellen har först beskrivits av Anidjar 1990 1: bukaortaaneurysm induceras av elastas perfusion i Wistar råttor, i åldern 8 till 9 veckor, 250-300 g. Två till fyra veckor senare, är en re-laparotomi utförs, och en 3 mm diameter täckt koronar stentgraft används för att utesluta aneurysm. Transplantatet, införd genom en distal aortotomy, distribueras i förstorad vision. Två veckor senare, är stentgraft öppenhet bekräftas med en aortography från vänster gemensamma halspulsådern före avlivning. Hela stented aorta och omgivande vävnader skördas sedan och konditioneras för analys.
Protokoll
Ett. Steg 1: abdominellt aortaaneurysm Induktion (Dag 0)
- Söva djuret med isofluran och prestandam en intraperitoneal penthobarbital injektion. 0,1 ml/100 g penthobarbitol späds i 0,1 ml saline/100 g djurvikt. Anestesi är tillräcklig för förfarandet.
- Raka buken, och rengör huden med alkohol.
- Gör Xypho blygd hud snitt med en kniv. Abdominal muskler skikt då bukhinnan, undvika inre organ, är öppna med en sax. Placera spridare och linda tarmarna i en våt kompress på den vänstra sidan av djuret.
- Öppna den bakre bukhinnan direkt ovanför aorta, utan att riva sönder det. Målet är att förhindra framtida tarm sammanväxningar av ekonomisk dissektion.
- Ligera samtliga säkerheter från den vänstra njurvenen till höftbifurkationen med endast en ligatur, till grund för stora kroppspulsådern. Om aortan har fastnat tarmarna eller vena cava, det finns en hög risk för blödning under andra insatser, det är ofta dödlig för råttan.
- Passera en 4-0 silke två varv runt aortan, 15 mm under LEFt njurvenen. Det är viktigt att helt dissekera aorta, ca. 15 mm under den vänstra njurvenen och precis proximalt till höftbifurkationen att tillåta införande av de Gilbert approximeringsanordning klämmor.
- Efter uppspänning aortan proximalt strax under den vänstra njurvenen, och distalt strax ovanför höftbifurkationen, ta bort adventitia, och utför en liten aortotomy så proximalt som möjligt till den distala klämman. Aorta måste noggrant spolas med koksaltlösning och en vinklad kanyl och alla kvarvarande blod tvättas för att undvika koagulera embolisering när declamping.
- Införa värme-avsmalnande polyeten slang (PE 10) jämnt inuti aortan, och passera 4-0 silke runt aortan (vid steg 1.6) och binda upp för att säkra röret och undvika påtryckningar utvisning.
- Injicera elastas in en 10 till 13 mm längd aorta (från den proximala klämman till silke).
- Infundera 725 ul av elastaset lösningen är d vid konstant hastighet-hastighet i 30 min. Det är viktigt att noggrant survey injektionen: vid infusion, bör aortan expandera med 140-150% av sin normala diameter.
- Vid slutet av infusionen, ta bort katetern, spola elastaset med koksaltlösning, klippa silke och stäng aortotomy med ca 3 maskor 10-0 Prolene. Avlägsna klämmorna: distal sedan proximal. Försiktighet måste vidtas för att undvika trans-aorta sutur. Med några få praktik och med tanke på lilla längd aortotomy är aorta trombos extremt sällsynt.
- Stäng bukväggen med en kontinuerlig resorberbara suturer och huden med avbrutna icke absorberbara suturer. Injicera en 5 mg / kg dos av Karprofen subkutant att förebygga smärta. Återgå råttorna till sin bur och ge den standard råtta laboratoriet chow och vatten ad libidum.
2. Steg 2: bukaortaaneurysm Uteslutning med en Coronary PTFE Täckt (polytetrafluoreten) stentgraft (Dag 15-30)
- Före operationen, späd Aspirin 1,000 mg i 1 liter vatten. Daglig water intag uppskattades av 10-12 ml/100 g / kroppsvikt per dag.
- Efter anestesi såsom beskrivits tidigare, utför en re-laparotomi, nogsamt undvika potentiella inre organ vidhäftande vid bukväggen. Aneurysm definierades av en ökning på 50% åtminstone av aorta jämfört med proximal aorta diameter mäts under direkt vision. Baserat på vår erfarenhet, är framgång 90%, inklusive tidiga dödsfall, främst på grund av aorta sprack (opublicerade data)
- Dissekera aortan vid aortabifurkationen och även vid den proximala halsen. Den aneurysm skulle uppstå sig några millimeter under den vänstra njurvenen, vilket gör att en tillfredsställande längd mellan den distala halsen och den distala klämman att föra in katetern, och suturera aorta.
Stentgraft längd beror på aneurysm storlek. Både proximala och distala halsar bör omfattas av minst 2 millimeter. - Vira en dubbel loop silke runt proximala halsen. Kläm proximala aorta ovanför aneurysm och BElow den vänstra njurartären, och distalt ovanför aortabifurkationen.
- Gör en stor aortotomy strax ovanför den tidigare aortotomy att undvika att riva aortaväggen vid införandet av stentgraft. Skölj inte aortan för att bevara integriteten i tromben. Tryck stentgraft mot den proximala klämman. Ta bort klämman är och styra spänningen i silke att tillåta transplantat progression. Anpassa spänning kring det levererande katetern för att medge stentgraft progression tills den proximala kanten av stentgraft når den proximala halsen, men även detta kommer att förhindra massiv blödning efter proximala klämman borttagning. Ballongen och den proximala änden av den levererande katetern kan täcka de renal artärerna, men inte stentgraft som måste sättas under njurartärerna.
- Distribuera stentgraft under direkt visuell kontroll med hjälp av en tryckpump spruta vid 8 atm tryck. Tömma ballongen och samtidigt dra åt siden och ta bort ballongen axeln.
- Tvätta stentgraft med saltlösning. Placera en klämma strax under den distala delen av aneurysmen, och nära aorta med avbrutna 10-0 Prolene suturer.
- Stäng såret, injicera carprofen subkutant och låta djuren återvända till sin bur. Ge den standard laboratorie chow och vatten ad libidum.
Tre. Steg 3: Kontroll av stentgraft Patency (Dag 30)
15 dagar efter stentgraft insättning, utföra en arteriografi att styra transplantat öppenhet
- Efter anestesi, utför ett tvärgående vinklad till armbågen snitt. Den vänstra gemensamma halspulsådern sitter under submandibulära och sublinguala körtlar och under sternocleidomastoideus musklerna. 2 cm längd exponering rekommenderas.
- Ligera artären distalt med en siden 4-0. Efter proximal fastspänning, infoga en 18G kateter retrogradely och säkra med en siden 4-0 passera två gånger runt halspulsådern och bundna. En tillräcklig längd tillåter insättning och säkra katetern varadärför proximal klämma avlägsnas. Om det är svårt att exponera 2cm av artär, röret, fastklämd efter fyllda med koksaltlösning kan skjutas proximalt samtidigt bort den proximala klämman.
- Injicera kontrasten genom katetern under direkt genomlysning. Utför en stentgraft angiographic kontroll både bekräftar frånvaron av endoläckage vilket kan resultera i en olämplig användning av stentgraft, och bekräfta stentgraft öppenhet. Detta steg är viktigt eftersom det höga antalet säkerheter fartyg tillåter tillräcklig ben perfusion även med en thrombosed stentgraft. Vi försökte inte att utföra Duplex ultraljud: Vi postulerar att stentgraft stålkonstruktion förhindrar korrekt bedömning av stentgraft öppenhet och endoläckage.
- Offra råttan genom avblodning enligt rekommendationerna 18, och aneurysm, är stentgraft, blodpropp och aortaväggen skördades för histologisk eller biokemiska studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aneurysm är fast i ett paraformaldehyd 4% lösning under 24 timmar, sedan in i en fosfatbuffrad saltlösning tills fixering i en harts block. Vi använder en HPS (Hematoxylin Phloxin Safran) (Figur 1) färgning, visar helande proliferativa celler runt PTFE (Figur 2). Mesenkymala celler karakteriseras sedan genom α-aktin-färgning (figur 3).
Figur 1. HPS färgning av aneurysm efter uteslutning av en 3 mm täckt diameter stentgraft.
Figur 2. Zooma in på Figur 1 visar en läkningsprocess.
d/50740/50740fig3.jpg "alt =" Bild 3 "fo: src =" / files/ftp_upload/50740/50740fig3highres.jpg "fo: innehåll-width =" 4.5in "/>
Figur 3. Histologisk karakterisering av läkningsprocessen. Mesenkymceller är brunfärgat av α-aktin-färgning. PTFE avgränsas av den röda linjen A:.. X40, B: x20
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Två modeller av AAA har redan beskrivits i vårt labb: xenotransplantatet 19 och elastas inducerade modeller 1 Elastase modell är den mest liknar människans aortaaneurysm:. En stor perifer intraluminalt tromb därefter uteslutas genom endovaskulär aneurysm reparation.
Endoläckage är en vanlig komplikation av EVAR 14,15. Massor av frågor kvarstår olösta: AAA ruptur har beskrivits med låga endoleaks, och ibland utan aneurysmsäcken utvidgningen 16. Endoläckage är en mycket vanlig komplikation efter EVAR, upprätthålla ett gränssnitt mellan cirkulerande blodkroppar och blodproppar aneurysm. Typ V endoleaks, som också heter endotension, kan inte bara förklara aneurysm tillväxt av sig själva 20. Enzymatisk aktivitet kan vara en del av denna komplikation. Animal experimenterande, med täckt och otäckt stentgraft: Att upprätthålla ett gränssnitt mellan tromb och cirkulerande blod, är nödvändigt att belysa pathobiolnik för dessa komplikationer.
Egentligen har endast omfattas stentgrafter satts in på vår modell. Många sätt att forskningen planeras att undersökas: implantera icke täckta endografts, testa material flöde divertion, berika tromben aktiviteten av Porphyromonas gingivalis injektioner 21. Denna modell av endovaskulär utestänga ett aortaaneurysm är den första beskrivs i litteraturen i litet djur. Vi anser att det är till stor hjälp för en bättre förståelse av uteslutna aneurysm ombyggnad 22. Aneurysm stentgraft undantag har finnas redan publicerat på större djur, men med en lägre reproducerbarhet, svårt att inse, och tidskrävande 4,5. Råtta elastas aneurysm modell är billigt och möjligt med några praxis och med en låg dödlighet 23.
Den största begränsningen av denna modell var den höga frekvensen av kärlocklusion. Den stentgraft, eller aorta lätt thrombose, på grund av possible intima skador under stentgraft insättning och blodproppar inuti stentgraft efter utplaceringen. Tvättning noggrant stentgraft är verkligen viktigt innan sömnad aortan. Förebyggande oral aspirin administration, började 5 dagar innan den andra operationen till slutet av protokollet minskade signifikant trombos takt, utan att påtagligt per och postoperativa blödningar.
Fastspänning inducerad blod Stasė aktiverar blodplättar, aktivatorer endotel och neutrofiler 24. Efter 30 minuter 25, neutrofiler och monocyter är redan aktiverade, krypa och bindning till det normala endotelet, vilket i sin tur orsakar skador på endotelet. För en erfaren operatör, totalt fastspänning längd varierar mellan 15 och 20 min. Vi inte undersöka konsekvenserna av ischemi på blodpropp. Det är dock omöjligt att distribuera stentgraft utan aorta fastspänning. Neutrofiler och trombocyter aktivering inducerar systemiska förändringar, men kort tid musslaping begränsad, och tyvärr omöjligt att förhindra. Ändå tror vi dessa ändringar har en begränsad påverkan på biologisk analys. Med tanke på alla modeller och deras begränsningar 26, 27, är detta en av de första att öppna djur experimenterande efter AAA utslagning genom stentgrafter.
Färska studier visar en betydande andel aneurysm tillväxt efter endovaskulär reparation hos människor 28. En noggrann analys av de olika stadierna av blodproppar dementi, valideringar hypotes och endograft material utvärdering kan utföras på denna modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Jag har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Christine Guesdon (Abbott) för de gåvor av stentgrafter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Wistar rats | aged from 8 to 9 weeks. Weight range from 350 to 400 g | ||
| Instruments | |||
| Isoflurane anesthesic system | 4,5% at the beginning, then 2% | ||
| Penthobarbital | Ceva sante animale, Libourne, France | ||
| Dissection stereomicroscope | |||
| Steriles gloves | |||
| Microsurgical Steriles instruments | Moria, Antony, France | Needle holder, Forceps, Scissors,Gilbert approximator o 3 Micro clamps | |
| N °40 Silk string | |||
| Prolen 9-0 and 10-0 | Ethicon, Johnson Johnson, Auneau, France | ||
| Heat-tapered polyethylene tubing | PE 10 | ||
| Syringe infusion pump | |||
| Porcine pancreatic elastase | Sigma, St. Louis, Mo., USA | 550 μl of salin is mixed with 175 μl of elastase | |
| Indeflator | |||
| 9 to 16 mm length, 3 mm diameter coronary PTFE covered stentgraft | Abbott, Abbott Park, Illinois, USA | ||
| C-Arm –C 9800 | GE Medical Systems, Milwaukee, WI | ||
| Aspegic 1000 mg | Aspirin, Sanofi-Aventis, Paris, France | ||
| Reagent | |||
| Aerane isoflurane 100ML | Baxter | Aerane | |
| Penthobarbital | Centravet | 053pen203 | |
| Silk Suture 4-0 | Fine Science | 18020-40 | |
| Microsurgical steriles instruments | Moria | 9980-9983-9987-204/A-204/D-8148-4877A-4878A | |
| Prolen 9-0 and 10-0 | Ethicon | W2829 – NS2850 | |
| Heat tapered Polyethylene tubing : PE 10 | Bioseb | MRE-010 | |
| Infusion pump | World precision instrument | AL-1000 | |
| Porcine pancreatic elastase | Sigma | E1250-100MG | |
| Indeflator | Longreal | KY025 25 100 | |
| Aspegic 1000mg (Aspirin) | Sanofi-Aventis | 3400931898191 | |
| C-Arm –C 9800 | General electric. | OEC 9800 | |
| Stentgraft : Jostent | Abbott | 210CG1230 210CG1630 |
|
References
- Anidjar, S., et al.
- Azuma, J., Asagami, T., Dalman, R., Tsao, P. S. Creation of murine experimental abdominal aortic aneurysms with elastase. J. Vis. Exp. (29), e1280 (2009).
- Parodi, J. C., Palmaz, J. C., Barone, H. D. Transfemoral intraluminal graft implantation for abdominal aortic aneurysms. Ann. Vasc. Surg. 5, 491-499 (1991).
- The Vascular Society of Great Britain and Ireland. The nationalvascular database report, 2009. Lees, T., Stansby, G. , (2012).
- Sakalihasan, N., Limet, R., Defawe, O. D.
- Busuttil, R. W., Abou-Zamzam, A. M., Machleder, H. I. Collagenase activity of the human aorta. A comparison of patients with and without abdominal aortic aneurysms. Arch. Surg. 115, 1373-1378 (1980).
- Michel, J. B. Contrasting outcomes of atheroma evolution: intimal accumulation versus medial destruction. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 21, 1389-1392 (2001).
- Vorp, D. A., et al. Association of intraluminal thrombus in abdominal aortic aneurysm with local hypoxia and wall weakening. J. Vasc. Surg. 34, 291-299 (2001).
- Kazi, M., et al. Influence of intraluminal thrombus on structural and cellular composition of abdominal aortic aneurysm wall. J. Vasc. Surg. 38, 1283-1292 (2003).
- Kuijper, P. H., et al. Neutrophil adhesion to fibrinogen and fibrin under flow conditions is diminished by activation and L-selectin shedding. Blood. 89, 2131-2138 (1997).
- Touat, Z., et al. Renewal of mural thrombus releases plasma markers and is involved in aortic abdominal aneurysm evolution. Am. J. Pathol. 168, 1022-1030 (2006).
- Fontaine, V., et al. Role of leukocyte elastase in preventing cellular re-colonization of the mural thrombus. Am. J. Pathol. 164, 2077-2087 (2004).
- Sakalihasan, N., Delvenne, P., Nusgens, B. V., Limet, R., Lapiere, C. M. Activated forms of MMP2 and MMP9 in abdominal aortic aneurysms. J. Vasc. Surg. 24, 127-133 (1996).
- Alsac, J. M., et al. The significance of endoleaks in thoracic endovascular aneurysm repair. Ann. Vasc. Surg. 25, 345-351 (2011).
- Buth, J., Harris, P. L., van Marrewijk, C., Fransen, G. The significance and management of different types of endoleaks. Semin. Vasc. Surg. 16, 95-102 (2003).
- Fransen, G. A., et al. Rupture of infra-renal aortic aneurysm after endovascular repair: a series from EUROSTAR registry. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 26, 487-493 (2003).
- van der Vaart, M. G., et al. Application of PET/SPECT imaging in vascular disease. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 35, 507-513 (2008).
- Close, B., et al. Recommendations for euthanasia of experimental animals: Part 2. DGXT of the European Commission. Lab. Anim. 31, 1-32 (1997).
- Allaire, E., Guettier, C., Bruneval, P., Plissonnier, D., Michel, J. B. Cell-free arterial grafts: morphologic characteristics of aortic isografts, allografts, and xenografts in rats. J. Vasc. Surg. 19, 446-456 (1994).
- Gawenda, M., Jaschke, G., Winter, S., Wassmer, G., Brunkwall, J. Endotension as a result of pressure transmission through the graft following endovascular aneurysm repair--an in vitro study. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 26, 501-505 (2003).
- Delbosc, S., et al. Porphyromonas gingivalis Participates in Pathogenesis of Human Abdominal Aortic Aneurysm by Neutrophil Activation. Proof of Concept in Rats. PLoS One. 6, e18679 (2011).
- Trollope, A., Moxon, J. V., Moran, C. S., Golledge, J. Animal models of abdominal aortic aneurysm and their role in furthering management of human disease. Cardiovasc Pathol. 20, 114-123 (2011).
- Yamaguchi, T., et al. Factors influencing mortality in the rat elastase-induced-aneurysm model. J. Surg. Res. 94, 81-83 (2000).
- von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J. Exp. Med. 209, 819-835 (2012).
- Smith, P. D. Neutrophil activation and mediators of inflammation in chronic venous insufficiency. J. Vasc. Res. 36, Suppl 1. 24-36 (1999).
- Zaragoza, C., et al.
- Kuivaniemi, H., Elmore, J. R. Opportunities in abdominal aortic aneurysm research: epidemiology, genetics, and pathophysiology. Ann. Vasc. Surg. 26 (12), 862-870 (2012).
- Schanzer, A., et al. Predictors of abdominal aortic aneurysm sac enlargement after endovascular repair. Circulation. 123, 2848-2855 (2011).
