De embryonala epidermis av mycket sent stadium Drosophila embryon ger en in vivo-system för snabb analys sår svar och kan kombineras med genetiska manipulationer eller kemiska mikroinjektion behandlingar för att främja studier i sårläkning för översättning till däggdjursmodeller.
Drosophila embryo utvecklar en robust epidermal lagret som fungerar både för att skydda de inre cellerna från en hård yttre miljön samt för att upprätthålla cellulär homeostas. Punktering skada med glas nålar ger en direkt metod för att utlösa en snabb epidermal lindad respons som aktiverar lindade transkription reportrar, som kan visualiseras genom en lokaliserad rapportörsignalen i levande embryon eller larver. Punktering eller laserskada ger också signaler som främjar rekryteringen av hemocyter till sårområdet. Överraskande, svår (rakt igenom) punktering skada i embryon sent skede stör sällan normal embryonal utveckling, eftersom mer än 90% av dessa sårade embryon överlever till vuxen ålder när embryon injiceras i ett oljemedium som minimerar omedelbar läckage av hemolymfa från punktionsställen . Såret Förfarandet kräver mikromanipulation av Drosophila embryon, inklusive manuell anpassning av embryona på agar tallrikar och överföring av de inriktade embryon till objektglas. Drosophila epidermal sår svarsanalysen ger ett snabbt system för att testa de genetiska kraven för en mängd olika biologiska funktioner som främjar sårläkning, samt ett sätt att screena för potentiella kemiska föreningar som främjar sårläkning. Den korta livscykel och enkel odling rutin gör Drosophila en kraftfull modell organism. Drosophila ren sårläkning verkar samordna epidermal regenerativ respons, med det medfödda immunsvaret, på ett sätt som fortfarande är under utredning, vilket ger ett utmärkt system för att hitta bevarade regelverk mekanismer som är gemensamma för Drosophila och däggdjur epidermal såra.
Manipulering av Drosophila embryon med hjälp av en mikroinjektion teknik är en väletablerad analys 1. Betydelsen av den epidermala sår svars reporter metod är att kombinera protokollet för punktering / mikroinjektion med fluorescerande reportrar och visualisera en in vivo-svar på epidermal skada i Drosophila embryon. Målet med denna metod är att göra det möjligt för en bredare uppsättning av forskare för att använda Drosophila som ett verktyg för att undersöka de processer som reglerar transkriptions svar på epidermal punktering skada. De enkla lager epidermis i Drosophila ger ett enkelt system för att studera en epidermal sår svar efter en punktering skada 2. Den Drosophila embryot är en robust modell för att undersöka genetiska skillnader mellan de olika stadierna i sårläkning, inklusive sår svar, inflammation, och reepithelialization 3. Detta beror delvis på att många eller de flesta zygotiska mutanter överleva till slutet av embryogenesär och utveckla epidermala hinder även när utvecklings mönstring går djupt snett. Föregående karakterisering av en väl bevarad transkriptionsfaktor Kornig huvud (GRH), identifierat att GRH-mål gener dopadekarboxylas (DDC) och tyrosin hydroxylas (PLE) är transkriptionellt aktiverade runt platserna för skada 4. Drosophila som modellorganism för sår svar ger en kompletterande linje av utredning till för studier i däggdjur sårläkning 5. Senare studier har identifierat ytterligare Drosophila sår-inducerade gener och utvecklat en "verktygslåda" av många fluorescerande sår reportrar att övervaka in vivo epidermal sår svar att rengöra såra 6. Nya rapporter om regleringen av Drosophila sårläkning har fokuserat på såret stängning fenotyp, vilket gör upptäckten av många signalvägar som reglerar cellmigration 7,8. Med analysen ifluorescerande sår reportrar har våra studier identifierat en ny uppsättning av gener som krävs för det lokala uttrycket av epidermala sår-inducerbara gener 9. En av fördelarna med såret svars reporter metod är att resultaten ger mer insikt i en mekanism för hur signaler omvandlade från skadeplatsen till granncellerna. Dock är en av nackdelarna med såret svars reporter metod att resultaten inte direkt länka till fenotyper i sårläkning eller reparation. Bredare användning av rent såret punktering protokoll i genetiska och kemiska sidor kommer nya regulatorer av transkriptions svar på epidermal såra att identifieras och vidare översättningen av sårläknings upptäckter i däggdjursmodeller skadebehandlingar.
En omedelbar transkriptionsreglerande svar på yttre signaler tillåter celler att samordna ett lokaliserat svar på extracellulära stimuli, som kan inkludera stress, skada eller infektion. Felaktig styrning av en lokal reaktion kan ha skadliga effekter på angränsande celler, såväl som ett slöseri med resurser att reparera skadan. The Drosophila embryo ger ett utmärkt system för att utföra grundläggande sårläknings experiment på ett billigt och enkelt att underhålla modellorganism. Potentialen för samarbeten mellan forskning i andra modellorganismer och Drosophila ger en unik möjlighet att utforska många biologiska frågor.
En ytterligare teknik för de lindade reportrar är den genetiska kombination av mutanta bakgrunder, att tillhandahålla en effektiv metod för att testa bidraget av nya gener till aktiveringen av den epidermala sår svarsvägen. Vi har epidermala sår-inducerad transkriptions reportrar AV-AILABLE på både 2: a och 3: e kromosomer 5. I denna studie använder vi UAS och GAL4 system överuttryck 16. För studier med dödliga muterade alleler vi bestämma den genetiska bakgrunden med hjälp av en fluorescerande balanse kromosom, t.ex. Kruppel-GFP 17. Vi har analyserat såret reportern lokalisering i flera genetiska bakgrund (tabell 1).
En eventuell ändring av tekniken är att kombinera mikroinjektion och såra. Mikroinjektion kan användas för att införa en kemisk lösning i embryot. Flera kemiska föreningar har testats och befanns att reglera aktiviteten hos de epidermal lindade reportrar 9. Denna metod för samtidig sårskada och mikroinjektion kan vara användbart för att öka antalet celler i Drosophila embryo som reagerar ett sår signal och kan direkt användas för att övervaka genuttryck förändringar efter sårbildning 18. En framtida tillämpning av mikroinjektion tekniken är att testa nya kemikalier för reglering av epidermal såret svar.
Drosophila som modellsystem för genetiska studier erbjuder ett brett utbud av enkla protokoll för att effektivt ta itu med komplexa frågor. Nya rapporter om genomförbarheten av Drosophila tekniker belyser användningen av hemocyte migration 19 och parasit geting infektion 20 som ett sätt att ytterligare bredda effekterna av Drosophila forskarsamhället. Förutom sårläkning studier, Drosophila ger en klassisk modell för regenerering med den imaginal skivsystemet 21,22. De kombinerade framsteg inom imaginal skiva regenereringsstudier och punktering / mikroinjektion såra ger ett utmärkt system för att upptäcka väl bevarade komponenter i vävnad reparera.
The authors have nothing to disclose.
Detta protokoll har utvecklats i samarbete med tidigare medlemmar av McGinnis Lab, Kim A. Mace och Joseph C. Pearson. Vi tackar de fortsatta ansträngningar från Bloomington Drosophila Lager Center för sitt arbete för att organisera och fördela värdefulla bestånd. Detta arbete stöddes av finansiering från National Institutes of Health (R01 GM077197 och K12 GM68524) och familjen Herbert Stern. MTJ stöds för närvarande av Grant Number 5G12RR003060-26 från National Center for Research Resources och Grant Number 8G12MD7603-27 från National Institute on Minoritet Hälsa och skillnader i hälsa. Innehållet är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institute on Minority Hälsa och skillnader i hälsa och National Institutes of Health.
yeast | Sigma Aldrich | 51475 | |
apple juice | Generic | ||
agar | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
bleach | Generic | ||
halocarbon oil, 700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
halocarbon oil, 27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
1-phenoxy-2-propanol | Sigma Aldrich | 484423 | |
hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H324 | |
methyl-β-cyclodextrin | Sigma Aldrich | C4555 | |
toluidine blue | Sigma Aldrich | 89640 | |
formaldehyde, 16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | toxic chemical |
heptane | Fisher Scientific | H360-1 | toxic chemical |
methanol | Fisher Scientific | A412-1 | toxic chemical |
10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
RNase free H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
Drosophila incubator | Genessee Scientific | 59-197 | |
fly cage | Genessee Scientific | 59-100 | |
embryo collection tube | Genessee Scientific | 46-101 | |
plastic Petri dish | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
double-stick tape | Generic | ||
paintbrush | Generic | ||
dissection needle | Fisher Scientific | 08-965A | sharp object |
glass cover slip | Thermo Scientific | 3306 | sharp object |
microscope slide | Thermo Scientific | 4445 | sharp object |
dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
capillary needle | FHC | 30-30-1 | sharp object |
needle puller | Narishige | PC10 | |
microinjection needle holder | Narishige | MINJ4 | |
micromanipulator | Narishige | MN151 | |
inverted microscope | Carl Zeiss | Primo-Vert | |
glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | sharp object |
glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 22-063-172 | sharp object |
transfer bulb | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | sharp object |
orbital shaker | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
laser scanning confocal | Leica | SP2 | |
fixation solution | (5 ml) | ||
16% formaldehyde | 2.5 ml | toxic chemical | |
10x PBS | 0.5 ml | ||
0.5 M EGTA | 0.5 ml | ||
RNase free H2O | 1.5 ml | ||
Halocarbon oil mix | (10 ml) | ||
halocarbon oil, 700 W | 5 ml | ||
halocarbon oil, 27 W | 5 ml |