Summary
De embryonale epidermis zeer laat stadium Drosophila embryo's verschaft een in vivo systeem voor snelle steekwond respons-analyse en kunnen worden gecombineerd met genetische manipulatie of chemische behandelingen microinjectie studies gaan in wondgenezing voor de vertaling in zoogdierlijke modellen.
Abstract
De Drosophila embryo ontwikkelt een robuuste epidermale laag die dient zowel de interne cellen tegen een harde externe omgeving alsook cellulaire homeostase. Punctie letsel met glasnaalden een directe methode om een snelle reactie epidermale wond die wond transcriptionele reporters, die kan worden gevisualiseerd door een gelokaliseerde reporter signaal in levende embryo's of larven activeert activeren. Punctie of laser letsel geeft ook signalen dat de aanwerving van hemocytes bevorderen om de wond. Verrassend, ernstige (door en door) punctie letsel in een vergevorderd stadium embryo's slechts zelden verstoort de normale embryonale ontwikkeling, als meer dan 90% van deze gewonden embryo's overleven naar volwassenheid wanneer embryo's worden geïnjecteerd in een olie medium dat onmiddellijke lekkage van hemolymph op de injectieplaats minimaliseert . De wond procedure vereist micromanipulatie van de Drosophila embryo's, waaronder handmatige uitlijning van de embryo's op agar platen en de overdracht van de uitgelijnde embryo's om dia microscoop. De Drosophila epidermale wond respons assay biedt een snelle systeem om de genetische eisen van diverse biologische functies wondgenezing, evenals een manier om te screenen op potentiële chemische verbindingen die wondheling bevorderen bevorderen testen. De korte levenscyclus en gemakkelijk kweken routine Drosophila een krachtige modelorganisme. Drosophila schoon wondgenezing blijkt de epidermale regeneratieve respons te coördineren, met de aangeboren immuunrespons, op een manier die nog in onderzoek zijn, die een uitstekend systeem om geconserveerde regelgevende vinden biedt mechanismen gemeen Drosophila en zoogdieren epidermale verwonden.
Introduction
Manipulatie van Drosophila embryo's met behulp van een micro-injectie techniek is een gevestigde assay 1. De betekenis van de epidermale wond reporter respons methode is het protocol doorboren / micro-injectie gecombineerd met fluorescerende reporters en een in vivo reactie op epidermale schade in Drosophila embryo zichtbaar. Het doel van deze methode is om een bredere reeks van wetenschappers in staat te stellen Drosophila gebruiken als een instrument om de processen die de transcriptionele respons op epidermale punctie letsel reguleren onderzoeken. De single-gelaagde epidermis in Drosophila biedt een eenvoudig systeem om een epidermale wond reactie studeren na een lekke blessure 2. Het Drosophila embryo een robuust modelsysteem genetisch ontleden stadia van wondheling, zoals wond reactie, ontsteking en reepithelialization 3. Dit komt deels omdat veel of de meeste zygotische mutanten te overleven tot het einde van embryogenesis en ontwikkelen epidermale barrières zelfs wanneer ontwikkelingsstoornissen patronen gaat diep mis. Vorige karakterisering van een goed geconserveerd transcriptiefactor korrelige hoofd (Grh), geïdentificeerd die Grh-target genen Dopa decarboxylase (DDC)-en tyrosine hydroxylase (ple) transcriptioneel geactiveerd rond de sites van de schade 4. Drosophila als modelorganisme voor wond reactie voorziet in een extra lijn van onderzoek naar studies gaan in zoogdieren wondgenezing 5. Latere studies hebben extra Drosophila-wond geïnduceerde genen geïdentificeerd en ontwikkelde een "toolkit" van vele TL wond verslaggevers te zien op de in vivo epidermale wond reactie te reinigen verwonden 6. Recente rapporten over de regulering van Drosophila wondgenezing hebben zich gericht op het dichten van wonden in fenotype, waardoor ontdekking van de vele paden reguleren cel migratie 7,8. Met de analyse van defluorescerende wond verslaggevers, hebben onze studies een nieuwe set genen die nodig zijn voor de gelokaliseerde expressie van epidermale wondinduceerbare genen 9 geïdentificeerd. Een van de verdiensten van de wond reactie verslaggever methode is dat de resultaten geven meer inzicht in een mechanisme van hoe signalen worden getransduceerd van de plaats van schade aan de naburige cellen. Een van de nadelen van de wond respons reporter werkwijze is dat de resultaten niet direct te koppelen aan fenotypes bij wondgenezing en reparatie. Ruimer gebruik van de schone wond punctie protocol in de genetische en chemische schermen zal nieuwe regulatoren van de transcriptionele respons op epidermale verwonding te identificeren en verder de vertaling van wondgenezing ontdekkingen in zoogdieren modellen van blessure behandelingen.
Protocol
De Drosophila embryonale wond protocol kan worden samengevat in vijf stappen: (1) Embryo Collection, (2) Embryo Voorbereiding (3) Embryo Verwonden, (4) Embryo micro-injectie, en (5) Embryo Fixation.
1. Embryo Collection
- Verzamel volwassen vliegen, 2-3 dagen na eclosing, voeg 50 vrouwtjes en 25 mannetjes om een embryo kooi.
- Plaats een verse appelsap agar plus gist plaat elke ochtend voor 3 dagen.
Opmerkingen: Voor een optimale embryo's worden verzameld, cyclus het vliegen op een 12 uurs schema overdag in een 25 ° C incubator (05:00 lights "ON" en 17:00 lights "OFF"); vrouwtjes reageren op veranderingen in de licht-cyclus en zullen tijdens een overstap van lichten "ON" lichten "OFF" 10,11 grotere hoeveelheden eieren deponeren. - In de namiddag van dag-3, plaats een verse appelsap plus gist agar plaat op de kooi en het verzamelen van embryo's voor 2 uur. Plaats een nieuwe gist plaat op de kooi en sla de2 hr collectie plaat.
- Bewaar de collectie dienblad eens 14 uur bij 25 ° C om de embryo's rijpen.
Opmerkingen: De wondgenezing kan worden getest in elk stadium tijdens Drosophila ontwikkeling, de wond geïnduceerde transcriptie verslaggevers beschreven in dit document hebben een optimale activiteit tussen fasen 15-16 december. Door het late stadium 17, het embryo is te oud om gemakkelijk doorboren de rijping nagelriem en efficiënt activeer de wond reporters of sporen-wond geïnduceerde transcriptie. Om de collectie tijd en het verwonden tijd optreden tijdens de piek lab uur, volgen we een schema van het embryo gedurende 2 uur (16:00-18:00), wisselen de collectie plaat met een nieuwe plaat op 18:00, leeftijd het verzamelen plaat bij 25 ° C gedurende 14 uur (overnacht) en gewikkeld op de embryo 08:00 (volgende dag).
2. Embryo Voorbereiding
Opmerkingen: Dit protocol omvat het gebruik van vele instrumenten en objecten die scherp zijn of gemaakt van glass. Behandel alle slijpsel en glazen voorwerpen met zorg om letsel te voorkomen.
- Verwijder voorzichtig embryo's uit de collectie van platen met een penseel door het toevoegen van 2-3 ml water aan de plaat en zwenken. Transfer water en embryo's van plaat tot nylon gaas en collectie buis.
- Voeg 4-5 ml bleekwater om de dop van een plastic petrischaal plaat en genieten van het gaas overdekte einde van de collectie buis met de embryo's in bleekwater gedurende 2 min, waarbij de buitenste eierschaal van het embryo verwijdert. Handmatig draaien de collectie buis een paar keer om embryo's te voorkomen klonteren in het bleekmiddel. Spoel embryo's met water 10x en droog het gaas bedekt collectie buis die de dechorionated embryo's op een papieren handdoek.
- Gebruik een dissectie naald ~ 50 embryo's te dragen van nylon mesh naar een agar plaat. We voegen groene kleurstof om de agar plaat om het contrast en hulp in embryo uitlijning toe te voegen. Onder een microscoop ontleden, maken twee parallelle rijen van ~ 25 embryo's, het uitlijnen van de embryos op de dia zodat ze loodrecht op de punctienaald op de micro-injectie inrichting. Laat een beetje ruimte (ongeveer 1 embryo lengte) tussen de embryo's voor gasuitwisseling doeleinden. De twee parallelle rijen moeten elkaar ongeveer 5 mm.
- Plaats een dia met dubbele plakband op de top van de lijn embryo's en druk voorzichtig op de dia om embryo's te dragen van de groene plaat aan de dia. Vervolgens aan de lucht drogen de embryo's ~ 25 min om de interne druk op het embryo te verminderen en te voorkomen dat een uitbarsting toen verwondde.
- Plaats 2-3 druppels Halocarbonolie mix over de embryo's om verdere uitdroging te voorkomen.
3. Embryo Verwonden
- Plaats de embryo dia in de injectie microscoop podium. Vind de embryo's in het gezichtsveld en praktijk bewegen het stadium van het omgekeerde microscoop.
Opmerkingen: Voor het werken met de naald, focus op midden vlak van embryo langs de dorsoventral as. Om te zorgen voor een efficiënte verwonden van deuitgelijnd embryo's, beginnen verwondde de rij dichter bij de naald apparaat. Verplaats de fase naar de top van de rij uitgelijnde embryo's in het gezichtsveld brengen. - Zorgvuldig plaats en zorgen voor een getrokken-naald in de naaldhouder. Gebruik de micromanipulator om de naald omlaag te verplaatsen in de richting van dia. Breng de naald met het embryo, in dezelfde focal plane. Zodra de naald in focus met het embryo, niet bewegen de naald met de micromanipulator.
- Verplaats het podium om het embryo te prikken door en door, ga dan naar de volgende embryo in de rij. Als je klaar bent verwondde de eerste rij, gebruik dan de micromanipulator om de naald volledig op en af te stappen van het stadium vóór het verplaatsen van de schuif, handmatig draaien de glijbaan 180 ° en wond de tweede rij.
- Sla de embryo's onder Halocarbonolie bij kamertemperatuur en doorgaan met embryo fixatie als dit in situ hybridisatie of antilichaam kleuring (zie Procedure stap 5). Als alternatief, slaan de embryo's voor 4-6 uuronder halogene olie en doorgaan met gewonden transcriptionele fluorescerende reporter visualisatie (Representatieve resultaten).
Opmerkingen: Voor de visualisatie van de fluorescente reporter verdoven we de embryo's met 50% 1-fenoxy-2-propanol 13. De embryo's worden uit de halogene olie en geplaatst op een nieuwe dia. Wij plaatsen glazen kralen rond de embryo's, voeg een paar druppels van de verdoving, en plaats een dekglas op de embryo's.
4. Embryo Microinjection
Opmerkingen: De micro-injectie apparatuur die we gebruiken in het protocol is niet geautomatiseerd te specifiek volume te leveren tijdens de test. We voegen een kleurstof aan de oplossing van het micro-injectie visualiseren en probeert het volume geleverde normaliseren. Als er te veel oplossing wordt geïnjecteerd in het embryo, de vitelline membraan barsten.
- Laad naald uit de achterzijde met 1 pl van chemische oplossing plus kleurstof (bv. 0,6 MH 2 O 2). Laat capillaireactie om de chemische oplossing op de punt van de naald te trekken.
- Om een naald breken, plaats een deksel slip onder een hoek op een dia en de vacht van de rand met halogene olie mix. Breng de gemonteerde naald in focus met de rand van de schuine dekglas en beweeg dekglas rand over de punt van de naald tot het breekt. Oefen druk uit op micro-injectie apparaat en controleer of de chemische oplossing plus kleurstof stroomt uit de naald.
- Plaats de dia met uitgelijnd embryo's op de microscoop podium. Ga verder met het embryo en de naald in hetzelfde vlak richten. Tegelijkertijd doorboren en microinject chemische oplossing plus kleurstof in elk embryo.
Opmerkingen: Verstopte naalden komen vaak voor, breek een nieuwe naald onvolledige micro-injectie te vermijden. Een stompe naald niet zo schoon als een schuine naald wond. Aanpassen dekglaasje een niet-90 ° hoek tijdens breuk optimaal een schuine naaldpunt produceren.
5. Formaldehyde Fixation
Opmerkingen: De chemicaliën die worden gebruikt in deze Drosophila fixatie zijn schadelijk. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (bijv. handschoenen, labjas en veiligheidsbril) bij het hanteren van de chemicaliën. Volg individuele institutionele richtlijnen voor het verwijderen van gereguleerde stoffen.
- Na verwonding Wacht 15, 30, 60 of meer minuten in de transcriptionele activering van wond geïnduceerde genen optreden. Om embryo's van injectie dia's te verwijderen, laat u de halogene olie mix van de dia's, leunen de glijbaan tegen een rek en dep het einde met een Kimwipe.
- Gebruik een glazen pipet om heptaan spoelen over de glijbaan en was de spoeling vloeistof in een glazen petrischaal. Heptaan zal de band te ontbinden en laat de embryo's. Blijf spoelen totdat alle embryo's uit de dia. Ga door naar de volgende dia, totdat alle embryo's worden verwijderd van dia's.
- Breng de heptaan plus embryo oplossing uit de glazen schaal in een 20 ml scintillation flacon. Schud de flacon voor 2-3 min, verwijder de heptaan en voeg 5 ml vers heptaan.
- Voeg 5 ml verse, fixatie-oplossing (zie lijst reagentia voor recept). Cap de flacon en hechten aan een orbitale platform shaker. Schud de flacon met de embryo's gedurende 25 min bij 220-230 rpm.
- Na het schudden, laten de bubbels op het grensvlak pop. Volledig verwijderen van de bodem, waterige fase met een pipet, het vermijden van het trekken van de embryo's. De onderste laag bestaat uit de fixatie-oplossing en moet goed worden afgevoerd.
- Voeg 5 ml methanol, dop op de flacon en schud krachtig met de hand gedurende 20-30 sec, swirl en plaats het op de bank. Gewonde embryo's blijft bij de interfase en zal niet zinken naar de bodem.
Opmerkingen: Na fixatie van de vitelline membraan van een gewonde embryo normaal zal barsten tijdens de dehydratatiestap met methanol. Echter, de vitelline membraan in een gewonde embryo al gebroken en de uitdroging stap zal de vitelline memb niet verwijderenrane. Hand-devitellinzation moet de fixatie protocol voltooien. - Verwijder voorzichtig de bovenste heptaanlaag en voeg dan 5 ml verse methanol. Schud de flacon en de embryo's moeten zinken.
- Verwijder de methanol plus embryo oplossing met een glazen pipet overdracht en verzamelen in een nylon mesh collectie buis in een glazen schaal.
- Verwijder de methanol en spoel de embryo's met 1x PBS oplossing.
- Breng de embryo's uit de nylon mesh om een appelsap plaat. Spreid de embryo langs het oppervlak van de plaat.
- Breng de embryo's om een dubbele plakband glasplaatje. Bedek de embryo's met 1x PBS.
Opmerkingen: De embryo neiging om klonteren als gevolg van de vitelline-membraan. Met behulp van een appelsap plek zorgt voor een snelle scheiding van de samengeklonterd embryo. De embryo's moeten van de plaat worden verwijderd en overgebracht naar een dubbele plakband glasplaatje omdat embryo's zinken in de agar plaat wanneer kracht wordt uitgeoefend op het embryo uit het verwijderenvitelline membraan. - Duw de embryo's met een dissectie naald om "pop" de vitelline membraan. Het embryo moet zinken in de PBS.
- Gebruik een glazen pipet om de 1x PBS plus embryo overbrengen naar een 1,5 ml buis. Spoel de embryo's met 1x PBS en bewaar bij 4 ° C. Ga verder naar de embryo's met behulp van een Ethanol uitdrogen: PBS serie en ga verder met in situ hybridisatie of immunolocalization protocol 14.
Representative Results
Om de in deze methode resultaten te verkrijgen, is het open leesraam van groen fluorescerend eiwit (GFP) gefuseerd aan een promotor / wond geïnduceerde enhancer sequentie uit dopadecarboxylase (Ddc) en DsRed gefuseerd aan een wond versterkende sequentie van tyrosine hydroxylase ( ple) 4,6. In een levende Drosophila embryo, rijping van de wond fluorescente reporter proteïne optimaal 4-6 uur na verwonding, waarin de tijd voor het verzamelen van voldoende eiwit te visualiseren, en tijd voor het fluorescente proteïne te oxideren tot de fluorescerende toestand 15. De verslaggever lokalisatie observeren, een verbinding fluorescentiemicroscoop is voldoende. Een hogere vergroting van de reporter lokalisatie observeren, een confocale microscoop optimaal maximaal projectie van meerdere optische secties (figuur 1) te genereren. Confocale in vivo beeldvorming van Drosophila embryo wordt gecompliceerd door de rapid golvingen van het embryo. . Een volledige weergave van embryo kan worden verkregen met 20X objectief en een close-up bekijken van de wond site kan worden verkregen met 40X objectief. Een bovenaanzicht van de epidermale wond reporter lokalisatie kunnen worden afgebeeld met 10 opeenvolgende 1 pm optische secties. Een zij-aanzicht epidermale wond reporter lokalisatie kan worden afgebeeld met 40 achtereenvolgens 1 urn optische secties.
Met standaard genetische kruising werkwijzen is het mogelijk om wond reporters combineren met genetische mutaties. Een voorbeeld in dit document is Flotillin-2 (Flo-2), omdat het verlies-van-functie (nul-allel gegenereerd met P-element inbrengen) en gain-of-function (overexpressie gegenereerd met alomtegenwoordige expressie in alle cellen) mutanten van flo-2 tonen de Flo-2 genproduct noodzakelijk en voldoende om de lokalisatie van DDC-GFP remmen gewikkeld reporters 9 (figuren 2A en 2B). Met behulp van de microinjection protocol is het mogelijk om te testen of introductie van chemische oplossingen superactivates of remt de lokalisatie van wond reporters. Chemisch-gewonden embryo's werden gelijktijdig gewond en geïnjecteerd met een 01:04 verhouding van 1% toluïdineblauwkleurstof en opgeloste verbindingen. Toluïdineblauwkleurstof termijn voor visuele bevestiging van oplosbaar verbindingen worden geïnjecteerd in de lichaamsholte. Controle embryo's werden verwond met een gebroken naald met 01:04 verhouding van 1% toluïdineblauwkleurstof en opgeloste stof zonder chemische. Twee voorbeelden in dit document zijn waterstofperoxide (H 2 O 2) en methyl-β-cyclodextrine (MβCD), omdat beide chemische oplossingen voldoende zijn om globaal activeren van de lokalisatie van de Ddc-GFP wond reporters 9 (figuren 2C en 2D) . Waterstofperoxide (H 2 O 2) werd verdund in H2O tot 0,6 M. Methyl-β-cyclodextrine (MβCD) werd opgelost in 1 mM NaOH tot 3 mM. De embryo fixatie protocol, is het mogelijk om de transcriptie activatie opgewikkeld respons genen detecteren in een gelokaliseerd gebied, rondom een wond. Een voorbeeld in dit document is de in situ hybridisatie van RNA probes detecteren Ddc en PLE transcripten 4,6,9 (Figuren 3A en 3B).
Figuur 1. Ddc-GFP en ple-DsRed wond reporter lokalisatie. Brightfield en fluorescerende afbeeldingen in gewonde wild type embryo. (A) Top-view van Ddc-GFP wond reporter. (B) Top-view van ple-DsRed wond reporter. Alle beelden werden verzameld op een Leica SP2 confocale microscoop, met 20X objectief. Pijlen geven de site van de wond. Binnen de lijnen in het data-scherms markeren de contouren van embryo's. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Lokalisatie van de Ddc-GFP wond verslaggever in genetische mutant achtergronden en chemische gemicroinjecteerd embryo. Brightfield en fluorescerende beelden van gewonde Flotillin-2 (Flo-2) mutant embryo's. (A) verlies-van-functie Flo-2 {KG00210} mutanten, uitbreiding van de reporter-activiteit in alle epidermale cellen. (B) Gain-of-function Flo-2 (gordeldier-GAL4, UAS-FLO2) mutanten, remming van de reporter-activiteit in alle epidermale cellen. (C) waterstofperoxide (H 2 O 2 ) oplossing micro-injectie, uitbreiding van reporter activiteit in alle epidermale cellen. (D) Methyl-β-cyclodextrine (MβCD) oplossing micro-injectie, uitbreiding van reporter-activiteit in alle epidermale cellen. Alle beelden werden verzameld op een Leica SP2 confocale microscoop, met 20X objectief. Pijlen geven de site van de wond. Binnen de lijnen in de gegevens panelen markeren de contouren van embryo's. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Detectie wond respons gen RNA transcripten. Fluorescerende beelden van in situ hybridisatie en RNA detectie in gewonde wildtype embryo. Ddc (A) en PLE (B) RNA transcripten accumuleren rond de wond. Alle beelden waren collectieveted op een Leica SP2 confocale microscoop, met 20X objectief. Pijlen geven de site van de wond. Binnen de lijnen in de gegevens panelen markeren de contouren van embryo's. Klik hier voor grotere afbeelding .
Tabel 1. Samenvatting van de epidermale wond reactie verslaggevers. Invoegingen van de vier wond reactie verslaggevers (Ddc, PLE, msn, KKV) zijn beschikbaar op zowel de tweede als derde chromosomen. In een beperkt aantal epidermale cellen rondom de plaats van de punctie letsel in het wild type achtergrond (bijv. "lokale" fenotype) Alle van de wond reactie verslaggevers activeren de fluorescentie gen (GFP of DsRed). Ddc en msn wond reactie verslaggevers nodig Grh voor activering van de fluorescence gen na punctie letsel (bijvoorbeeld "geen" fenotype). Alle van de wond verslaggevers vereisen Flo-2 voor lokalisatie van de fluorescentie-gen na punctie letsel (bijv. "globale" fenotype). Klik hier voor grotere afbeelding .
Discussion
Een onmiddellijke transcriptionele regelende reactie op externe stimuli cellen toestaat een gelokaliseerde respons op extracellulaire stimuli, die zijn stress, beschadiging of infectie coördineren. De onjuiste controle van een lokale reactie kan schadelijke effecten hebben op naburige cellen, evenals een verspilling van middelen om de schade te repareren. De Drosophila embryo een uitstekend systeem basis wondgenezing experimenten op een goedkope en gemakkelijk te onderhouden modelorganisme. Het potentieel voor samenwerking tussen onderzoek in andere modelorganismen en Drosophila biedt een unieke gelegenheid om vele biologische vragen te verkennen.
Een extra techniek van de wond reporters is de genetische combinatie van mutanten, die een efficiënte methode voor het testen van de bijdrage van nieuwe genen tot de activatie van de epidermale wond reactieweg. We hebben epidermale-wond geïnduceerde transcriptie verslaggevers avBESCHIKBARE op zowel de 2 e en 3 e chromosomen 5. In dit onderzoek gebruiken we UAS en GAL4 systemen overexpressie 16. Voor studies met dodelijke mutant allelen bepalen we de genetische achtergrond met behulp van een fluorescerende balancer chromosoom, bijvoorbeeld Kruppel-GFP 17. We hebben de wond verslaggever lokalisatie in verschillende genetische achtergronden (tabel 1) geanalyseerd.
Een mogelijke modificatie van de techniek is micro-injectie en verwonding combineren. Micro-injectie kan worden gebruikt om een chemische oplossing in de embryo voeren. Verschillende chemische verbindingen zijn getest en bleken de activiteit van de epidermale wond reporters 9 reguleren. Deze werkwijze van gelijktijdige verwonden en micro-injectie kan nuttig zijn om het aantal cellen in de Drosophila embryo dat een wond signaal reageren en kan direct worden gebruikt om genexpressie veranderingen volgen na verwonding 18 vergroten. Een toekomstige toepassing van de micro-injectie techniek zal zijn om nieuwe chemicaliën te testen voor de regulering van de epidermale wond reactie.
Drosophila als een modelsysteem voor genetisch onderzoek biedt een breed scala van eenvoudige protocollen om doeltreffend op te complexe vragen. Recente rapporten over de haalbaarheid van Drosophila technieken hoogtepunten van het gebruik van hemocyte migratie 19 en sluipwesp infectie 20 als een middel om de impact van de Drosophila onderzoeksgemeenschap verder te verbreden. Naast wondheling studies, Drosophila biedt een klassiek model voor regeneratie met de imaginaire disc systeem 21,22. De gecombineerde vooruitgang in imaginal disc regeneratie studies en punctie / micro-injectie verwonding biedt een uitstekend systeem om goed bewaarde onderdelen van weefselherstel te ontdekken.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit protocol is ontwikkeld in samenwerking met de vorige leden van de McGinnis Lab, Kim A. Mace en Joseph C. Pearson. Wij danken de voortdurende inspanningen van de Bloomington Drosophila Stock Center voor hun werk om waardevolle bestanden te organiseren en te distribueren. Dit werk werd ondersteund door financiering van de National Institutes of Health (R01 GM077197 en K12 GM68524) en de familie van Herbert Stern. MTJ wordt momenteel ondersteund door Grant Number 5G12RR003060-26 van het National Center for Research Resources en Grant Number 8G12MD7603-27 van het National Institute on Minority Health and Health Verschillen. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het Nationaal Instituut voor Gezondheid van de Minderheid En Health Verschillen of de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| yeast | Sigma Aldrich | 51475 | |
| apple juice | Generic | ||
| agar | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
| bleach | Generic | ||
| halocarbon oil, 700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
| halocarbon oil, 27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
| 1-phenoxy-2-propanol | Sigma Aldrich | 484423 | |
| hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H324 | |
| methyl-β-cyclodextrin | Sigma Aldrich | C4555 | |
| toluidine blue | Sigma Aldrich | 89640 | |
| formaldehyde, 16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | toxic chemical |
| heptane | Fisher Scientific | H360-1 | toxic chemical |
| methanol | Fisher Scientific | A412-1 | toxic chemical |
| 10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| RNase free H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
| Drosophila incubator | Genessee Scientific | 59-197 | |
| fly cage | Genessee Scientific | 59-100 | |
| embryo collection tube | Genessee Scientific | 46-101 | |
| plastic Petri dish | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
| double-stick tape | Generic | ||
| paintbrush | Generic | ||
| dissection needle | Fisher Scientific | 08-965A | sharp object |
| glass cover slip | Thermo Scientific | 3306 | sharp object |
| microscope slide | Thermo Scientific | 4445 | sharp object |
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
| capillary needle | FHC | 30-30-1 | sharp object |
| needle puller | Narishige | PC10 | |
| microinjection needle holder | Narishige | MINJ4 | |
| micromanipulator | Narishige | MN151 | |
| inverted microscope | Carl Zeiss | Primo-Vert | |
| glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | sharp object |
| glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 22-063-172 | sharp object |
| transfer bulb | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
| scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | sharp object |
| orbital shaker | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
| 1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| laser scanning confocal | Leica | SP2 | |
| fixation solution | (5 ml) | ||
| 16% formaldehyde | 2.5 ml | toxic chemical | |
| 10x PBS | 0.5 ml | ||
| 0.5 M EGTA | 0.5 ml | ||
| RNase free H2O | 1.5 ml | ||
| Halocarbon oil mix | (10 ml) | ||
| halocarbon oil, 700 W | 5 ml | ||
| halocarbon oil, 27 W | 5 ml |
References
- Germeraad, S. Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA. Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).
- Payre, F. Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila. Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
- Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head. Science. 308 (5720), 381-385 (2005).
- Ting, S. B., Caddy, J., et al. A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice. Science. 308 (5720), 411-413 (2005).
- Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, Ø, McGinnis, W. Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).
- Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair. Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).
- Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes. Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).
- Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila. PLoS Genet. 7 (12), e1002424 (2011).
- Allemand, R. Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster. J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).
- Allemand, R. Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster. Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).
- Pierre, S. E., Thurmond, J. FlyBase 101 - the basics of navigating FlyBase. Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).
- Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. 1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology. J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305 (5685), 846 (2004).
- Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP. BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Casso, D., Ramírez-Weber, F., Kornberg, T. B. GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster. Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).
- Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila. PloS one. 8 (4), e61773 (2013).
- Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations. J. Vis. Exp. (36), e1696 (2010).
- Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J. Vis. Exp. (63), e3347 (2012).
- Repiso, A., Bergantiños, C., Corominas, M., Serras, F. Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs. Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).
- Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs. Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).
