极后期果蝇胚胎的胚胎表皮提供的体内系统的快速穿刺伤口响应分析,可以用基因操作或化学显微注射治疗组合以推进研究在伤口愈合翻译成哺乳动物模型。
果蝇胚胎发育,供应既保护了内部的细胞从一个严峻的外部环境以及维持细胞稳态强大的表皮层。穿刺伤用玻璃针提供了一种直接的方法来触发快速表皮伤口响应,激活伤口转录记者,这可以通过一个局部记者信号在活胚胎或幼虫被可视化。穿刺或激光的伤害还规定,促进血细胞的招募到伤口部位的信号。出人意料的是,重度(通过,并通过)穿刺损伤后期胚胎只有很少干扰正常胚胎发育,如大于90%,例如受伤胚胎存活到成年时的胚胎中,最大限度地减少直接泄漏血淋巴中的从穿刺部位的油介质被注入。卷绕过程确实需要显微操作果蝇胚胎,其中胚胎在银手动对准AR板和对齐胚胎显微镜载玻片转移。 果蝇表皮伤口响应分析提供了一种快速的系统进行测试的各种生物学功能,促进伤口愈合,以及一种方法来筛选潜在的化学化合物,其促进伤口愈合的基因的需求。生命周期短,易培养例行使果蝇的一个功能强大的模式生物。 果蝇清洁伤口愈合出现协调表皮再生反应,与先天免疫反应,在方式,则仍在调查中,它提供了一个很好的系统来找到保守的监管常见的果蝇和哺乳动物表皮伤人机制。
用显微注射技术果蝇胚胎的操控是一个行之有效的分析1。表皮伤口响应报道方法的意义在于对协议 进行穿刺/注射结合荧光报告和可视化的体内响应于表皮损伤的果蝇胚胎。该方法的目的是使一组科学家更广泛的使用果蝇作为一种工具,以调查,调节表皮穿刺伤的转录反应的进程。单层表皮果蝇提供了一个简单系统中的穿刺伤2后,研究表皮伤口响应。 果蝇胚胎是一个强大的模型系统进行遗传解剖的伤口修复的阶段,包括伤口反应,炎症和表皮细胞再生3。这部分是因为许多或大多数合子突变体存活到embryogenes的端是发展表皮屏障,即使发育模式去深刻出差错。以前表征一个高度保守的转录因子粒状头(GRH),确定该GRH-靶基因的多巴脱羧酶(DDC)和酪氨酸羟化酶(PLE)的转录周围损伤4的位点被激活。 果蝇作为模式生物用于伤口响应提供调查的补充,以推进研究在哺乳动物伤口愈合5。随后的研究发现有其他果蝇伤口诱导的基因,并制定了“工具箱”的许多荧光伤口记者来监视体内表皮伤口的反应来清洁伤人6。对果蝇伤口愈合的调控最近的报道都集中在伤口闭合型,允许探索多种途径调节细胞迁移7,8。用的分析荧光伤口记者,我们的研究已经确定了一套所需的表皮伤口诱导基因9本地化表达基因的小说。一项所述的伤口响应报道方法的优点是,该结果提供了更深入的信号是如何从损伤部位转导到相邻小区的机制。然而,在伤口响应报道方法的缺点之一是,结果不直接链接到在伤口愈合或修复的表型。在遗传和化学屏幕更广泛地利用清洁伤口穿刺协议将允许转录反应的新的监管机构,以表皮伤人被识别并进一步伤口愈合发现翻译成伤治疗哺乳动物模型。
到外部线索立即转录调控响应允许细胞坐标的局部响应于细胞外刺激,其可以包括应力,损伤或感染。不当控制局部反应可能对相邻小区的破坏性影响,以及资源的浪费,以修复损伤。 果蝇胚胎提供了极好的系统,以在一个廉价的和易于维护的模型生物体进行基本的伤口愈合试验。在其他模式生物的研究和果蝇之间的合作潜力提供了一个独特的机会去探索许多生物学问题。
伤口记者的附加技术是突变体背景的基因组合,提供了用于测试的新的基因,以表皮伤口反应途径的活化的贡献的有效方法。我们有表皮伤口诱导的转录记者AVailable在2号,3号染色体5两者。在这项研究中,我们使用无人机和表达16 GAL4系统。对于致死突变等位基因的研究,我们决定使用荧光平衡器染色体, 如Kruppel-GFP 17的遗传背景。我们已经分析了几种遗传背景( 表1)伤口记者本土化。
该技术的一个可能的修改是结合显微注射和伤人。显微注射可以用来引入一个化学溶液注入胚胎。几种化学成分进 行了测试,发现它们调节表皮伤口记者9的活性。同时伤人和显微注射的这个方法可以是有用的,以增加细胞在果蝇胚胎进行了回复伤信号,可直接用于监测基因表达的变化伤人18后的数。显微注射技术的应用前景将是测试新的化学品的表皮创伤反应的调节。
果蝇作为遗传学研究的模式系统提供了多种简单的协议,有效地解决复杂的问题。对果蝇技术的可行性最近的报告强调了使用血细胞迁移19和寄生蜂感染20为手段,以进一步拓宽果蝇研究界的影响。除了 创伤修复的研究, 果蝇提供了一个经典模型进行再生与成虫盘系统21,22。在成虫盘再生的研究和穿刺/注射伤人合并的进展提供了一个很好的系统来发现组织修复以及保守的成分。
The authors have nothing to disclose.
该协议已经制定了与麦金尼斯实验室,金A.锤和约瑟夫·皮尔逊的早期成员合作。我们感谢继续努力的布鲁明顿果蝇库存中心为他们的工作,组织和分发有价值的股票。这项工作是由美国国立卫生研究院(R01 GM077197和K12 GM68524)和赫伯特·斯特恩的家庭提供资金支持。 MTJ目前由授权号5G12RR003060-26来自国家研究资源中心与授权号码8G12MD7603-27从国家学院少数民族健康与健康差距的支持。内容完全是作者的责任,并不一定代表研究所少数民族健康与健康差距和美国国立卫生研究院的官方意见。
yeast | Sigma Aldrich | 51475 | |
apple juice | Generic | ||
agar | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
bleach | Generic | ||
halocarbon oil, 700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
halocarbon oil, 27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
1-phenoxy-2-propanol | Sigma Aldrich | 484423 | |
hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H324 | |
methyl-β-cyclodextrin | Sigma Aldrich | C4555 | |
toluidine blue | Sigma Aldrich | 89640 | |
formaldehyde, 16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | toxic chemical |
heptane | Fisher Scientific | H360-1 | toxic chemical |
methanol | Fisher Scientific | A412-1 | toxic chemical |
10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
RNase free H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
Drosophila incubator | Genessee Scientific | 59-197 | |
fly cage | Genessee Scientific | 59-100 | |
embryo collection tube | Genessee Scientific | 46-101 | |
plastic Petri dish | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
double-stick tape | Generic | ||
paintbrush | Generic | ||
dissection needle | Fisher Scientific | 08-965A | sharp object |
glass cover slip | Thermo Scientific | 3306 | sharp object |
microscope slide | Thermo Scientific | 4445 | sharp object |
dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
capillary needle | FHC | 30-30-1 | sharp object |
needle puller | Narishige | PC10 | |
microinjection needle holder | Narishige | MINJ4 | |
micromanipulator | Narishige | MN151 | |
inverted microscope | Carl Zeiss | Primo-Vert | |
glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | sharp object |
glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 22-063-172 | sharp object |
transfer bulb | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | sharp object |
orbital shaker | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
laser scanning confocal | Leica | SP2 | |
fixation solution | (5 ml) | ||
16% formaldehyde | 2.5 ml | toxic chemical | |
10x PBS | 0.5 ml | ||
0.5 M EGTA | 0.5 ml | ||
RNase free H2O | 1.5 ml | ||
Halocarbon oil mix | (10 ml) | ||
halocarbon oil, 700 W | 5 ml | ||
halocarbon oil, 27 W | 5 ml |