De embryonale epidermis zeer laat stadium Drosophila embryo's verschaft een in vivo systeem voor snelle steekwond respons-analyse en kunnen worden gecombineerd met genetische manipulatie of chemische behandelingen microinjectie studies gaan in wondgenezing voor de vertaling in zoogdierlijke modellen.
De Drosophila embryo ontwikkelt een robuuste epidermale laag die dient zowel de interne cellen tegen een harde externe omgeving alsook cellulaire homeostase. Punctie letsel met glasnaalden een directe methode om een snelle reactie epidermale wond die wond transcriptionele reporters, die kan worden gevisualiseerd door een gelokaliseerde reporter signaal in levende embryo's of larven activeert activeren. Punctie of laser letsel geeft ook signalen dat de aanwerving van hemocytes bevorderen om de wond. Verrassend, ernstige (door en door) punctie letsel in een vergevorderd stadium embryo's slechts zelden verstoort de normale embryonale ontwikkeling, als meer dan 90% van deze gewonden embryo's overleven naar volwassenheid wanneer embryo's worden geïnjecteerd in een olie medium dat onmiddellijke lekkage van hemolymph op de injectieplaats minimaliseert . De wond procedure vereist micromanipulatie van de Drosophila embryo's, waaronder handmatige uitlijning van de embryo's op agar platen en de overdracht van de uitgelijnde embryo's om dia microscoop. De Drosophila epidermale wond respons assay biedt een snelle systeem om de genetische eisen van diverse biologische functies wondgenezing, evenals een manier om te screenen op potentiële chemische verbindingen die wondheling bevorderen bevorderen testen. De korte levenscyclus en gemakkelijk kweken routine Drosophila een krachtige modelorganisme. Drosophila schoon wondgenezing blijkt de epidermale regeneratieve respons te coördineren, met de aangeboren immuunrespons, op een manier die nog in onderzoek zijn, die een uitstekend systeem om geconserveerde regelgevende vinden biedt mechanismen gemeen Drosophila en zoogdieren epidermale verwonden.
Manipulatie van Drosophila embryo's met behulp van een micro-injectie techniek is een gevestigde assay 1. De betekenis van de epidermale wond reporter respons methode is het protocol doorboren / micro-injectie gecombineerd met fluorescerende reporters en een in vivo reactie op epidermale schade in Drosophila embryo zichtbaar. Het doel van deze methode is om een bredere reeks van wetenschappers in staat te stellen Drosophila gebruiken als een instrument om de processen die de transcriptionele respons op epidermale punctie letsel reguleren onderzoeken. De single-gelaagde epidermis in Drosophila biedt een eenvoudig systeem om een epidermale wond reactie studeren na een lekke blessure 2. Het Drosophila embryo een robuust modelsysteem genetisch ontleden stadia van wondheling, zoals wond reactie, ontsteking en reepithelialization 3. Dit komt deels omdat veel of de meeste zygotische mutanten te overleven tot het einde van embryogenesis en ontwikkelen epidermale barrières zelfs wanneer ontwikkelingsstoornissen patronen gaat diep mis. Vorige karakterisering van een goed geconserveerd transcriptiefactor korrelige hoofd (Grh), geïdentificeerd die Grh-target genen Dopa decarboxylase (DDC)-en tyrosine hydroxylase (ple) transcriptioneel geactiveerd rond de sites van de schade 4. Drosophila als modelorganisme voor wond reactie voorziet in een extra lijn van onderzoek naar studies gaan in zoogdieren wondgenezing 5. Latere studies hebben extra Drosophila-wond geïnduceerde genen geïdentificeerd en ontwikkelde een "toolkit" van vele TL wond verslaggevers te zien op de in vivo epidermale wond reactie te reinigen verwonden 6. Recente rapporten over de regulering van Drosophila wondgenezing hebben zich gericht op het dichten van wonden in fenotype, waardoor ontdekking van de vele paden reguleren cel migratie 7,8. Met de analyse van defluorescerende wond verslaggevers, hebben onze studies een nieuwe set genen die nodig zijn voor de gelokaliseerde expressie van epidermale wondinduceerbare genen 9 geïdentificeerd. Een van de verdiensten van de wond reactie verslaggever methode is dat de resultaten geven meer inzicht in een mechanisme van hoe signalen worden getransduceerd van de plaats van schade aan de naburige cellen. Een van de nadelen van de wond respons reporter werkwijze is dat de resultaten niet direct te koppelen aan fenotypes bij wondgenezing en reparatie. Ruimer gebruik van de schone wond punctie protocol in de genetische en chemische schermen zal nieuwe regulatoren van de transcriptionele respons op epidermale verwonding te identificeren en verder de vertaling van wondgenezing ontdekkingen in zoogdieren modellen van blessure behandelingen.
Een onmiddellijke transcriptionele regelende reactie op externe stimuli cellen toestaat een gelokaliseerde respons op extracellulaire stimuli, die zijn stress, beschadiging of infectie coördineren. De onjuiste controle van een lokale reactie kan schadelijke effecten hebben op naburige cellen, evenals een verspilling van middelen om de schade te repareren. De Drosophila embryo een uitstekend systeem basis wondgenezing experimenten op een goedkope en gemakkelijk te onderhouden modelorganisme. Het potentieel voor samenwerking tussen onderzoek in andere modelorganismen en Drosophila biedt een unieke gelegenheid om vele biologische vragen te verkennen.
Een extra techniek van de wond reporters is de genetische combinatie van mutanten, die een efficiënte methode voor het testen van de bijdrage van nieuwe genen tot de activatie van de epidermale wond reactieweg. We hebben epidermale-wond geïnduceerde transcriptie verslaggevers avBESCHIKBARE op zowel de 2 e en 3 e chromosomen 5. In dit onderzoek gebruiken we UAS en GAL4 systemen overexpressie 16. Voor studies met dodelijke mutant allelen bepalen we de genetische achtergrond met behulp van een fluorescerende balancer chromosoom, bijvoorbeeld Kruppel-GFP 17. We hebben de wond verslaggever lokalisatie in verschillende genetische achtergronden (tabel 1) geanalyseerd.
Een mogelijke modificatie van de techniek is micro-injectie en verwonding combineren. Micro-injectie kan worden gebruikt om een chemische oplossing in de embryo voeren. Verschillende chemische verbindingen zijn getest en bleken de activiteit van de epidermale wond reporters 9 reguleren. Deze werkwijze van gelijktijdige verwonden en micro-injectie kan nuttig zijn om het aantal cellen in de Drosophila embryo dat een wond signaal reageren en kan direct worden gebruikt om genexpressie veranderingen volgen na verwonding 18 vergroten. Een toekomstige toepassing van de micro-injectie techniek zal zijn om nieuwe chemicaliën te testen voor de regulering van de epidermale wond reactie.
Drosophila als een modelsysteem voor genetisch onderzoek biedt een breed scala van eenvoudige protocollen om doeltreffend op te complexe vragen. Recente rapporten over de haalbaarheid van Drosophila technieken hoogtepunten van het gebruik van hemocyte migratie 19 en sluipwesp infectie 20 als een middel om de impact van de Drosophila onderzoeksgemeenschap verder te verbreden. Naast wondheling studies, Drosophila biedt een klassiek model voor regeneratie met de imaginaire disc systeem 21,22. De gecombineerde vooruitgang in imaginal disc regeneratie studies en punctie / micro-injectie verwonding biedt een uitstekend systeem om goed bewaarde onderdelen van weefselherstel te ontdekken.
The authors have nothing to disclose.
Dit protocol is ontwikkeld in samenwerking met de vorige leden van de McGinnis Lab, Kim A. Mace en Joseph C. Pearson. Wij danken de voortdurende inspanningen van de Bloomington Drosophila Stock Center voor hun werk om waardevolle bestanden te organiseren en te distribueren. Dit werk werd ondersteund door financiering van de National Institutes of Health (R01 GM077197 en K12 GM68524) en de familie van Herbert Stern. MTJ wordt momenteel ondersteund door Grant Number 5G12RR003060-26 van het National Center for Research Resources en Grant Number 8G12MD7603-27 van het National Institute on Minority Health and Health Verschillen. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het Nationaal Instituut voor Gezondheid van de Minderheid En Health Verschillen of de National Institutes of Health.
yeast | Sigma Aldrich | 51475 | |
apple juice | Generic | ||
agar | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
bleach | Generic | ||
halocarbon oil, 700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
halocarbon oil, 27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
1-phenoxy-2-propanol | Sigma Aldrich | 484423 | |
hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H324 | |
methyl-β-cyclodextrin | Sigma Aldrich | C4555 | |
toluidine blue | Sigma Aldrich | 89640 | |
formaldehyde, 16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | toxic chemical |
heptane | Fisher Scientific | H360-1 | toxic chemical |
methanol | Fisher Scientific | A412-1 | toxic chemical |
10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
RNase free H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
Drosophila incubator | Genessee Scientific | 59-197 | |
fly cage | Genessee Scientific | 59-100 | |
embryo collection tube | Genessee Scientific | 46-101 | |
plastic Petri dish | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
double-stick tape | Generic | ||
paintbrush | Generic | ||
dissection needle | Fisher Scientific | 08-965A | sharp object |
glass cover slip | Thermo Scientific | 3306 | sharp object |
microscope slide | Thermo Scientific | 4445 | sharp object |
dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
capillary needle | FHC | 30-30-1 | sharp object |
needle puller | Narishige | PC10 | |
microinjection needle holder | Narishige | MINJ4 | |
micromanipulator | Narishige | MN151 | |
inverted microscope | Carl Zeiss | Primo-Vert | |
glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | sharp object |
glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 22-063-172 | sharp object |
transfer bulb | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | sharp object |
orbital shaker | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
laser scanning confocal | Leica | SP2 | |
fixation solution | (5 ml) | ||
16% formaldehyde | 2.5 ml | toxic chemical | |
10x PBS | 0.5 ml | ||
0.5 M EGTA | 0.5 ml | ||
RNase free H2O | 1.5 ml | ||
Halocarbon oil mix | (10 ml) | ||
halocarbon oil, 700 W | 5 ml | ||
halocarbon oil, 27 W | 5 ml |