बहुत देर से मंच ड्रोसोफिला भ्रूण के भ्रूण एपिडर्मिस तेजी पंचर घाव प्रतिक्रिया विश्लेषण के लिए एक Vivo प्रणाली प्रदान करता है और स्तनधारी मॉडल में अनुवाद के लिए घाव भरने में पढ़ाई करने के लिए अग्रिम आनुवंशिक जोड़तोड़ या रासायनिक microinjection उपचार के साथ जोड़ा जा सकता है.
ड्रोसोफिला भ्रूण दोनों एक कठोर बाहरी वातावरण से आंतरिक कोशिकाओं की रक्षा करने के साथ ही सेलुलर homeostasis को बनाए रखने के लिए कार्य करता है कि एक मजबूत epidermal परत विकसित करता है. कांच सुइयों के साथ पंचर चोट रहने वाले भ्रूण या लार्वा में एक स्थानीय पत्रकार के संकेत से देखे जा सकते हैं जो घाव ट्रांसक्रिप्शनल संवाददाताओं से सक्रिय है, कि एक तेजी से एपिडर्मल घाव प्रतिक्रिया ट्रिगर करने के लिए एक सीधा तरीका प्रदान करता है. पंचर या लेजर चोट भी घाव साइट पर hemocytes की भर्ती को बढ़ावा देने के संकेत है कि प्रदान करता है. हैरानी की बात है, देर चरण भ्रूण में गंभीर (के माध्यम से और के माध्यम से) पंचर चोट केवल शायद ही कभी इस तरह के घायल भ्रूण के 90% से अधिक भ्रूण पंचर साइटों से hemolymph के तत्काल रिसाव कि कम से कम एक तेल माध्यम में इंजेक्ट कर रहे हैं जब वयस्कता के लिए जीवित रहने के रूप में, सामान्य भ्रूण विकास बाधित . घाव प्रक्रिया एजी पर भ्रूण का मार्गदर्शन संरेखण सहित ड्रोसोफिला भ्रूण की micromanipulation, की आवश्यकता होती हैएआर प्लेटें और स्लाइड खुर्दबीन के लिए गठबंधन भ्रूण का स्थानांतरण. ड्रोसोफिला एपिडर्मल घाव प्रतिक्रिया परख घाव भरने, साथ ही घाव भरने को बढ़ावा देने की क्षमता है कि रासायनिक यौगिकों के लिए स्क्रीन के लिए एक तरह का प्रचार करने वाली जैविक कार्यों की एक किस्म के आनुवंशिक आवश्यकताओं को परीक्षण करने के लिए एक त्वरित प्रणाली प्रदान करता है. कम जीवन चक्र और आसान संवर्धन दिनचर्या ड्रोसोफिला एक शक्तिशाली जीव मॉडल बनाते हैं. ड्रोसोफिला साफ घाव भरने नियामक संरक्षित खोजने के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली प्रदान करता है जो जांच के तहत अब भी कर रहे हैं कि मायनों में, सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ, एपिडर्मल पुनर्योजी प्रतिक्रिया समन्वय करने के लिए प्रकट होता है ड्रोसोफिला और स्तनधारी एपिडर्मल लोग घायल हो गए करने के लिए आम तंत्र.
एक microinjection तकनीक का उपयोग ड्रोसोफिला भ्रूण की हेरफेर एक अच्छी तरह से स्थापित परख 1 है. एपिडर्मल घाव प्रतिक्रिया संवाददाता विधि के महत्व फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ पंचर / microinjection के लिए प्रोटोकॉल गठबंधन और ड्रोसोफिला भ्रूण में एपिडर्मल चोट करने के लिए एक में विवो प्रतिक्रिया कल्पना करने के लिए है. इस पद्धति का लक्ष्य एपिडर्मल पंचर चोट के transcriptional प्रतिक्रिया को विनियमित कि प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए एक उपकरण के रूप में ड्रोसोफिला का उपयोग करने के लिए वैज्ञानिकों की एक व्यापक सेट के लिए सक्षम है. ड्रोसोफिला में एकल स्तरित एपिडर्मिस एक पंचर चोट 2 के बाद एक epidermal घाव प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक सरल प्रणाली प्रदान करता है. ड्रोसोफिला भ्रूण आनुवंशिक रूप से घाव प्रतिक्रिया, सूजन, और reepithelialization 3 सहित, घाव की मरम्मत के चरणों काटना एक मजबूत मॉडल प्रणाली है. कई या सबसे युग्मज म्यूटेंट embryogenes के अंत तक जीवित रहते हैं क्योंकि इस हिस्से में हैऔर विकासात्मक patterning गहराई से धराशायी हो जाता है, तब भी जब एपिडर्मल बाधाओं का विकास. GRH लक्ष्य जीन Dopa decarboxylase (डीडीसी) और tyrosine hydroxylase (मिसाल) transcriptionally चोट 4 के स्थलों के आसपास सक्रिय कर रहे हैं. पहचान एक अच्छी तरह से संरक्षित प्रतिलेखन कारक दानेदार सिर (GRH), पिछले लक्षण वर्णन ड्रोसोफिला घाव प्रतिक्रिया के लिए एक मॉडल के रूप में जीव स्तनधारी घाव भरने 5 में पढ़ाई करने के लिए अग्रिम जांच के लिए एक पूरक लाइन प्रदान करता है. बाद के अध्ययन अतिरिक्त ड्रोसोफिला घाव प्रेरित जीन की पहचान की है और 6 लोग घायल हो गए साफ करने में विवो एपिडर्मल घाव प्रतिक्रिया पर नजर रखने के लिए कई फ्लोरोसेंट घाव पत्रकारों के एक "टूलकिट" विकसित किया है. ड्रोसोफिला घाव भरने के नियमन पर हाल की रिपोर्टों से सेल प्रवास 7,8 के विनियमन के कई रास्ते की खोज की अनुमति, घाव बंद phenotype पर ध्यान केंद्रित किया है. के विश्लेषण के साथफ्लोरोसेंट घाव संवाददाताओं से, हमारे अध्ययन एपिडर्मल घाव inducible जीन 9 की स्थानीयकृत अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक जीन का एक उपन्यास सेट की पहचान की है. घाव प्रतिक्रिया संवाददाता विधि की खूबियों में से एक परिणाम संकेतों पड़ोसी कोशिकाओं को चोट की साइट से transduced रहे हैं, एक तंत्र में और अधिक जानकारी प्रदान करता है. हालांकि, घाव प्रतिक्रिया संवाददाता विधि का दोष का एक परिणाम सीधे घाव भरने या मरम्मत में phenotypes से लिंक नहीं है. आनुवंशिक और रासायनिक स्क्रीन में साफ घाव पंचर प्रोटोकॉल का व्यापक उपयोग ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया की नई नियामकों की पहचान की जा घायल हो गए एपिडर्मल और चोट के उपचार के स्तनधारी मॉडल में घाव भरने की खोजों का अनुवाद करने के लिए आगे की अनुमति देगा.
बाह्य संकेत के लिए एक तत्काल विनियामक प्रतिक्रिया कोशिकाओं तनाव, क्षति, या संक्रमण शामिल कर सकते हैं जो बाह्य उत्तेजनाओं को एक स्थानीय प्रतिक्रिया, समन्वय करने के लिए अनुमति देता है. एक स्थानीय प्रतिक्रिया के अनुचित नियंत्रण चोट की मरम्मत के लिए हानिकारक पड़ोसी कोशिकाओं पर प्रभाव है, साथ ही संसाधनों की बर्बादी हो सकती है. ड्रोसोफिला भ्रूण एक सस्ता और आसान करने के लिए बनाए रखने के जीव मॉडल में बुनियादी घाव भरने के प्रयोगों का संचालन करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली प्रदान करता है. अन्य मॉडल जीवों में अनुसंधान और ड्रोसोफिला के बीच सहयोग के लिए संभावित कई जैविक सवालों का पता लगाने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है.
घाव पत्रकारों की एक और तकनीक एपिडर्मल घाव प्रतिक्रिया मार्ग के सक्रियण के लिए नए जीनों का योगदान परीक्षण के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करने, उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि के आनुवंशिक संयोजन है. हम एपिडर्मल घाव प्रेरित ट्रांसक्रिप्शनल संवाददाताओं av है2 एन डी और 3 गुणसूत्रों 5 दोनों पर ailable. इस अध्ययन में हम यूएएस और overexpression 16 GAL4 सिस्टम का उपयोग करें. घातक उत्परिवर्ती alleles के साथ पढ़ाई के लिए हम एक फ्लोरोसेंट balancer गुणसूत्र, जैसे Kruppel-GFP 17 का उपयोग आनुवंशिक पृष्ठभूमि का निर्धारण. हम कई आनुवंशिक पृष्ठभूमि (Table1) में घाव संवाददाता स्थानीयकरण का विश्लेषण किया है.
तकनीक का एक संभावित संशोधन microinjection और लोग घायल हो गए गठबंधन है. Microinjection भ्रूण में एक रासायनिक घोल को पेश करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कई रासायनिक यौगिकों का परीक्षण किया गया है और epidermal घाव संवाददाताओं से 9 की गतिविधि को विनियमित करने के लिए पाए गए. एक साथ लोग घायल हो गए और microinjection का यह तरीका एक घाव संकेत जवाब और सीधे 18 लोग घायल हो गए के बाद जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि ड्रोसोफिला भ्रूण में कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि करने के लिए उपयोगी हो सकता है. Microinjection तकनीक का भविष्य आवेदन एपिडर्मल घाव प्रतिक्रिया के नियमन के लिए उपन्यास रसायनों का परीक्षण किया जाएगा.
आनुवंशिक अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में ड्रोसोफिला कुशलता से जटिल सवालों का पता करने के लिए सरल प्रोटोकॉल की एक विस्तृत श्रृंखला उपलब्ध कराता है. ड्रोसोफिला तकनीक की व्यवहार्यता पर हाल की रिपोर्टों से आगे ड्रोसोफिला अनुसंधान समुदाय के प्रभाव को व्यापक बनाने के लिए एक साधन के रूप में hemocyte माइग्रेशन 19 और परजीवी ततैया संक्रमण 20 के उपयोग पर प्रकाश डाला गया. घाव की मरम्मत के अध्ययन के अलावा, ड्रोसोफिला imaginal डिस्क सिस्टम 21,22 साथ उत्थान के लिए एक शास्त्रीय मॉडल उपलब्ध कराता है. imaginal डिस्क उत्थान अध्ययन और पंचर / microinjection लोग घायल हो गए में संयुक्त अग्रिम ऊतकों की मरम्मत के साथ अच्छी तरह से संरक्षित घटकों को खोजने के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली प्रदान करता है.
The authors have nothing to disclose.
इस प्रोटोकॉल McGinnis लैब, किम ए गदा और यूसुफ सी. पियर्सन के पिछले सदस्यों के सहयोग से विकसित किया गया है. हम मूल्यवान कंपनियों के शेयरों को संगठित करने और वितरित करने के लिए अपने काम के लिए ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक केंद्र द्वारा जारी प्रयासों धन्यवाद. इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (R01 GM077197 और K12 GM68524) और हर्बर्ट स्टर्न के परिवार से धन के द्वारा समर्थित किया गया. MTJ वर्तमान में अल्पसंख्यक स्वास्थ्य और स्वास्थ्य असमानताओं पर राष्ट्रीय संस्थान से अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केन्द्र और अनुदान संख्या 8G12MD7603 -27 से अनुदान संख्या 5G12RR003060-26 के द्वारा समर्थित है. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और जरूरी अल्पसंख्यक स्वास्थ्य और स्वास्थ्य असमानताओं या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान पर राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.
yeast | Sigma Aldrich | 51475 | |
apple juice | Generic | ||
agar | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
bleach | Generic | ||
halocarbon oil, 700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
halocarbon oil, 27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
1-phenoxy-2-propanol | Sigma Aldrich | 484423 | |
hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H324 | |
methyl-β-cyclodextrin | Sigma Aldrich | C4555 | |
toluidine blue | Sigma Aldrich | 89640 | |
formaldehyde, 16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | toxic chemical |
heptane | Fisher Scientific | H360-1 | toxic chemical |
methanol | Fisher Scientific | A412-1 | toxic chemical |
10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
RNase free H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
Drosophila incubator | Genessee Scientific | 59-197 | |
fly cage | Genessee Scientific | 59-100 | |
embryo collection tube | Genessee Scientific | 46-101 | |
plastic Petri dish | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
double-stick tape | Generic | ||
paintbrush | Generic | ||
dissection needle | Fisher Scientific | 08-965A | sharp object |
glass cover slip | Thermo Scientific | 3306 | sharp object |
microscope slide | Thermo Scientific | 4445 | sharp object |
dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
capillary needle | FHC | 30-30-1 | sharp object |
needle puller | Narishige | PC10 | |
microinjection needle holder | Narishige | MINJ4 | |
micromanipulator | Narishige | MN151 | |
inverted microscope | Carl Zeiss | Primo-Vert | |
glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | sharp object |
glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 22-063-172 | sharp object |
transfer bulb | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | sharp object |
orbital shaker | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
laser scanning confocal | Leica | SP2 | |
fixation solution | (5 ml) | ||
16% formaldehyde | 2.5 ml | toxic chemical | |
10x PBS | 0.5 ml | ||
0.5 M EGTA | 0.5 ml | ||
RNase free H2O | 1.5 ml | ||
Halocarbon oil mix | (10 ml) | ||
halocarbon oil, 700 W | 5 ml | ||
halocarbon oil, 27 W | 5 ml |