아주 늦은 단계 Drosophila의 배아의 배아 표피 빠른 찔린 상처의 응답 분석을위한 생체 시스템을 제공하고, 포유 동물 모델로 번역 상처 치료에 대한 연구를 진행하기 위하여 유전자 조작 물질 또는 화학 물질 미세 주입 치료와 결합 될 수있다.
초파리 배아 모두 거친 외부 환경으로부터 내부의 세포를 보호 할뿐만 아니라, 세포의 항상성을 유지하는 역할을 강력한 표피층을 개발한다. 유리 바늘 구멍 부상 생활 배아 또는 유충의 지역화 기자 신호에 의해 시각하실 수 있습니다 상처 전사 기자가 활성화 빠른 표피 상처 반응을 일으킬 수있는 직접적인 방법을 제공합니다. 구멍을 뚫거나 레이저 부상은 상처 사이트에 혈구 세포의 채용을 촉진 신호를 제공한다. 놀랍게도, 최종 단계의 배아에서 심각한 (철저히) 빵꾸 부상은 거의 같은 부상 배아의 90 % 이상이 배아가 펑크 사이트에서 체액 즉시 누출을 최소화하는 오일 매체에 주입 할 때 성년 생존과 정상적인 배아 발달을 방해하지 . 상처 절차는 AG에 태아의 수동 정렬을 포함하여 초파리 배아의 미세 조작을 필요로하지AR 플레이트와 슬라이드를 현미경 정렬 된 배아의 전송. 초파리 표피 상처 반응 분석은 상처 치유뿐만 아니라 상처 치유를 촉진 잠재적 인 화합물을 선별하는 방법을 촉진 생물학적 기능의 다양한 유전 적 요건을 테스트하는 퀵 시스템을 제공한다. 짧은 수명주기 쉬운 배양 루틴이 초파리 강력한 모델 생물합니다. 초파리 깨끗한 상처 치유 규제 보존 찾을 수있는 훌륭한 시스템을 제공 아직 조사를 받고있다 방법으로, 타고난 면역 반응으로, 표피 재생 응답을 조정하기 위해 나타납니다 초파리와 포유 동물의 표피 상처를 입기에 공통 메커니즘.
미세 주입 기술을 이용하여 초파리 배아의 조작은 잘 확립 된 분석 1. 표피 상처 응답 리포터 방법의 중요성은 형광 기자와 펑크 / 미세 주입을위한 프로토콜을 결합하고 Drosophila의 배아 표피 손상에 생체 반응을 시각화하는 것입니다. 이 방법의 목적은 표피 천자 부상으로 전사 반응을 조절하는 과정을 조사하기위한 도구로서 초파리를 사용하는 과학자의 광범위한 세트를 사용하는 것이다. 초파리의 단일 층 표피는 펑크 부상이 후 표피 상처의 반응을 연구 할 수있는 간단한 시스템을 제공합니다. Drosophila의 배아는 유전자 상처 반응, 염증, 및 재 상피화 3 등의 상처 보수의 단계를 해부에 대한 강력한 모델 시스템입니다. 많은 또는 대부분의 접합체 돌연변이 embryogenes의 단부에 생존 때문 부분에과 발달 패턴 뿌리깊은 틀려서 경우에도 표피 장벽을 개발한다. GRH-표적 유전자 아미노산의 일종 탈 카르복시 화 효소 (DDC)과 티로신 수산화 효소 (PLE)을 전사적으로 부상 (4)의 사이트를 중심으로 활성화됩니다. 확인 잘 보존 전사 인자 거친 헤드 (GRH), 이전 특성 초파리 상처 대응을위한 모델 생물로 포유 동물의 상처 치유 5에서 연구를 진행하는 조사의 보완 라인을 제공합니다. 후속 연구는 추가 초파리 상처 유발 유전자를 발견하고 6 명이 부상 청소 생체 표피 상처의 반응을 모니터링하는 많은 형광 상처 기자의 "키트"를 개발했다. 초파리 상처 치유의 규제에 관한 최근의 보고서는 세포 이동을 규제 7,8 많은 경로의 검색을 허용 상처 봉합 표현형에 초점을 맞추고있다. 의 분석형광 상처 기자는, 우리의 연구는 표피 상처 유도 유전자 (9)의 지역화 식에 필요한 유전자의 새로운 세트를 발견했습니다. 상처 응답 리포터 방법의 장점 중 하나는 결과 신호가 인접 셀에 부상의 사이트에서 형질 도입하는 방법의 메커니즘에 대한 추가 통찰력을 제공한다는 것이다. 그러나, 상처 응답 리포터 방법의 단점 중 하나는 결과 직접 상처 치유 또는 수리 표현형을 링크하지 않는다는 것이다. 유전 및 화학 화면의 깨끗한 상처 천자 프로토콜의 광범위한 사용은 전사 반응의 새로운 규제 식별 할 부상 표피 및 부상 치료의 포유 동물 모델로 상처 치유 발견의 번역을 증진 할 수 있습니다.
외부 신호에 즉시 전사 조절 반응은 세포가 스트레스, 손상 또는 감염을 포함 할 수있다 세포 자극에 대한 지역화 된 응답을 조정 할 수 있습니다. 지역화 된 응답의 부적절한 조절은 손상을 복구하는 손상 이웃 세포에 대한 영향뿐만 아니라 자원의 낭비가있을 수 있습니다. Drosophila의 배아는 저렴하고 유지 관리가 쉬운 모델 생물의 기본적인 상처 치유 실험을 수행 할 수있는 훌륭한 시스템을 제공합니다. 다른 모델 생물의 연구와 초파리 사이의 협력의 가능성은 많은 생물 학적 질문을 탐험 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다.
상처 기자의 추가적인 기술은 표피 상처 반응 경로의 활성화에 새로운 유전자의 포스팅을 테스트하기위한 효율적인 방법을 제공하는 돌연변이의 유전 적 배경을 조합이다. 우리는 표피 상처에 의한 전사 기자 AV가2 차 및 3 차 염색체 5 모두 ailable. 이 연구에서 우리는 UAS 및 과발현 (16)의 GAL4 시스템을 사용합니다. 치명적인 돌연변이 대립 형질을 가진 연구를 위해 우리는 형광 균형 염색체, 예를 들어 크 룹펠-GFP (17)를 사용하여 유전 적 배경을 결정합니다. 우리는 여러 가지 유전 적 배경 (표 1)에 상처 기자 현지화를 분석 하였다.
기술의 가능한 변형은 미세 주입 및 상처를 입기를 결합하는 것입니다. 마이크로 인젝션은 배아에 약액을 도입하는데 사용될 수있다. 몇몇 화합물은 화학적 검사를 마친 표피 상처 기자 9의 활성을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 동시 상흔 및 마이크로 인젝션이 방법은 상처 신호를 직접 반응 (18)을 부상 후 유전자 발현의 변화를 모니터링하는데 사용될 수 초파리 배아 세포의 수를 증가하는 것이 유용 할 수있다. 미세 주입 기술의 미래 응용 프로그램은 표피 상처 반응의 조절에 대한 새로운 화학 물질을 테스트하는 것입니다.
유전자 연구를위한 모델 시스템으로 초파리 효율적으로 복잡한 문제를 해결하기 위해 간단한 프로토콜의 넓은 범위를 제공합니다. 초파리 기법의 타당성에 대한 최근의보고는 더욱 초파리 연구계의 영향 범위를 확장하기위한 수단으로서 혈구 이주 (19)과 기생 말벌 감염 (20)의 사용을 강조한다. 상처 수리 연구뿐만 아니라, 초파리, 상상 디스크 시스템 (21, 22)와 재생을위한 고전적인 모델을 제공합니다. 가상적인 디스크 재생 연구와 펑크 / 마이크로 인젝션 남긴 상처의 결합 발전은 조직 복구의 잘 보존 된 구성 요소를 발견 할 수있는 훌륭한 시스템을 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 프로토콜은 McGinnis 연구소, 김 A. 메이스와 조셉 C. 피어슨의 이전 멤버와 공동으로 개발되었습니다. 우리는 가치있는 주식을 정리하고 배포 할 수있는 자신의 작품에 대한 블루밍턴 초파리 증권 센터의 지속적인 노력에 감사드립니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소 (R01 GM077197 및 K12 GM68524)과 허버트 스턴의 가족에서 자금에 의해 지원되었다. MTJ는 현재 소수 민족 건강과 건강 불균형에있는 국립 연구소의 연구 자원을위한 국립 센터와 그랜트 번호 8G12MD7603-27에서 부여 번호 5G12RR003060-26에 의해 지원됩니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 소수 민족 건강과 건강 격차 또는 건강의 국립 연구소에있는 국립 연구소의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
yeast | Sigma Aldrich | 51475 | |
apple juice | Generic | ||
agar | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
bleach | Generic | ||
halocarbon oil, 700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
halocarbon oil, 27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
1-phenoxy-2-propanol | Sigma Aldrich | 484423 | |
hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H324 | |
methyl-β-cyclodextrin | Sigma Aldrich | C4555 | |
toluidine blue | Sigma Aldrich | 89640 | |
formaldehyde, 16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | toxic chemical |
heptane | Fisher Scientific | H360-1 | toxic chemical |
methanol | Fisher Scientific | A412-1 | toxic chemical |
10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
RNase free H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
Drosophila incubator | Genessee Scientific | 59-197 | |
fly cage | Genessee Scientific | 59-100 | |
embryo collection tube | Genessee Scientific | 46-101 | |
plastic Petri dish | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
double-stick tape | Generic | ||
paintbrush | Generic | ||
dissection needle | Fisher Scientific | 08-965A | sharp object |
glass cover slip | Thermo Scientific | 3306 | sharp object |
microscope slide | Thermo Scientific | 4445 | sharp object |
dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
capillary needle | FHC | 30-30-1 | sharp object |
needle puller | Narishige | PC10 | |
microinjection needle holder | Narishige | MINJ4 | |
micromanipulator | Narishige | MN151 | |
inverted microscope | Carl Zeiss | Primo-Vert | |
glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | sharp object |
glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 22-063-172 | sharp object |
transfer bulb | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | sharp object |
orbital shaker | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
laser scanning confocal | Leica | SP2 | |
fixation solution | (5 ml) | ||
16% formaldehyde | 2.5 ml | toxic chemical | |
10x PBS | 0.5 ml | ||
0.5 M EGTA | 0.5 ml | ||
RNase free H2O | 1.5 ml | ||
Halocarbon oil mix | (10 ml) | ||
halocarbon oil, 700 W | 5 ml | ||
halocarbon oil, 27 W | 5 ml |