De embryonale epidermis av svært sent stadium Drosophila embryoer gir en in vivo system for rask punktering sår responsanalyse, og kan kombineres med genetiske manipulasjoner eller kjemiske mikroinjeksjon behandlinger for å fremme studier i sårheling for oversettelse til pattedyr modeller.
Den Drosophila embryo utvikler en robust epidermal lag som tjener både til å beskytte de interne celler fra en hard ytre miljø, så vel som å opprettholde cellulær homeostase. Stikkskade med glass nåler gir en direkte metode for å utløse en rask epidermal sår respons som aktiverer sår transkripsjons journalister, som kan visualiseres ved en lokalisert reporter signal i levende embryoer eller larver. Punktering eller laser skade gir også signaler som fremmer rekruttering av hemocytes til sårstedet. Overraskende, alvorlig (tvers igjennom) stikkskade i sent stadium embryoer bare sjelden forstyrrer normal embryoutvikling, som er større enn 90% av slike sårede embryo overlever til voksen alder når embryoer injiseres i et olje medium som minimerer umiddelbar lekkasje av hemolymph fra injeksjonssteder . Såret prosedyren krever micromanipulation av Drosophila embryoer, inkludert manuell justering av embryoene på agar plater og overføring av de sammenstilte embryoer til objektglass. Den Drosophila epidermal såret respons-analyse gir et raskt system for å teste de genetiske krav i en rekke biologiske funksjoner som fremmer sårheling, så vel som en metode for screening av potensielle kjemiske forbindelser som fremmer sårheling. Den korte livssyklus og enkel dyrking rutine gjør Drosophila en kraftig modell organisme. Drosophila ren sårtilheling ser ut til å koordinere epidermal regenerativ respons, med den medfødte immunforsvaret, på måter som er fortsatt under etterforskning, som gir et utmerket system for å finne bevart regulatoriske mekanismer som er felles for Drosophila og pattedyr epidermal såret.
Manipulering av Drosophila embryoer ved hjelp av en mikroinjeksjon teknikken er en veletablert analysen en. Betydningen av den epidermale sår respons reporter metode er å kombinere den protokoll for punktering / mikroinjeksjon med fluorescerende reportere og visualisere en in vivo respons til epidermal skade i Drosophila embryo. Målet med denne metoden er å muliggjøre et bredere sett av forskere å bruke Drosophila som et verktøy for å undersøke de prosesser som regulerer transkripsjons respons på epidermal stikkskade. Singelen lag epidermis i Drosophila gir et enkelt system for å studere en epidermal såret respons etter stikkskade to. Den Drosophila embryo er et robust modellsystem for å genetisk dissekere stadier av sår reparasjon, inklusive såret respons, inflammasjon og reepithelialization 3.. Dette er delvis fordi mange eller de fleste Zygotic mutanter overleve til slutten av embryogeneser og utvikle epidermal barrierer selv når utviklings mønster går dypt forkjært. Forrige karakterisering av en godt bevart transkripsjonsfaktor Kornete hode (grh), identifisert som grh-målgener dopa decarboxylase (DDC) og tyrosin hydroksylase (ple) er transcriptionally aktiveres rundt områdene av skader 4. Drosophila som modellorganisme for sår respons gir et utfyllende linje med etterforskning for å fremme studier i pattedyr sårtilheling fem. Senere studier har identifisert flere Drosophila sår-indusert gener og utviklet en "verktøykasse" av mange fluorescerende såret journalister for å overvåke in vivo epidermal såret respons for å rense såret seks. Nyere rapporter om regulering av Drosophila sårtilheling har fokusert på såret nedleggelse fenotype, slik at oppdagelsen av mange veier som regulerer celle migrasjon 7,8. Ved analyse avfluorescerende såret journalister, har våre studier identifisert en roman sett av gener som kreves for den lokaliserte uttrykk for epidermal sår-induserbare gener 9. En av fordelene ved såret respons reporter metoden er at resultatene gir mer innsikt i en mekanisme for hvordan signalene omformet fra skadestedet til nabocellene. Imidlertid er en av de demerits av såret respons reporter metode som resultatene ikke koble direkte til fenotyper i sårheling eller reparasjon. Bredere bruk av rene sår punktering protokollen i genetiske og kjemiske skjermer vil tillate nye regulatorer av transkripsjons respons på epidermal såret for å bli identifisert og videre oversettelse av sårtilheling funn i pattedyr modeller av skadebehandlinger.
En umiddelbar transkripsjonen regulatorisk respons på eksterne signaler gjør det mulig for cellene å koordinere en lokal respons på ekstracellulære stimuli, noe som kan inkluderer stress, skade eller infeksjon. Den feilaktige kontroll over en lokalisert respons kan ha skadelige effekter på nabocellene, samt en sløsing med ressurser til å reparere skaden. Drosophila embryo gir et utmerket system for å gjennomføre grunnleggende sårheling eksperimenter i en billig og enkel å vedlikeholde modellorganisme. Potensialet for samarbeid mellom forskning i andre modellorganismer og Drosophila gir en unik mulighet til å utforske mange biologiske spørsmål.
En annen teknikk for såret reportere er det genetiske kombinasjon av mutante bakgrunn, og gir en effektiv metode for testing av bidraget av nye gener til aktivering av den epidermale sår respons pathway. Vi har epidermal sår-indusert transkripsjons reportere en vailable på både 2. og 3. kromosomer fem. I denne studien bruker vi UAS og Gal4 systemer av overekspresjon 16. For studier med dødelige mutant alleler bestemmer vi den genetiske bakgrunnen ved hjelp av et fluorescerende balanserer kromosom, f.eks Kruppel-GFP 17. Vi har analysert såret reporter lokalisering i flere genetiske bakgrunn (Tabell 1).
En mulig modifikasjon av den teknikk er å kombinere mikroinjeksjon og såret. Mikroinjeksjon kan brukes for å innføre en kjemisk løsning i embryo. Mange kjemiske forbindelser er blitt testet og ble funnet å regulere aktiviteten av de epidermale sår reportere 9. Denne metode for simultan såret, og mikroinjeksjon kan være nyttig for å øke antall celler i Drosophila embryo som reagere et sår signal og kan direkte brukes til å overvåke endringer i genekspresjon etter at såret 18. En fremtidig anvendelse av mikroinjeksjon teknikken vil være å teste nye kjemikalier for regulering av den epidermale sår respons.
Drosophila som et modellsystem for genetiske studier tilbyr et bredt utvalg av enkle protokoller for å effektivt håndtere komplekse spørsmål. Nylige rapporter om gjennomførbarheten av Drosophila teknikker høydepunkter bruk av hemocyte migrasjon 19 og parasittiske veps infeksjon 20 som et middel for å ytterligere utvide virkningen av Drosophila forskningsmiljøet. I tillegg til sår reparasjon studier, gir Drosophila en klassisk modell for regenerering med imaginal plate system 21,22. De kombinerte fremskritt i imaginal plate regenerering studier og punktering / mikroinjeksjon såret gir et utmerket system for å oppdage godt bevarte deler av vev reparasjon.
The authors have nothing to disclose.
Denne protokollen er utviklet i samarbeid med tidligere medlemmer av McGinnis Lab, Kim A. Mace og Joseph C. Pearson. Vi takker de fortsatt innsats fra Bloomington Drosophila Stock Center for sitt arbeid for å organisere og distribuere verdifulle aksjer. Dette arbeidet ble støttet av midler fra National Institutes of Health (R01 GM077197 og K12 GM68524) og familien til Herbert Stern. MTJ støttes av Grant Antall 5G12RR003060-26 fra National Center for Research Resources og Grant Antall 8G12MD7603-27 fra National Institute on minoritetshelse og helseforskjeller. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis de offisielle visningene av National Institute on minoritetshelse og helseforskjeller eller National Institutes of Health.
yeast | Sigma Aldrich | 51475 | |
apple juice | Generic | ||
agar | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
bleach | Generic | ||
halocarbon oil, 700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
halocarbon oil, 27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
1-phenoxy-2-propanol | Sigma Aldrich | 484423 | |
hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H324 | |
methyl-β-cyclodextrin | Sigma Aldrich | C4555 | |
toluidine blue | Sigma Aldrich | 89640 | |
formaldehyde, 16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | toxic chemical |
heptane | Fisher Scientific | H360-1 | toxic chemical |
methanol | Fisher Scientific | A412-1 | toxic chemical |
10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
RNase free H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
Drosophila incubator | Genessee Scientific | 59-197 | |
fly cage | Genessee Scientific | 59-100 | |
embryo collection tube | Genessee Scientific | 46-101 | |
plastic Petri dish | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
double-stick tape | Generic | ||
paintbrush | Generic | ||
dissection needle | Fisher Scientific | 08-965A | sharp object |
glass cover slip | Thermo Scientific | 3306 | sharp object |
microscope slide | Thermo Scientific | 4445 | sharp object |
dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
capillary needle | FHC | 30-30-1 | sharp object |
needle puller | Narishige | PC10 | |
microinjection needle holder | Narishige | MINJ4 | |
micromanipulator | Narishige | MN151 | |
inverted microscope | Carl Zeiss | Primo-Vert | |
glass Petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | sharp object |
glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 22-063-172 | sharp object |
transfer bulb | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666A | |
scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | sharp object |
orbital shaker | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
1.5 ml tube | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
laser scanning confocal | Leica | SP2 | |
fixation solution | (5 ml) | ||
16% formaldehyde | 2.5 ml | toxic chemical | |
10x PBS | 0.5 ml | ||
0.5 M EGTA | 0.5 ml | ||
RNase free H2O | 1.5 ml | ||
Halocarbon oil mix | (10 ml) | ||
halocarbon oil, 700 W | 5 ml | ||
halocarbon oil, 27 W | 5 ml |