Murino Cervical Modelo de coração Transplante usando uma técnica Cuff Modificado

Summary

O modelo de transplante de coração de murídeo cervical é bem adequado para imunológico, bem como estudos de lesão de reperfusão de isquemia. Nós modificamos o procedimento usando uma técnica cuff não sutura e realizou mais de 1.000 transplantes de sucesso com essa abordagem.

Aqui, nós fornecemos mais detalhes desta técnica para complementar o vídeo.

Abstract

Modelos de mouse são de especial interesse na pesquisa desde uma grande variedade de anticorpos monoclonais e comercialmente definido pura e linhagens knockout estão disponíveis para executar mecanicista estudos in vivo. Enquanto os modelos de transplante cardíaco usando uma técnica de sutura foram primeiro desenvolvido com sucesso em ratos, a tradução para o equivalente murino usado igualmente difundida nunca foi alcançado devido à complexidade técnica de um procedimento neurocirúrgico. Em contraste, as técnicas não-sutura do manguito, também desenvolvido inicialmente em ratos, foram adaptados com sucesso para uso em camundongos ^1-3. Esta técnica de revascularização envolve duas etapas principais I) evertendo o navio beneficiário durante um manguito de polietileno; II) puxando o navio dador sobre o navio beneficiário anteriormente revirado e segurando-o no lugar com uma ligação periférica. Isso garante a continuidade da camada endotelial, tempo de operação de curto e altas taxas de permeabilidade ^4.

t "> Usando esta técnica para a anastomose vascular que realizou mais de 1.000 transplantes de coração do colo do útero com uma taxa de sucesso global de 95%. Para arterial fluxo da artéria carótida comum e do arco aórtico proximal foram anastomosadas resultando em uma perfusão retrógrada do coração transplantado. Para a drenagem venosa a artéria pulmonar do enxerto anastomose com a veia jugular externa do recipiente ^5.

Aqui, nós fornecemos mais detalhes desta técnica para complementar o vídeo.

Introduction

O transplante cardíaco representa a terapia de escolha para pacientes que sofrem de diferentes doenças cardíacas em estágio terminal. Os avanços nas técnicas cirúrgicas, a profilaxia mais eficaz de infecções, e novos regimes imunossupressores resultou em acentuada melhoria do resultado do transplante de órgãos ^6. No entanto, a sobrevida do enxerto a longo prazo não melhorou rigorosamente ao longo dos últimos anos, ^7. A rejeição crônica, caracterizada pela arteriosclerose transplante continua a ser um grande obstáculo para a sobrevivência do enxerto a longo prazo ^8-11.

O modelo de transplante cardíaco heterotópico em ratos fornece uma ferramenta importante e válida para análise de mecanismo imunológico durante aguda, bem como a rejeição crônica ^12-15.

Até o momento o modelo de transplante mais comum ainda é o transplante cardíaco rato abdominal utilizando a técnica de sutura. A aorta ascendente do coração do doador é anastomosada à umaaorta bdominal ea artéria pulmonar é anastomosada à veia cava inferior do receptor. Muitas das dificuldades microcirúrgico da sutura modelo baseia-se no pequeno tamanho dos vasos, os quais são suturados ^16,17.

Em contraste com o modelo de sutura é colocado no centro da região do pescoço do recipiente, onde a veia jugular externa é anastomosado para a artéria pulmonar e a artéria carótida comum a aorta do doador.

A lógica do desenvolvimento do modelo de transplante de coração cervicais utilizando a técnica do manguito ter um modelo animal, o que permite a obtenção de elevadas taxas de sucesso com técnicas de microcirurgia básicas que permitem uma ampla aplicação deste modelo. As principais vantagens desse método são o significativamente menos anastomose ocorrem complicações como hemorragias e trombose relacionada quando comparado com o modelo de sutura ^18.

Protocol

Os animais são alojados em uma instalação livre de patógenos barreira. Todos os animais recebem cuidados humanos, em conformidade com os "Princípios de Laboratório Animal Care" formuladas pela Sociedade Nacional de Pesquisa Médica "e do" Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório ", elaborado pela Academia Nacional de Ciências e publicados pela National Institutes of Health (NIH Publication 86-23 não., revista, 1985). Todos os experimentos foram aprovados pelo Ministério da Educação, Ciência e Cultura da Áustria.

1. Destinatário Preparação

1. Anestesiar o animal receptor com uma injecção intramuscular de xilazina (5 mg / kg de peso corporal) e cetamina (100 mg / kg de peso corporal).
2. Remover todo o cabelo da região cervical lateral do animal e esfregar o campo operatório três vezes usando chlorhexdine.
3. Posicione o mouse em decúbito dorsal sobre o campo operatório.
4. Em seguida, faça uma incisão na pele do inc jugularisão à mandíbula inferior direito.
5. Posteriormente, sem rodeios mobilizar a veia jugular externa direita (EJV) e dividir os ramos entre ligaduras.
6. Em seguida, dividir o EJV entre ligaduras certificando-se de deixar o comprimento suficiente para everter o coto proximal sobre o corpo cuff.
7. Em seguida remover o lóbulo direito da glândula submandibular.
8. Para a anastomose venosa passar a extremidade proximal do balonete EJV através do polietileno e fixá-lo na pega do punho com uma micro pinça.
9. Remover a ligadura no final do navio, everter o lúmen através da braçadeira e fixá-lo com um laço de seda 8-0 (Figura 1a).
10. Posteriormente transecto o músculo esternocleidomastóideo direito com cautério bipolar para ter acesso à artéria carótida comum.
11. Próximo mobilizar a artéria carótida comum e cortar o vaso entre as ligaduras.
12. Próximo mobilizar a artéria carótida comum e cortar o vaso entre as ligaduras.
13. Passe as distal fim do navio através do manguito e corrigi-lo com a braçadeira artéria.
14. Remover a ligadura no final do navio e distender o lúmen usando dilatadores vasculares. Em seguida, por analogia com o EJV, eversão da artéria sobre o balonete e fixá-lo com um laço de seda 8-0.

Procurement 2 Coração

1. Anestesiar o ratinho dador com uma injecção intramuscular de xilazina (5 mg / kg de peso corporal) e cetamina (100 mg / kg de peso corporal). Em seguida, retire todos os pêlos da região abdominal do animal. Esfregue a agente de campo três vezes usando chlorhexdine. Em seguida coloque o mouse em decúbito dorsal sobre o campo operatório, como descrito anteriormente.
2. Após uma incisão abdominal na linha média, retrair as vísceras com cotonetes para a esquerda a fim de expor a veia cava inferior (VCI).
3. Injectar 400 ul de uma solução a 1: 4 sódio-heparina para a VCI para heparinização.
4. Realize uma toracotomia e dobrar a parede anterior do tórax sobre cranial para ganhar access para o coração.
5. Em seguida, retirar o timo e fazem incisões na ventilação a veia cava superior direita e esquerda.
6. Posteriormente, aspergir o coração de uma forma retrógrada, com 4 ° Celsius solução HTK por punção do arco aórtico com uma seringa G 27 ao nível do tronco braquiocefálico.
7. Ligadura da veia cava inferior e superior com 8-0 seda e dividi-los distalmente às ligaduras.
8. Próximo dividir o arco da aorta ao nível da canulação anterior e dissecar livre do tronco pulmonar e dividi-lo tanto quanto possível distalmente.
9. Em seguida, amarre as veias pulmonares com uma ligadura em massa e dividi-los distalmente às ligaduras.
10. Por fim, retire o coração da área doadora e armazená-lo em solução Celsius HTK 4 ° (Figura 1b).

3. Implantação

1. Coloque o enxerto cardíaco na região beneficiária pescoço em uma posição de cabeça para baixo (Figura 1c
2. Em seguida puxe o tronco pulmonar do coração sobre a construção manguito veia do receptor e corrigi-lo com um laço de seda (Figura 1d).
3. Realize a anastomose entre a aorta do enxerto ea artéria revirada do animal destinatário da mesma forma (Figura 1e).
4. Subsequentemente, remover o grampo venoso em primeiro lugar, seguido pelo grampo arterial. O coração é reperfundido e começa a bater dentro de 1-2 min. Durante reperfusão umedecer o coração com água morna (35 ° C) soro fisiológico.
5. Finalmente fechar a ferida cirúrgica com 6-0 contínuos (Figura 1E).

4 Cuidados Pós-Operatórios, Endpoint

1. Dá até 0,3 ml ip de solução salina normal no pós-operatório para a reposição de líquidos.
2. Colocar o animal sob uma lâmpada de calor até acordar da anestesia.
3. Uma vez acordado, devolver o animal para a instalação de alojamento onde recebem comida e água ad libitum.
4. Para mimizar a dor durante os primeiros 7 dias de pós-operatório administrar carprofeno (4 mg / kg a cada 12 horas por via subcutânea (sc). Além disso, dar buprenorfina (0,1 mg / kg), logo após a operação de cada 12 horas durante 5 dias.
5. Obter o peso (g) de cada destinatário animais semanalmente para avaliar a ingestão nutricional adequada. Se houver evidência de mais de 10-15% de perda de peso em relação ao peso no momento da cirurgia, data, apatia paralisante ou uma volta muito torto, sacrificar o animal usando inalação isoflurano terminais antes de chegar ao ponto final clínico. Também sacrificar o animal depois que o coração foi rejeitada.

Representative Results

A Figura 2 mostra os dados de sobrevivência representativas de aloenxertos cardíacos de doadores BALB / c após o transplante em plena MHC incompatíveis C57BL / 6 destinatários. Corações são rejeitados no dia 7 ± 1 após o transplante. Dedo palpação do enxerto transplantado é um método sensível para detectar o campo dependente do tempo de rejeição do enxerto. Todos os transplantes de coração sing�icas realizados em nossa série sobreviveu por tempo indeterminado (> 150 dias).

Figura 1: fotos intra-operatórias (a) campo operatório durante a preparação do destinatário (b) enxerto cardíaco após a colheita (c) O enxerto coração colocado na região do pescoço do destinatário em posição invertida (d + e) O local de doação prévia.... da implantação. (f) Diagrama esquemático doenteustrating o navio beneficiário, o navio dador e do manguito

Figura 2: sobrevivência de aloenxerto cardíaco. Kaplan-Meier para exibir a sobrevivência de aloenxertos cardíacos de ratos BALB / c depois de enxerto em receptores MHC BL6 totalmente incompatíveis (n = 7; tempo médio de sobrevivência de 7 dias), bem como um grupo de controlo singeneico (n = 7; sobrevivência do enxerto > 150 dias). O dia de rejeição foi definido como o dia da cessação do batimento cardíaco.

Discussion

Rejeição de enxertos vascularizados implica uma infinidade de passos diferentes que só podem ser insuficientemente avaliados utilizando modelos in vitro. Fenómenos como a sensibilização de receptores, processamento de antigénios em órgãos linfóides secundários, mas também a diferenciação e proliferação de células imunocompetentes são melhor caracterizados in vivo. Os modelos animais são, assim, a ferramenta ideal para a investigação translacional ^16. Modelos de mouse ainda representam o padrão ouro no transplante de pesquisa básica e imunológica desde uma ampla gama de camundongos transgênicos e knockout gene estão disponíveis, e um grande número de ferramentas imunológicas e de diagnóstico foram desenvolvidos exclusivamente para ratos ^18. O modelo de transplante cardíaco cervical murino oferece uma ferramenta única para solucionar dúvidas e realizar estudos sobre os mecanismos relacionados com a lesão de reperfusão de isquemia, imunossupressão, rejeição aguda e crônica e indução de tolerância ^{1-3, 17, 22.}

O modelo de transplante cardíaco do mouse abdominal usando uma técnica de sutura foi primeiramente descrita por Corry et al., Em 1973, ^19. Desafios técnicos associados com a anastomose suture- de pequenos vasos, no entanto, limitado o seu uso generalizado.

Em 1991, Matsuura et al. Introduzido o modelo de transplante de coração cervical, utilizando uma técnica não-manguito sutura em ratos ^16. Desde a sua introdução em Zimmerman et al., E Kamada e Calne "a técnica manguito" tem sido utilizado para anastomoses microvasculares em vários modelos diferentes de murino de transplante de órgãos ^20-22.

Nós desenvolvemos uma técnica cuff não sutura modificado para revascularização e ter completado mais de 1.000 transplantes de sucesso nos últimos anos, com taxas de sucesso> 95%. Foram utilizadas várias combinações de tensão diferentes e os regimes de tratamento. A aplicação da técnica descrita elere, o tempo total de operação pode ser reduzido para cerca de 45 min. É importante salientar o tempo total de isquemia pode ser mantida a 20 min com um tempo de implantação de menos de 7 minutos, o qual, em contraste é geralmente mais de 15 min quando se utiliza a técnica de sutura ^23. Em comparação com o modelo de transplante de coração abdominal do rato, o transplante cardíaco cervical tem várias vantagens, tais como o stress pós-operatório menor e alta taxa de sucesso da cirurgia. O batimento do enxerto cardíaco pode ser facilmente monitorado devido à posição superficial. Complicações associadas à anastomose, incluindo hemorragia e trombose são significativamente menos comum quando se utiliza a técnica de manguito ^18.

As seguintes modificações desta técnica proposta por nosso grupo levou a uma taxa de sucesso melhorada e uma redução drástica do tempo de operação:

• Use a perfusão retrógrada através do arco aórtico com 3 ml de solução HTK.
• Mantenha o coração úmido utilizando HTK solbuição durante o procedimento de colheita de todo.
• Não dissecar e ligadura seletiva da veia cava superior esquerda.
• Use as micro grampos para ocluir os vasos, mas, mais importante, também para corrigir as algemas.
• Use dilatadores vasculares com pontas superfino para distender a artéria carótida comum, que faz com que seja muito mais fácil de eversão do vaso através da braçadeira.
• Não coloque segurando suturas como originais descritas por Matsuura et al.
• Para a anastomose arterial usar uma braçadeira com um diâmetro interno de 0,5 mm e um diâmetro externo de 0,63 mm, para a anastomose venosa uma braçadeira com um diâmetro interno de 0,75 mm e um diâmetro exterior de 0,94 milímetros.
• Use punhos com um comprimento de 2 mm, incluindo uma pega 1 mm, o que serve para a sua fixação adequada para o recipiente, utilizando uma pinça vascular.

Uma limitação de que este método possa é que pode ser difícil de obter punhos apropriados. Nós, portanto, utilizados comercialmente disponível ppunhos olyethylene de RIVERTECH médica (Chattanooga, TN).

Tiro principal problema durante o procedimento foram os seguintes.

Desordem fluxo sanguíneo: coração do doador Lave até que a cor se torna de cor branca. Lave sem muita pressão como danos excessivos de pressão do enxerto.

• Dificuldade para everter o navio sobre o manguito: Verificar se a embarcação é (a) de comprimento suficiente, (b) livre de gordura em anexo e tecidos conjuntivos e (c) certificar-se de que o navio estava bem distendido, usando dilatadores vasculares.
• Sangramento no local da anastomose: use cotonetes para aplicar pressão no local afetado por cerca de 5 min.
• Obstrução do fluxo sanguíneo venoso: Principalmente causado pela torção da veia jugular durante os processos de colocação de manguito. Remover o punho braçadeira no local venoso.
• Torção enxerto e estrangulamento: Certifique-se de que o enxerto é colocado corretamente no lado do doador antes do fechamento da pele.

in vivo relacionados com a imunologia do transplante. Nossa abordagem modificada permite alcançar altas taxas de sucesso com técnicas de microcirurgia básicos que permitirão uma ampla aplicação deste modelo. Este vídeo tem como objetivo ajudar e orientar outras pesquisas para estabelecer o modelo em seus laboratórios.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yasargil Clip Mini Permanent 7 mm	Aesculap	FE720K
Micro vessel clip	S & T	B1 00396 V
Microscissor	FST	14075-11
Vesseldilatator	S & T	D-5a.2 00125
Microforceps	FST	Dumont 11271- 30
Clipapplicator	S & T	CAF-4 00072
Microvessel clip	S & T	B1 00396 V