Summary
El modelo de trasplante de corazón murino de cuello uterino es muy adecuado para inmunológica así como estudios de la lesión de reperfusión de isquemia. Hemos modificado el procedimiento utilizando una técnica de manguito no sutura y realizado más de 1.000 trasplantes de éxito con este enfoque.
En esto, proporcionamos detalles adicionales de esta técnica para complementar el vídeo.
Abstract
Los modelos de ratón son de especial interés en la investigación desde una amplia variedad de anticuerpos monoclonales y comercialmente definen endogámica y las cepas knockout están disponibles para llevar a cabo mecanicista en estudios in vivo. Mientras que los modelos de trasplante de corazón utilizando una técnica de sutura se desarrolló por primera vez con éxito en ratas, la traducción a un equivalente murino utilizado igualmente generalizada nunca se logró debido a la complejidad técnica del procedimiento de microcirugía. En contraste, las técnicas del manguito no sutura, también desarrolladas inicialmente en ratas, se adaptaron con éxito para su uso en ratones de 1-3. Esta técnica de revascularización implica dos pasos principales I) eversión del buque receptor sobre un manguito de polietileno; II) tirando del buque cedente sobre el buque receptor antes evertido y manteniéndolo en su lugar con un empate circunferencial. Esto asegura una continuidad de la capa endotelial, tiempo de funcionamiento corto y muy altas tasas de permeabilidad 4.
t "> Utilización de esta técnica para la anastomosis vascular que lleva a cabo más de 1.000 trasplantes de corazón cervicales con una tasa de éxito del 95%. Para arterial flujo de la arteria carótida común y el arco aórtico proximal se anastomosa dando como resultado una perfusión retrógrada del corazón trasplantado. Para el drenaje venoso de la arteria pulmonar del injerto se anastomosa con la vena yugular externa del receptor 5.En esto, proporcionamos detalles adicionales de esta técnica para complementar el vídeo.
Introduction
El trasplante cardíaco representa el tratamiento de elección para los pacientes que sufren de diferentes enfermedades cardíaca terminal. Los avances en las técnicas quirúrgicas, la profilaxis más eficaz de las infecciones y nuevas pautas de inmunosupresión como resultado notablemente mejorada resultado del trasplante de órganos 6. Sin embargo, la supervivencia del injerto a largo plazo no ha mejorado rigurosamente en los últimos años 7. El rechazo crónico, que se caracteriza por la arteriosclerosis de trasplante sigue siendo un obstáculo importante para la supervivencia del injerto a largo plazo 8-11.
El modelo de trasplante heterotópico de corazón en ratones proporciona una herramienta importante y válido para el análisis de mecanismo inmunológico durante aguda, así como el rechazo crónico 12-15.
Hasta la fecha el modelo de trasplante más frecuente sigue siendo el abdominal trasplante de corazón de ratón utilizando la técnica de sutura. La aorta ascendente del corazón del donante se anastomosa a la unabdominal aorta y la arteria pulmonar se anastomosa a la vena cava inferior del receptor. Gran parte de la dificultad microquirúrgica del modelo de sutura se basa en el pequeño tamaño de los vasos, que se suturan 16,17.
En contraste con el modelo de sutura el corazón se coloca en la región del cuello del recipiente donde la vena yugular externa se anastomosa a la arteria pulmonar y la arteria carótida común la aorta del donante.
La razón de ser del desarrollo del modelo de trasplante de corazón cervical utilizando la técnica del manguito era tener un modelo animal, que permite lograr altas tasas de éxito con las habilidades básicas de microcirugía que permitirán una amplia aplicación de este modelo. Las principales ventajas de este método son la anastomosis se producen significativamente menos complicaciones tales como hemorragias y trombosis relacionada en comparación con el modelo de sutura 18.
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Protocol
Los animales se alojan en un centro sin barreras patógeno. Todos los animales reciben atención humana en el cumplimiento de los "Principios de Cuidado de Animales de Laboratorio" formuladas por la Sociedad Nacional para la Investigación Médica "y la" Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio ", elaborado por la Academia Nacional de Ciencias y publicados por la National Institutos de Salud (NIH Publication no. 86-23, revisado 1985). Todos los experimentos son aprobados por el Ministerio de Educación, Ciencia y Cultura de Austria.
1. destinatario Preparación
- Anestesiar al animal receptor con una inyección im de xilazina (5 mg / kg de peso corporal) y ketamina (100 mg / kg de peso corporal).
- Quite todo el pelo de la región cervical lateral del animal y fregar el campo operatorio tres veces usando chlorhexdine.
- Coloque el ratón en una posición supina en el campo operatorio.
- Siguiente hacer una incisión en la piel del inc yugularisión de la mandíbula inferior derecha.
- Posteriormente, sin rodeos movilizar la vena yugular externa derecha (VYE) y dividir las ramas entre ligaduras.
- Luego divida la VYE entre ligaduras asegurándose de dejar suficiente longitud para eversión del muñón proximal sobre el cuerpo del manguito.
- A continuación, retire el lóbulo derecho de la glándula submandibular.
- Para la anastomosis venosa pasar el extremo proximal de la VYE a través del manguito de polietileno y fijarlo en el mango del manguito con una abrazadera micro.
- Retire la ligadura en el extremo de la embarcación, eversión de la luz sobre el manguito y fijarla con un 8-0 lazo de seda (Figura 1a).
- Posteriormente seccionar el músculo esternocleidomastoideo derecha con cauterio bipolar para obtener acceso a la arteria carótida común.
- Siguiente movilizar la arteria carótida común y cortar el vaso entre las ligaduras.
- Siguiente movilizar la arteria carótida común y cortar el vaso entre las ligaduras.
- Pase los disTal extremo del recipiente a través del manguito y fijarlo con la abrazadera arteria.
- Retire la ligadura en el extremo del recipiente y distender el lumen usando dilatadores vasculares. A continuación, en analogía con el VYE, eversión de la arteria en el manguito y fijarla con un lazo de seda 8-0.
Contratación 2. Corazón
- Anestesiar el ratón donante con una inyección im de xilazina (5 mg / kg de peso corporal) y ketamina (100 mg / kg de peso corporal). A continuación, retire todo el pelo de la región abdominal del animal. Frote el operativo de campo tres veces usando chlorhexdine. Siguiente lugar el ratón en una posición supina en el campo quirúrgico como se describió previamente.
- Después de una incisión abdominal en la línea media, retraiga las vísceras con Q-tips a la izquierda con el fin de exponer la vena cava inferior (VCI).
- Inyectar 400 l de una mezcla 1: 4 heparina solución de sodio en el IVC para la heparinización.
- Lleve a cabo una toracotomía y doblar la pared anterior del tórax sobre craneal para ganar access al corazón.
- A continuación, retire el timo y hacer venteo incisiones en la vena cava superior izquierda y la derecha.
- Posteriormente, perfundir el corazón de una manera retrógrada con solución de 4 ° Celsius HTK por canulación del arco aórtico con una G jeringa 27 en el nivel de la rama braquiocefálico.
- Ligar la vena cava inferior y superior con 8-0 seda y dividirlos distal a las ligaduras.
- Siguiente dividir el arco aórtico en el nivel de la canulación anterior y diseccionar libre del tronco pulmonar y se divide distalmente en la medida de lo posible.
- Después de eso, atar las venas pulmonares con una ligadura en bloque y dividirlos distal a las ligaduras.
- Por último, quite el corazón de la zona donante y almacenarlo en 4 ° centígrados solución HTK (Figura 1b).
3. Implantación
- Coloque el injerto de corazón en la región del cuello destinatario en una posición al revés (Figura 1c
- Siguiente tirar del tronco pulmonar del corazón sobre la construcción del manguito vena del receptor y fijarlo con un lazo de seda (Figura 1d).
- Realizar la anastomosis entre la aorta del injerto y la arteria evertido del animal receptor de la misma manera (Figura 1e).
- Posteriormente, retire la pinza venosa primero, seguido por la pinza arterial. El corazón está reperfunde y comienza a latir dentro de 1-2 min. Durante la reperfusión humedecer el corazón con agua tibia (35 ° Celsius) solución salina.
- Por último cerrar la herida quirúrgica con 6-0 suturas continuas (Figura 1e).
4. Cuidado posoperatorio, punto final
- Dé hasta 0,3 ml ip salina normal después de la operación para la reposición de líquidos.
- Colocar el animal bajo una lámpara de calor hasta que despierta de la anestesia.
- Una vez despierto, devolver el animal a la instalación de la vivienda donde reciben alimentos y agua ad libitum.
- Para midolor de quitar importancia durante los primeros 7 días del postoperatorio administrar carprofeno (4 mg / kg por vía subcutánea cada 12 horas (sc). Además, dará buprenorfina (0,1 mg / kg) después de la operación cada 12 horas durante 5 días.
- Obtener el peso (g) de cada destinatario de los animales semanalmente para evaluar la ingesta nutricional apropiada. Si hay evidencia de pérdida de peso más de un 10-15% en comparación con el peso en la cirugía fecha, la apatía, la paralizante o una espalda muy doblada, sacrificar al animal mediante la inhalación de isoflurano terminal antes de llegar al punto final clínico. También sacrificar al animal después de que el corazón ha sido rechazada.
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Representative Results
La Figura 2 muestra los datos de supervivencia de los aloinjertos cardiacos representativos de donantes BALB / c después del trasplante en MHC totalmente coincidentes C57BL / 6 destinatarios. Los corazones son rechazados en el día 7 ± 1 después del trasplante. Palpación del dedo del aloinjerto trasplantado es un método sensible para detectar el curso dependiente del tiempo del rechazo de aloinjertos. Todos los trasplantes de corazón singeneicos realizadas en nuestra serie sobrevivieron indefinidamente (> 150 días).
Figura 1: imágenes intraoperatorias (a) Campo operatorio durante la preparación del receptor (b) del injerto cardiaco después de la contratación (c) El injerto cardíaco colocado en la región del cuello destinatario en una posición invertida (d + e) La zona donante antes.... de la implantación. (f) Diagrama esquemático enfermoustrating el buque receptor, el buque cedente y el manguito
Figura 2: la supervivencia del aloinjerto cardíaco. Kaplan-Meier que muestra la supervivencia de aloinjerto cardíaco de los ratones BALB / c después del injerto en receptores MHC-BL6 totalmente no coincidentes (n = 7; tiempo medio de supervivencia = 7 días), así como un grupo de control singénico (n = 7; la supervivencia del injerto > 150 días). El día de rechazo se definió como el día de cese de los latidos del corazón.
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Discussion
El rechazo de aloinjertos vascularizados implica una gran cantidad de diferentes medidas que sólo pueden evaluarse suficientemente utilizando modelos in vitro. Fenómenos como la sensibilización de los receptores, el procesamiento de antígenos en los órganos linfoides secundarios, sino también la diferenciación y proliferación de células inmunocompetentes son mejor caracterizados in vivo. Los modelos animales son de esta manera la herramienta ideal para la investigación traslacional 16. Los modelos de ratón todavía representan el estándar de oro en el trasplante de la investigación básica y inmunológica ya que una amplia gama de ratones transgénicos y knockout de genes están disponibles, y un gran número de herramientas inmunológicas y de diagnóstico se han desarrollado exclusivamente para los ratones 18. El modelo de trasplante de corazón murino cervical ofrece una herramienta única para hacer frente a las preguntas y realizar estudios sobre los mecanismos relacionados con la lesión por isquemia reperfusión, la inmunosupresión, el rechazo agudo y crónico y la tolerancia de la inducción 1-3, 17, 22.
El modelo de trasplante de corazón de ratón abdominal utilizando una técnica de sutura fue descrita por primera vez por Corry et al. En 1973 19. Retos técnicos asociados con la anastomosis suture- de vasos pequeños, sin embargo, limitado su uso generalizado.
En 1991, Matsuura et al. Introdujo el modelo de trasplante de corazón cervical utilizando una técnica de manguito no sutura en ratones 16. Desde su introducción por Zimmerman et al., Y Kamada y Calne "la técnica de puño" se ha utilizado para la anastomosis microvasculares en varios diferentes modelos murinos de trasplante de órganos 20-22.
Hemos desarrollado una técnica de manguito no sutura modificada de revascularización y han completado más de 1.000 trasplantes exitosos de los últimos años, con tasas de éxito> 95%. Se utilizaron varias combinaciones de cepas diferentes y regímenes de tratamiento. La aplicación de la técnica descrita sere, el tiempo total de la operación puede ser reducida a aproximadamente 45 min. Es importante destacar que el tiempo total de isquemia se puede mantener a 20 min con un tiempo de implantación de menos de 7 min, que en contraste es por lo general más de 15 min cuando se utiliza la técnica de sutura 23. En comparación con el modelo de trasplante de corazón abdominal del ratón, trasplante de corazón cervical tiene varias ventajas, tales como el estrés postoperatorio menor y alta tasa de éxito quirúrgico. El latido del corazón de injerto puede ser fácilmente monitorizado debido a la posición superficial. Las complicaciones asociadas con anastomosis de sutura, incluyendo hemorragia y trombosis son significativamente menos común cuando se utiliza la técnica del manguito 18.
Las siguientes modificaciones de esta técnica propuesta por nuestro grupo llevó a una tasa de éxito mejorada y una reducción drástica del tiempo de operación:
- Utilice una perfusión retrógrada a través del arco aórtico con 3 ml de solución HTK.
- Mantenga el corazón húmedo utilizando HTK sollución durante todo el procedimiento de cosecha.
- No diseccionar y ligar selectiva de la vena cava superior izquierda.
- Utilice las abrazaderas micro para ocluir los vasos, pero, sobre todo, también para fijar los puños.
- Utilice dilatadores vasculares con puntas extrafinas para dilatar la arteria carótida común, que hace que sea mucho más fácil de eversión del buque sobre el manguito.
- No coloque la celebración de suturas tan originales descritos por Matsuura et al.
- Para la anastomosis arterial utilizar un manguito con un diámetro interior de 0,5 mm y un diámetro exterior de 0,63 mm, para la anastomosis venosa un manguito con un diámetro interior de 0,75 mm y un diámetro exterior de 0,94 mm.
- Utilice puños con una longitud de 2 mm que incluye un mango 1 mm que sirve para su fijación correcta al recipiente, utilizando una pinza vascular.
Una limitación que este método podría tener es que puede ser difícil de obtener manguitos apropiados. Por ello, utilizó p disponible comercialmentepuños olyethylene de Rivertech médica (Chattanooga, TN).
Solución de problemas principal durante el procedimiento fueron los siguientes.
Trastorno de flujo de sangre: Flush corazón del donante hasta que el color se vuelve de color blanco. Flush sin demasiada presión como daños de presión excesiva del injerto.
- Dificultad para eversión del buque en el manguito: Cerciorarse de que el buque se encuentre (a) de longitud suficiente, (b) libre de grasa adherida y los tejidos conectivos y (c) asegurarse de que el barco estaba bien distendido, usando dilatadores vasculares.
- Sangrado en el sitio de la anastomosis: use Q-tips para aplicar presión a la zona afectada durante aproximadamente 5 minutos.
- Obstrucción del flujo de sangre venosa: Principalmente causada por la torsión de la vena yugular durante los procesos de colocación del manguito. Retire la manija puño en el sitio venosa.
- Torsión del injerto y la estrangulación: Asegúrese de que el injerto se coloca correctamente en el lado de los donantes antes del cierre de la piel.
in vivo los estudios relacionados con la inmunología del trasplante. Nuestro enfoque modificado permite alcanzar altos índices de éxito con las habilidades básicas de microcirugía que permitirán una amplia aplicación de este modelo. Este video tiene como objetivo ayudar y orientar otras investigaciones para establecer el modelo en sus laboratorios.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yasargil Clip Mini Permanent 7 mm | Aesculap | FE720K | |
| Micro vessel clip | S & T | B1 00396 V | |
| Microscissor | FST | 14075-11 | |
| Vesseldilatator | S & T | D-5a.2 00125 | |
| Microforceps | FST | Dumont 11271- 30 | |
| Clipapplicator | S & T | CAF-4 00072 | |
| Microvessel clip | S & T | B1 00396 V |
References
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