Summary
Sıçangil modeli servikal kalp nakli immünolojik hem de iskemi reperfüzyon yaralanması çalışmasından için uygundur. Biz olmayan bir dikiş manşet tekniği kullanılarak prosedür değiştirilmiş ve bu yaklaşım ile 1.000 'den fazla başarılı nakli gerçekleştirildi.
Burada, videoyu tamamlamak için bu tekniğin ek ayrıntıları.
Abstract
Fare model monoklonal antikorların çeşitli beri araştırılmaktadır özel ilgi ve ticari olarak doğuştan tanımlandığı gibidir ve boşaltma suşları in vivo çalışmalar mekanik gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bir dikiş tekniği kullanılarak kalp nakli modeller ilk kez başarıyla sıçanlarda geliştirilen iken, aynı derecede yaygın kullanılan kemirgen eşdeğer içine çeviri mikrocerrahi işlemin teknik karmaşıklığı nedeniyle elde değildi. Buna karşılık olarak, aynı zamanda, farelerde geliştirilmişken olmayan dikiş manşet teknikleri, farelerde başarılı bir şekilde 1-3 kullanılmak üzere adapte edilmiştir. Revaskülarizasyon için bu teknik bir polietilen manşet alıcı gemiyi tersine çevrilmesi iki önemli adım I) içerir; II) eski everte alıcı geminin üzerinde donör gemiyi çekerek ve çevresel bir kravat ile yerde tutuyor. Bu endotel tabakası, kısa çalışma süresi ve çok yüksek açıklık oranlarının 4 bir sürekliliğini sağlar.
t "> vasküler anastomoz için bu tekniği kullanarak biz karotis arter girişi arteriyel için.% 95 genel başarı oranı ile 1.000 'den fazla servikal kalp nakli gerçekleştirilen ve proksimal aort arkı nakledilen kalbin bir retrograd perfüzyon sonuçlanan anastomoz edildi. venöz drenaj için greft pulmoner arter alıcının 5 eksternal juguler ven ile anastomoz edildi.Burada, videoyu tamamlamak için bu tekniğin ek ayrıntıları.
Introduction
Kalp transplantasyonu farklı son dönem kalp hastalıklardan muzdarip hastalar için tercih tedaviyi temsil eder. Cerrahi tekniklerin, enfeksiyonların daha etkili profilaksi, ve yeni immunsupresif rejimler ilerlemeler organ nakli 6 belirgin geliştirilmiş sonucunu sonuçlandı. Ancak, uzun dönem greft sağkalım son yıllarda üzerinde 7 titizlikle geliştirilmiş değil. Nakli damar sertliği ile karakterize kronik rejeksiyon, uzun dönem greft sağkalım 8-11 önemli bir engel olmaya devam etmektedir.
Farelerde heterotopik kalp nakli modeli akut dönemde immünolojik mekanizma analizi için önemli ve geçerli bir araç yanı sıra kronik rejeksiyon 12-15 sağlar.
Bugüne kadar en sık nakli modeli dikiş tekniği kullanılarak karın fare kalp nakli hala. Donör kalbin çıkan aort a anastomoz edilirbdominal aort ve pulmoner arter alıcının vena kava anastomoz edilir. Sütür modelin mikrocerrahi zorluk çoğu 16,17 dikilir gemilerin, küçük boyutuna bağlıdır.
Dikiş modelinin aksine kalp eksternal juguler ven pulmoner arter ve karotis arter donörün aort anastomoz edilir alıcının boyun bölgesinde yerleştirilir.
Manşet tekniği kullanılarak servikal kalp nakli modelinin gelişim mantığı bu modelin geniş uygulamasını sağlayacak temel mikrocerrahi becerileri ile yüksek başarı oranları elde sağlayan bir hayvan modeli, sahip oldu. Bu yöntemin önemli bir avantajı dikiş modeli 18 ile karşılaştırıldığında kanama ve tromboz gibi komplikasyonları ile ilgili önemli ölçüde daha az meydana anastomoz bulunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlar, bariyer patojenden ari bir yere yerleştirilmiştir. Bütün hayvanlar Ulusal tarafından Tıbbi Araştırmalar Ulusal Derneği "ve" Ulusal Bilimler Akademisi tarafından hazırlanan Laboratuvar Hayvanları "Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna tarafından formüle yayınlanan" Laboratuar Hayvan Bakımı Esasları "uyarınca insan bakım almak Sağlık Enstitüleri (NIH Yayın yok. 86-23, 1985 revize). Tüm deneyler Eğitim, Bilim ve Kültür Avusturya Maliye Bakanlığı tarafından onaylanır.
1. Alıcı Hazırlık
- Xylazine (5 mg / kg vücut ağırlığı) ve ketamin (100 mg / kg vücut ağırlığı) bir İM enjeksiyonu ile alıcı hayvan anestezisi.
- Hayvanın yan servikal bölgedeki tüm saç çıkarın ve operatif field chlorhexdine kullanarak üç kez fırçalayın.
- Operatif sahada yatar pozisyonda fare yerleştirin.
- Sonraki boyun inc bir cilt kesi yapmaksağ alt çeneye izyonu.
- Daha sonra, açık açık, sağ eksternal juguler ven (EJV) harekete geçirmek ve ligatürlerin arasındaki dalları bölmek.
- Sonra manşet vücut üzerinde proksimal güdük tersine çevrilmesi için yeterli uzunlukta bırakın emin ligatures arasındaki EJV bölmek.
- Sonraki submandibular bezin sağ lobunu çıkarın.
- Venöz anastomoz için polietilen manşet aracılığıyla EJV proksimal ucunu geçmek ve bir mikro kelepçe ile manşet sapına bunu düzeltmek.
- , Geminin sonunda ligatürün çıkarın manşet lümen tersine çevrilmesi ve 8-0 ipek döngü (Şekil 1a) ile sabitleyin.
- Ardından karotis arter erişmek için bipolar koter ile sağ SKM kas transect.
- Sonraki karotis arter harekete geçirmek ve bitişik harfler arasındaki gemi kesti.
- Sonraki karotis arter harekete geçirmek ve bitişik harfler arasındaki gemi kesti.
- Dis geçmektal manşet yoluyla geminin sonu ve arter kelepçe ile sabitleyin.
- Teknenin sonunda bitişik harfleri çıkarın ve vasküler dilatatörler kullanılarak gerilmek lümeni. Sonraki, EJV benzer şekilde, manşet arter ters çevrilecek ve 8-0 ipek döngü ile sabitleyin.
2. Kalp İhale
- Xylazine (5 mg / kg vücut ağırlığı) ve ketamin (100 mg / kg vücut ağırlığı) bir İM enjeksiyonu ile verici fare anestezisi. Daha sonra hayvanın karın bölgesi tüm tüylerden. Chlorhexdine kullanarak ameliyat alan üç kez fırçalamaktadır. Operatif alanın üzerine sırt üstü yatırıldı fare daha önce anlatıldığı gibi sonraki bir yer.
- Bir orta hat karın kesi ardından, inferior vena kava (IVC) ortaya çıkarmak için sola Q-ipuçları iç organları geri çekin.
- Heparinizasyon için IVC içine 4 heparin- natriyumhidroksid çözümü: 1 400 ul enjekte edilir.
- Acc kazanmak için cranially üzerinde ön göğüs duvarına bir torakotomi gerçekleştirin ve katkalbe ess.
- Sonraki, timus çıkarın ve sol ve sağ superior vena kava kesiler havalandırma yapmak.
- Daha sonra, brakiosefalik şube düzeyinde bir 27 G şırınga ile aort arkı kanül ile 4 ° Celsius HTK solüsyonu ile retrograd kalp serpmek.
- 8-0 ipek ile alt ve üst vena kava bağlanır ve bitişik harfler distal onları bölmek.
- Sonraki önceki kanül seviyesinde aort arkı bölmek ve pulmoner gövde serbest incelemek ve mümkün olduğunca distale bölmek.
- Bunun ardından, bir yığın ligasyonu ile pulmoner venlerin kravat ve bitişik harfler distal onları bölmek.
- Son olarak, donör sitesinden kalp çıkarın ve 4 ° Celsius HTK solüsyonu (Şekil 1b) saklayın.
3. İmplantasyon
- Bir baş aşağı konumda alıcı boyun bölgesinde kalp greft yerleştirin (Şekil 1c
- Sonraki alıcının ven manşet yapı üzerinde kalp akciğer gövde çekin ve bir ipek döngü (Şekil 1d) ile sabitleyin.
- Greft aorta ve aynı moda (Şekil 1e) olarak alıcı hayvanın everte arter arasındaki anastomoz gerçekleştirin.
- Daha sonra, arteryel kelepçe ardından ilk venöz kelepçe, kaldırın. Kalp reperfuzyona ve 1-2 dakika içinde yenerek başlar. Reperfüzyon sırasında sıcak (35 ° C) tuzlu su ile kalp nemlendirin.
- Son olarak, sürekli 6-0 dikişler (Şekil 1e) ile cerrahi yara kapatın.
4. Ameliyat Sonrası Bakım, Endpoint
- Sıvı replasmanı için postoperatif 0.3 ml normal tuzlu ip vazgeçtim.
- Anesteziden awaking kadar bir ısı lambası altında hayvan yerleştirin.
- Uyanık, onlar yiyecek ve suya serbestçe ulaşabilir barınak ortamına dönüş hayvan.
- MIilk 7 gün boyunca ameliyat sonrası ağrı durumuna küçült Karprofen (4 mg / kg her 12 saatte subkutan (sc), tatbik. Ek olarak, 5 gün süre ile hemen işleminden sonra) Buprenorphin her 12 saat (0.1 mg / kg sağlar.
- Doğru besin alımını değerlendirmek için her alıcı hayvan haftalık ağırlığını (g) edinin. Daha fazla% 10-15 kilo kaybı bulgusu cerrahi, güncel, ilgisizlik, sakatlayıcı veya çok bükülmüş arka ağırlığına kıyasla varsa, klinik bitiş noktasına ulaşmadan önce, terminal izofluran inhalasyon kullanmadan hayvan kurban. Kalp reddedildi sonra da hayvan kurban.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2 tam MHC uyumsuz C57BL / 6 alıcılarının içine naklinden sonra BALB / c vericilerden kalp allogreftlerinin temsili sağkalım verileri gösterir. Kalpler nakli sonrası günde 7 ± 1 reddedilir. Nakledilen allogreftin parmak palpasyonu allogreft reddinin zamana bağlı ders tespit etmek için hassas bir yöntemdir. Dizimizin yapılan tüm singenik kalp nakilleri süresiz atlattı (> 150 gün).
Şekil 1: İntraoperatif resim alıcı hazırlanması sırasında (a) Operatif alan ihale sonrası (b) Kalp greft (c) başaşağı pozisyonda alıcı boyun bölgesinde yerleştirilen kalp greft (d + e) öncesinde donör sitesi.... implantasyonu. (f) hasta şemasıAlıcı gemi, donör gemi ve manşeti ustrating
Şekil 2: Kardiyak allogreft hayatta kalma. Tam MHC- uyumsuz BL6 alıcıları içerisine aşılanması sonrası, BALB / c farelerinden kardiyak allogreftlerin yaşam süresini gösteren Kaplan-Meier alanı (n = 7; ortalama sağkalım süresi = 7 gün) ve de bir genetik olarak özdeş kontrol grubu (n = 7; aşı yaşamda kalması > 150 gün). Reddedilme gün kalp atışının bırakma günü olarak tanımlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vaskülarize allogreft reddi sadece yetersiz m vitro modeller kullanılarak değerlendirilebilir farklı adımları bir bolluk gerektirir. Alıcıların sensitizasyon, antijen işleme ikincil lenfoid organlarda değil, aynı zamanda, bağışıklık yetkin hücrelerin farklılaşması ve proliferasyonu gibi in vivo fenomen daha iyi karakterize edilmiş bulunmaktadır. Hayvan modelleri böylece translasyonel araştırma 16 için ideal bir araçtır. Fare modelleri hala transgenik ve gen nakavt fareler, çünkü geniş bir temel nakli ve immünolojik araştırmada altın standardı temsil mevcuttur ve immünolojik ve tanı araçları çok sayıda fareler 18 için özel olarak geliştirilmiştir. Kemirgen servikal kalp nakli modeli soruları ve iskemi reperfüzyon hasarı, immünsupresyonun, akut ve kronik rejeksiyon ve toleransın 1-3, 17, 22 ile ilgili mekanik çalışmalar yapmak için benzersiz bir araç sunar.
Bir sütür tekniği kullanılarak fare karın kalp nakli modeli ilk Corry ve arkadaşları tarafından tarif edilmiştir. 1973 19. Küçük damarların suture- anastomoz ile ilgili teknik zorluklar, ancak, onun yaygın kullanımı sınırlıdır.
1991 yılında, Matsuura ve ark. Farelerde 16 olmayan bir dikiş manşet tekniği kullanılarak servikal kalp nakli modeli sundu. Zimmerman ve ark. Ve Kamada ve Calne "manşon tekniğiyle" tarafından tanıtılmasından bu yana, organ nakli 20-22 arasında çeşitli kemirgen modellerinde Mikrovasküler anastomoz için kullanılmıştır.
Biz>% 95 başarı oranları ile revaskülarizasyon için modifiye olmayan sütür manşet tekniği geliştirdik ve son birkaç yıl içinde 1.000 'den fazla başarılı nakli tamamlandı. Birçok farklı gerilme kombinasyonlar ve tedavi rejimleri kullanılmıştır. Tekniği uygulayarak he tarifre, toplam çalışma süresi yaklaşık olarak 45 dakika için düşürülebilir. Önemli olarak, toplam iskemi süresi 23 dikiş tekniği kullanırken rağmen genellikle en fazla 15 dakikadır 7 dakikadan daha az, bir implantasyon süresi 20 dakika ile tutulabilir. Fare karın kalp nakli model ile kıyaslandığında, servikal kalp nakli gibi küçük ameliyat sonrası stres ve yüksek cerrahi başarı oranı gibi çeşitli avantajları vardır. Kalp greft dövülmesi kolayca yüzeysel konumu nedeni izlenebilir. Manşet tekniği 18 kullanırken sütür anastomoz, dahil, kanama ve tromboz ile ilişkili komplikasyonlar daha az yaygındır.
Grubumuzun geliştirilmiş bir başarı oranı ve çalışma süresi dramatik bir azalmaya yol açtı tarafından önerilen bu tekniğin aşağıdaki değişiklikler:
- 3 mi HTK çözeltisi ile aort kavisi ile retrograd perfüzyon kullanın.
- HTK sol kullanımı nemli kalp tutunBütün işlem sırasında hasat Katkı.
- Sol superior vena kava incelemek ve seçici ligatı etmeyin.
- Manşet düzeltmek için de önemlisi, damarları tıkamak ama mikro kelepçeleri kullanın.
- Çok daha kolay manşet gemiyi ters çevrileceği için yapar karotis arter gerilmek için ince ipuçları ile vasküler dilatatörler kullanın.
- Matsuura ve diğ orijinal gibi sütür tutarak koymayın.
- Arteryel anastomoz için 0.75 mm iç çap ve 0.94 mm'lik bir dış çapa sahip venöz anastomoz için, 0.5 mm iç çap ve 0.63 mm arasında bir dış çapa sahip bir manşet bir dikiş kullanır.
- Bir damar kelepçesi kullanılarak, tekneye onun uygun tespit hizmet eden bir tutamak içerir 1 mm'lik, 2 mm'lik bir uzunluğa sahip manşetleri kullanın.
Bu yöntem olabilir bir sınırlama uygun manşetleri elde etmek zor olabilir olmasıdır. Bu nedenle, ticari olarak temin edilebilen p ikinciTıbbi RIVERTECH (Chattanooga TN) den olyethylene manşetleri.
Aşağıdaki gibi işlem sırasında ana sorun çekim vardı.
Kan akımı bozukluğu: rengi kadar yıkayın donör kalp beyaz renkte olur. Aşırı basınç zararlar gibi çok fazla baskı greft olmadan yıkayın.
- Zorluk manşet gemi tersine çevrilmesi için: gemi olduğunu olunmalıdır (a) yeterli uzunlukta, (b) bağlı yağ ve bağ dokuları ve (c) damar damar dilatatörler kullanarak, iyi distandü emin bir serbest.
- Anastomoz yerinde kanama: yaklaşık 5 dakika boyunca etkilenen yerinde baskı uygulamak için Q-ipuçlarını kullanın.
- Venöz kan akımı tıkanma: Temelde manşet yerleştirme işlemleri sırasında şah damarından torsiyonunu neden oldu. Venöz yerinde manşet kolu kaldırın.
- Greft büküm ve boğma: greft önce cilt kapatılması donör tarafına düzgün yerleştirildiğinden emin olun.
in vivo herhangi bir mekanik için altın standart olmaya devam etmektedir. Bizim modifiye yaklaşım, bu modelin geniş uygulamasını sağlayacak temel mikrocerrahi becerileri ile yüksek başarı oranları elde sağlar. Bu video yardımcı olmak ve onların laboratuarlarında modelini kurmak için diğer araştırmalar rehber olmayı amaçlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yasargil Clip Mini Permanent 7 mm | Aesculap | FE720K | |
| Micro vessel clip | S & T | B1 00396 V | |
| Microscissor | FST | 14075-11 | |
| Vesseldilatator | S & T | D-5a.2 00125 | |
| Microforceps | FST | Dumont 11271- 30 | |
| Clipapplicator | S & T | CAF-4 00072 | |
| Microvessel clip | S & T | B1 00396 V |
References
- Brandacher, G., et al. Tetrahydrobiopterin compounds prolong allograft survival independently of their effect on nitric oxide synthase activity. Transplantation. 81, 583-589 (2006).
- Schneeberger, S., et al. The effect of secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI) on ischemia/reperfusion injury in cardiac transplantation. Am J Transplant. 8, 773-782 (2008).
- Sucher, R., et al. IDO and regulatory T cell support are critical for cytotoxic T lymphocyte-associated Ag-4 Ig-mediated long-term solid organ allograft survival. JImmunol. 188, 37-46 (2012).
- Yamashita, K., et al. Heme oxygenase-1 is essential for and promotes tolerance to transplanted organs. FASEB J. 20, 776-778 (2006).
- Kienzl, K., et al. Proteomic profiling of acute cardiac allograft rejection. Transplantation. 88, 553-560 (2009).
- Aurora, P., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: tenth official pediatric lung and heart/lung transplantation report--2007. J Heart Lung Transplant. 26, 1223-1228 (2007).
- Häyry, P. Chronic allograft vasculopathy new strategies for drug development. Transplant Proc. 30, 3989-3990 (1998).
- Hosenpud, J. D. Immune mechanisms of cardiac allograft vasculopathy an update. Transpl Immunol. 1, 237-249 (1993).
- Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
- Kouwenhoven, E. A., de Bruin, R. W., Heemann, U. W., Marquet, R. L., Ijzermans, J. N. Late graft dysfunction after prolonged cold ischemia of the donor kidney inhibition by cyclosporine. Transplantation. 68, 1004-1010 (1999).
- Kouwenhoven, E. A., Ijzermans, J. N., de Bruin, R. W. Etiology and pathophysiology of chronic transplant dysfunction. Transpl Int. 13, 385-401 (2000).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52, 1099-1101 (1991).
- Huang, X., Chen, D., Chen, L. [A modified model of cervical heterotopic cardiac transplantation for chronic rejection research]. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 22, 1508-1510 (2008).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nat Protoc. 2, 471-480 (2007).
- Wang, C. Y., et al. Suppression of murine cardiac allograft arteriopathy by long-term blockade of CD40-CD154 interactions. Circulation. 105, 1609-1614 (2002).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51, 896-898 (1991).
- Tomita, Y., et al. Improved technique of heterotopic cervical heart transplantation in mice. Transplantation. 64, 1598-1601 (1997).
- Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8, 245-249 (2010).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16, 343-350 (1973).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Zimmermann, F. A., et al. Techniques for orthotopic liver transplantation in the rat and some studies of the immunologic responses to fully allogeneic liver grafts. Transplant Proc. 11, 571-577 (1979).
- Maglione, M., et al. Donor pretreatment with tetrahydrobiopterin saves pancreatic isografts from ischemia reperfusion injury in a mouse model. Am J Transplant. 10, 2231-2240 (2010).
- Heron, I. A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats. Actapathologica et microbiologica Scandinavica Section A, Pathology. 79, 366-372 (1971).
